常温不停跳保存供心的超微结构和动力学变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.05.014

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (5): 851-858.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.05.014

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常温不停跳保存供心的超微结构和动力学变化

杨勇¹，林辉^{1, 2}，温昭科²，黄爱兰³，温红³，黄国勇³，胡彦艳³，钟永泷¹

1 武汉大学人民医院心胸外科，湖北省武汉市   430072
2 广西壮族自治区人民医院心胸外科，广西壮族自治区南宁市   530021
3 广西壮族自治区人民医院麻醉科，广西壮族自治区南宁市   530021

收稿日期:2012-12-14 修回日期:2012-12-25 出版日期:2013-01-29 发布日期:2013-01-29
通讯作者: 林辉，博士，博士生导师，教授，主任医师，广西壮族自治区人民医院心胸外科，广西壮族自治区南宁市 530021；武汉大学人民医院心胸外科，湖北省武汉市 430072 linhui33622@sina.com
作者简介:杨勇☆，男，1974年生，河南省开封县人，汉族，武汉大学第一临床学院在读博士，主治医师，主要从事心脏移植供心保护研究。yangyong2006150@163.com
基金资助:
国家自然科学基金委员会资助项目(81060027)。

Myocardial ultrastructure and hemodynamic changes of donor heart preserved in normothemic beating status

Yang Yong¹, Lin Hui^1,2, Wen Zhao-ke², Huang Ai-lan³, Wen Hong³, Huang Guo-yong³, Hu Yan-yan³, Zhong Yong-long¹

1 Department of Cardiothoracic Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei Province, China
2 Department of Cardiothoracic Surgery, People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
3 Department of Anesthesiology, People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2012-12-14 Revised:2012-12-25 Online:2013-01-29 Published:2013-01-29
Contact: Lin Hui, Doctor, Doctoral supervisor, Professor, Chief physician, Department of Cardiothoracic Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei Province, China; Department of Cardiothoracic Surgery, People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China linhui33622@sina.com
About author:Yang Yong☆, Studying for doctorate, Department of Cardiothoracic Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei Province, China yangyong2006150@163.com
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No.81060027

摘要/Abstract

摘要：

背景：心脏移植供心保护方法有向心脏正常生理状态改进的趋势，以期延长供心保存时间，改善供心的保存质量。理论上供心常温不停跳灌注保存是一种最接近生理状态的保存方法，有良好的发展潜力。
目的：观察连续灌注不停跳供心常温长时间保存心肌超微结构和左室血流动力学的变化。
方法：广西巴马小型猪24只，按随机数字表法分为不停跳连续灌注组和冷保存组，每组各6对。不停跳连续灌注组供心在顺行连续灌注跳动状态下切取，应用氧合血37 ℃、保存8 h后移植。冷保存组供心应用UW停搏液灌停后，0-4 ℃UW液保存8 h后移植。移植主动脉开放3 h观察供心左心室收缩压、左心室舒张压、左室平均压、左室舒张末压、左室内压最大上升和下降速率。记录移植后心律变化，需要除颤例数，以及主动脉开放3 h后能否脱离体外循环。主动脉开放3 h后取供心左心室前外侧壁心肌组织，观察线粒体及肌膜改变。
结果与结论：不停跳连续灌注组供心移植后左心室收缩压、左室平均压、左室舒张末压、左室内压最大上升和下降速率均优于冷保存组(P < 0.05)；主动脉开放后不停跳连续灌注组均可保持窦性心律，冷保存组仅1例自主恢复窦性心律；主动脉开放后3 h不停跳连续灌注组5例可顺利脱机，冷保存组1例可以脱机；不停跳连续灌注组心肌超微结构保存良好。提示供心常温灌注不停跳方法有良好的心肌保护效果，适于供心的长期保存。

关键词: 器官移植, 心肺移植, 心肌保护, 连续灌注, 心脏不停跳, 冷保存, 血流动力学, 心肌超微结构, 国家自然科学基金, 器官移植图片文章

Abstract:

