基因修饰骨髓间充质干细胞修复关节软骨损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.06.026

摘要/Abstract

摘要：

背景：随着生物技术的发展，通过转基因技术修饰细胞，从而获得长期稳定表达的生物活性因子以治疗关节软骨损伤逐渐引起重视。
目的：就基因修饰的骨髓间充质干细胞在修复关节软骨损伤中的应用作一综述。
方法：由第一作者检索1990至2011年PubMed数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed)有关基因修饰骨髓间充质干细胞修复关节软骨损伤的文献，英文检索词为“cartilage，gene therapy，mesenchymal stem cells，tissue engineering，bioactive factor，vector”。共纳入15篇文献归纳总结。
结果与结论：骨髓间充质干细胞已被广泛应用于修复关节软骨损伤。通过转基因技术将特定外源基因导入骨髓间充质干细胞，联合细胞治疗和基因治疗可达到更好的治疗效果，在关节软骨损伤的治疗中有广阔的应用前景。

关键词: 干细胞, 干细胞综述, 骨髓, 间充质干细胞, 软骨, 基因治疗, 基因修饰, 组织工程, 生物活性因子, 载体

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells have the potential of self-renewal and multiple differentiations, and can be induced into osteoblasts and chondrocytes under certain conditions, so they have been widely used for articular cartilage repair in recent studies.
OBJECTIVE: To review application of gene-modified bone marrow mesenchymal stem cells in repair of articular cartilage injury.
METHODS: A computer-based online retrieval of PubMed database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed) was performed by the first author to search papers regarding gene-modified bone marrow mesenchymal stem cells for repair of articular cartilage injury using the English key words “cartilage, gene therapy, mesenchymal stem cells, tissue engineering, bioactive factor, vector”. After excluding papers with nonrelated and repetitive contents, 15 papers were suitable for final analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow mesenchymal stem cells have been widely used for repair of articular cartilage injury. Bone marrow mesenchymal stem cells with specific exogenous gene introduced by transgenic technology could acquire better therapeutic effects in treatment of articular cartilage injury.

Key words: stem cells, stem cell review, bone marrow, mesenchymal stem cells, cartilage, gene therapy, gene modification, tissue engineering, biological active factors, vector

中图分类号:

R318

赖建明，林建华. 基因修饰骨髓间充质干细胞修复关节软骨损伤[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(6): 1107-1110.

Lai Jian-ming, Lin Jian-hua. Gene-modified bone marrow mesenchymal stem cells for repair of articular cartilage injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(6): 1107-1110.

图/表（结果） 1

2.1 骨髓间充质干细胞的生物学特性 关节软骨损伤后的修复过程中，内源性生长因子往往难以满足需要，因此需要足量的外源性生长因子来诱导骨髓间充质干细胞分化成熟。通过静脉或局部注射生物活性因子，往往存在作用时间较短、易于稀释或流失、需反复大剂量使用、价格昂贵等缺点，不易推广应用。随着基因治疗概念的扩展，采用基因转染技术修饰骨髓间充质干细胞使外源基因得以长期高效表达，可有效解决上述问题，已被广泛应用于修复关节软骨损伤。

2.2 生物活性因子 转基因技术的优势在于能使有治疗作用的生物活性因子在骨髓间充质干细胞内持续表达，从而促进关节软骨损伤的修复。前提条件是这些生物活性因子要能够诱导和刺激骨髓间充质干细胞增殖、分化、成熟及基质合成，或阻断因软骨损伤所激活的炎症、退变和凋亡途径。

生长因子可通过特定的信号转导通路，诱导骨髓间充质干细胞的增殖和分化，包括成纤维细胞生长因子2、骨形态发生蛋白、胰岛素样生长因子1、转化生长因子β超家族、血小板源性生长因子、甲状旁腺激素相关蛋白以及软骨源性生长因子等^[2]。转录因子可调控细胞分化过程中基因的表达，亦可作为生物活性因子之一，如Sox基因、Cbfa-1基因等^[3-4]，以及信号分子如Wnt基因和Hedgehog基因家族^[5-6]。阻断因软骨损伤所激活的炎症、退变和凋亡途径，可作为治疗策略之一，其目的在于使介导分解代谢反应的细胞因子失活，如白细胞介素1和肿瘤坏死因子。该策略的机制在于抑制基质降解酶(金属蛋白酶)和促炎介质(白细胞介素1受体a、可溶性白细胞介素1受体、可溶性肿瘤坏死因子受体)的活性^[7-9]，以及阻断细胞的死亡程序^[10]，从而达到保护软骨的目的。此外，抑制介导细胞衰老的端粒酶和阻断细胞凋亡途径(bcl-2, bcl-Xl, anti-FasL, anti-p53)以恢复细胞活性^[11-12]，亦可作为软骨损伤的治疗途径之一。