BACKGROUND: For heart transplantation, the development trend of myocardial preservation method has changed from cold static storage to normal beating physiological status for prolonging preservation time and improving the quality of donor heart. Theoretically, the beating donor heart perfusion preservation at normal temperature is the preservation method that most close to the normal life state with a good potential for development.
OBJECTIVE: To observe the changes of myocardial ultrastructure and left ventricular hemodynamics of beating donor heart with continuous blood perfusion at normal temperature.
METHODS: Twenty-four Guangxi Bama miniature pigs were randomly divided into two groups: non-cardioplegia preservation group and cold preservation group, six pigs in each group. In the non-cardioplegia preservation group, the donor hearts were harvested in beating state and perfused continuously with normothermic oxygened blood. In the cold preservation group, the donor hearts were perfused with cold crystalliod cardioplegia for harvesting and persevered in 0-4 ℃ UW solution. After 8 hours, the donor hearts were transplanted to the recipients. After the transplanted aorta declamping for 3 hours, the left ventricular systolic pressure, left ventricular diastolic pressure, left ventricular mean pressure, left ventricular end-diastolic pressure, and the maximum rising and falling rate of left ventricular pressure of the donor hearts were observed. The changes of heart rhythm after transplantation, the number of required defibrillation and weaned from cardiopulmonary bypass after aortic declamping for 3 hours were recorded. The left ventricular anterolateral wall myocardial tissues of the donor hearts were obtained after aortic declamping for 3 hours to observe the changes of mitochondria and sarcolemma.
RESULTS AND CONCLUSION: The left ventricular systolic pressure, left ventricular mean pressure, left ventricular end-diastolic pressure and the maximum rising and falling rate of left ventricular pressure in the non-cardioplegia preservation group were significantly prior to those in the cold preservation group (P < 0.05). After aortic declamping, all donor hearts could maintain sinus rhythm in the non-cardioplegia preservation group, but only one case in the cold preservation group recovered sinus rhythm spontaneously. After aortic declamping for 3 hours, five hearts could wean off extracorporeal circulation in the non-cardioplegia group, but only one case in the cold preservation group. The myocardial ultrastructure of the non-cardioplegia preservation group was superior to that of the cold preservation group. Keeping donor heart in beating status with normothermic perfusion can provide effective myocardial preservation and fit for long-term preservation.

Key words: organ transplantation, heart and lung transplantation, myocardial protection, continuous perfusion, beating heart, cold preservation, hemodynamics, myocardial ultrastructure, National Natural Science Foundation of China, photographs-containing paper of organ transplantation

中图分类号:

R318

杨勇，林辉，温昭科，黄爱兰，温红，黄国勇，胡彦艳，钟永泷. 常温不停跳保存供心的超微结构和动力学变化[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(5): 851-858.

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图/表（结果） 4

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引言

1967年首例人类心脏移植在南非开展^[1]，现在心脏移植已经成为终末期心肌病患者的惟一治疗方法。随着器官移植知识的逐渐普及，终末期心脏病患者对心脏移植的接受程度逐渐升高，使供体资源短缺与等待心脏移植患者数量剧增之间的矛盾日益突出。尽管有研究显示异种供体如小型猪心脏和人类心脏解剖结构、大小和循环动力学相似的特点^[2]，并且作为供体有不受数量限制的发展潜力和在心脏移植中可以发挥桥梁的作用^[3-4]，但由于异种移植涉及到伦理学以及免疫学特性的困境^[5-6]，尽管临床有个案的尝试，但均未取得预期效果，使得该异种移植模式仅停留在实验研究阶段^[7]，而未被临床接受和开展。

现实中由于受心脏为单一器官客观条件限制，不可能使供体库在短期内明显增加。现有缓解这一供需矛盾的方法是改进供心保存方法，延长供心保存时间，以相对增加供体的数量^[8]，供体长时间保存不仅有利于远距离的运输，而且为供受者之间的最佳配型提供了充分时间，避免器官的浪费和减轻术后移植物免疫排斥反应；同时改善边缘供心的质量，增加边缘供心的使用率^[9]。现有供心冷保存方法1年死亡率随着冷缺血的时间由4-6 h明显增加^[10]，因此该方法安全时间仍局限在6 h以内，对超时限的供心应用存在移植失败的风险^[11]。所以，改进心肌保护技术，延长安全时限，提高供心保存质量，使供心得到充分利用是心脏移植的研究重点之一。

随着对供心保护研究的深入开展，对造成心肌损伤的因素已经有了较全面的认识，其中在供心保存中低温和缺血再灌注损伤对保存供心质量的影响尤为突出^[12]，因此供心保存方法针对这些影响因素进行了相关的改进。

为减少心肌缺血时间以及降低再灌注损伤的发生率和损伤程度，现有供心保护的方法由单纯的冷保存逐渐过渡到间断灌注^[13-14]，并向连续灌注保存方向发展^[15-17]，这些方法在维持线粒体的完整度、增加心肌ATP含量、降低心肌乳酸堆积和血浆肌酸磷酸激酶同工酶水平、减少氧自由基的生成和心律失常的发生，以及降低缺血和再灌注损伤的程度等方面，均显示了改善供心保存质量的效果。而近些年来针对低温对心肌功能的不利影响^[12]，多个研究对不同温度的供心保存效果进行了临床和实验研究^[18-21]，结果显示温血灌注能明显减少术后不良事件的发生率和心肌损伤相关酶的水平、提高术后心指数、改善术后心功能，而且常温灌注下不增加心肌氧耗量，还可以在降低灌注压时避免心肌缺血的发生。因而总体上认为常温灌注下供心保存是心肌保护的发展趋势^[22-23]。

在前期工作中^{[15, 24]}，作者利用巴马小型猪的心脏结构和循环动力学和人类相似的特点，进行了供心停博下微温血灌注保存和浅低温血供心不停跳保存的研究，显示出了连续灌注的对心肌结构和心功能的良好保护效果。但两种方法均有心脏停搏，没有完全避免心肌缺血的发生。因此在前期研究的基础上，作者进一步改进供心保存方法，在常温血持续灌注下进行供心不停跳获取并长时间保存8 h，然后在供心不停跳状态下实施心脏移植，观察常温血灌注下不停跳供心心肌结构和对心功能的保护效果。

材料方法

设计：随机对照动物实验，

时间及地点：于2011年8月至2012年7月在广西壮族自治区人民医院科研实验中心完成。

材料：

实验动物：健康八九个月龄的广西巴马小型猪共36只，体质量30-35 kg，均为雄性，由广西大学动物科学技术学院提供，实验动物许可证号：SCXK桂2007-0003。实验过程中对动物的处置符合相关动物伦理学要求。

常温不停跳保存供心超微结构和动力学变化实验的主要仪器：

Main instruments used in the experiment of ultrastructure and hemodynamic changes of donor heart preserved in normothemic beating status:

实验方法：

分组：按照实验设计12只为供血猪，其余24只按随机数字表法分为不停跳连续灌注组和冷保存组，每组各6对(供体和受体)。

麻醉：肌肉注射阿托品1 mg、注射咪达唑仑10 mg和氯胺酮(3 mg/kg)混合液诱导麻醉。经口气管插管，建立静脉通路，给肌松和镇静等药品维持麻醉。

采血：经供血猪股动脉采血约1 000 mL，应用白细胞滤器去除白细胞，以降低灌注时对心肌的损伤^[25-26]。

不停跳供心血灌注液配制：去白细胞血400 mL，加入50%葡萄糖及胰岛素，维持血糖在8.0-9.0 mmol/L，使血红蛋白在6 g/L左右，灌注供心前给予加250 mg甲强龙，根据血气及电解质结果调整电解质及空氧浓度，灌注液温度37 ℃。