2.3 基因载体系统 基因载体是指能将外源基因导入靶细胞，并使其在靶细胞内表达的病毒或DNA结构，包括非病毒类载体和病毒类载体。成功的基因治疗策略依赖于高效、低毒的载体系统。目前常用的载体系统有如下几种：①非病毒类载体：目前非病毒类载体系统有质粒、多肽类、阳离子脂质体、DNA-配体复合物和基因枪等多种形式。非病毒类载体可避免病毒类载体所具有的获得自主复制能力的风险，可以反复使用，而且制备简单、成本低、无免疫原性。但是非病毒类载体的转染效率常较病毒类载体低，转染后以游离形式存在于目的细胞中，基因持续表达时间较短，在一定程度上限制了其应用。②腺病毒：腺病毒是目前软骨损伤修复中应用较多的基因转移工具之一^[13-15]，可感染多种细胞且具有较高的感染效率，并可直接体内注射。腺病毒感染细胞后，初期可获得高效表达，但由于病毒DNA并不整合到细胞染色体上，随着时间的延长，表达量迅速下降，且腺病毒编码的病毒蛋白可诱导免疫反应，限制了其在基因治疗中的应用。③单纯疱疹病毒：单纯疱疹病毒是带有包膜的双链DNA病毒，可容纳较长的外源基因片段，对已知多种分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。虽然第1代单纯疱疹病毒具有较高细胞毒性，但是最近研究显示第2代单纯疱疹病毒的毒性已减弱，尤其是在软骨修复中。单纯疱疹病毒的主要缺陷是外源基因的表达持续时间较短暂，有细胞毒性和免疫原性。④腺病毒相关病毒：腺病毒相关病毒是无病原性、无复制能力的单链DNA缺陷性病毒，可通过转基因暗盒完全替换病毒基因系列，而产生重组腺相关病毒颗粒，其不编码病毒蛋白，免疫原性较腺病毒弱，毒性较单纯疱疹病毒小。重组腺相关病毒颗粒可感染分裂细胞和非分裂细胞，且感染效率较高。重组腺相关病毒颗粒可长期稳定的游离在宿主细胞中，从而使目的基因得到长期稳定的表达，并可避免插入突变。因此，重组腺相关病毒颗粒在关节软骨损伤的基因治疗中越来越受欢迎，但其容量小，制备过程复杂，成本较高。⑤反转录病毒：其优势在于可将外源基因有效整合到宿主细胞基因组中，并随着细胞基因组的分裂而分裂，从而使外源基因得到持续稳定的表达。反转录病毒只能感染分裂期细胞，感染效率不理想；容纳外源基因的片段长度小于8 kb。此外，反转录病毒在宿主细胞基因组内随机整合，有诱发突变的危险，多用于体外实验。⑥慢病毒：属反转录病毒的子类，是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效的将目的基因导入动物和人的原代细胞或细胞系中，可有效感染多种类型的细胞，且对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。此外，慢病毒还具有操作简便、免疫反应小等优点，使其成为体内、外基因转移的一种有效工具，但其同样有引起插入突变的风险。该病毒的特殊来源亦是潜在危险因素之一。

2.4 基因转染方式 基因转染的方式可分为体内转染和体外转染。体内转染是将携带目的基因的载体直接注入软骨损伤部位，使目的基因在宿主细胞内表达，该方式操作简便、直接，且对机体的损伤小。但是软骨细胞分布于致密的细胞外基质中，将目的基因载体注入软骨损伤部位对基质中的软骨细胞作用不大，因此，目前关节软骨损伤的基因治疗多采用体外转染方式。体外转染是将目的基因导入体外培养的细胞，然后通过关节腔内注射或局部手术的方式，将基因修饰的细胞回植入软骨损伤部位进行表达。这种方式虽然较复杂，但可以在体外筛选出阳性的转基因细胞，并可进行安全性检查，以保证转基因细胞植入的安全性。已有研究证实在关节受损部位注射基因修饰的骨髓间充质干细胞修复关节软骨具有可行性^[12]。大部分的研究则是通过局部手术的方式，在受损部位植入转化生长因子β、骨形态发生蛋白、胰岛素样生长因子1、成纤维细胞生长因子2、CDMP-1或Shh等基因修饰的骨髓间充质干细胞与支架材料的复合物^[14-15]，从而达到修复关节软骨损伤的目的。

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