供心的获取：停跳供心按前期试验获取^[27]，4 ℃ St Thomas晶体停搏液灌停后，供心保存在0-4 ℃ UW液 8 h；不停跳供心获取：正中切口进胸，静脉注射肝素 4 mg/kg，心包外游离心脏、主动脉弓降部(备阻断用)、游离上、下腔静脉。心尖部置入左心室减压管并固定，阻断钳夹闭备左心减压和测左心室压使用。结扎并剪断左头臂动静脉，显露右头臂动脉的3个分支动脉后结扎、切断，由右颈内动脉置入10号主动脉插管，固定后接主动脉灌注管道。调整常温血灌注液血气电解质指标在正常范围后，剪断上、下腔静脉和肺静脉，开放左心室减压管，阻断主动脉，开始灌注，离断与心脏相连血管和组织，移出心脏至保存装置内，心脏跳动下连续灌注保存8 h，灌注流量100-120 mL/min，灌注压45-55 mm Hg (1 mm Hg=0.133 kPa)。

受体移植：2组均采用标准原位心脏移植方法，建立体外循环后冷保存组体外循环温度控制在32- 34 ℃，不停跳组体外循环温度控制在34-36 ℃。吻合顺序为：左心房全部-肺动脉2/3周-主动脉全部-右心房。不停跳组吻合主动脉时调整供心主动脉插管位置由右侧颈内动脉至主动脉前壁，修剪供受体主动脉后进行端端吻合。

主要观察指标：

左心室血流动力学指标：供心切取前及移植主动脉开放3 h心室率、左室收缩压、左室舒张压、左室平均压、左室舒张末压、左室内压最大上升和下降速率。

移植后心律和脱机：记录移植后心律变化，需要除颤例数，以及主动脉开放3 h后能否脱离体外循环。

心肌超微结构改变：主动脉开放3 h后取左心室前外侧壁心肌组织，大小约1 mm×2 mm，3%戊二醛固定，低温(0-4 ℃)保存，送电镜室进一步处理，观察线粒体及肌膜改变。

统计学分析：由第一作者应用SPSS 16.0软件处理，计数资料采用Fisher's Exact Test；计量资料用x(_)±s表示，采用双尾非参独立样本Mann-Whitney U检验，P < 0.05认为差异有显著性意义。

讨论

供心保护质量是心脏移植后影响近期成功率和远期的存活率主要因素^{[11, 28]}，近年来为提高供心的保护效果，供心保护的方法由单纯晶体灌注冷保存和含氧血间断灌注冷保存向浅低温停跳含氧连续灌注和浅低温和常温不停跳氧合血灌注发展^{[24, 28-31]}，以减少心脏冷缺血的时间，为心肌代谢提供代谢底物，清除代谢产物，降低或避免缺血再灌注损伤的发生，而且在氧合血灌注下不停跳获取、保存、移植可以使供心在避免缺血再灌注损伤、避免降温和复温、以及高钾对心功能的影响等方面受益，但由于不停跳连续灌注保存方法需要的费用多和对灌注管理精确度高，是限制其研究和临床应用的主要原因^[32]，但该方法的在提高供心保护质量，延长供心保存时间方面的优势明显，是临床和基础研究需要实验研究的主要推动力，而且在理论上供心常温不停跳灌注保存也是一种最接近生理状态的保存方法，有良好的发展潜力。

在供心保存灌注保存有顺行灌注和逆行灌注两种方法，对巴马猪心脏冠脉系统顺行灌注作者发现巴马猪除冠状窦以外，在右房壁多有分散静脉开口，少量甚至回流至左房，有研究也发现逆行灌注可能造成右心室的灌注不全，发生细胞外水肿，以及微血管的损伤^[33-34]。

因此在该研究中作者采用顺行灌注方法，由右侧头臂动脉插入主动脉灌注管，该部位置管不仅有利于不停跳保存供心的固定，而且可在保留完整心包，对维持长时间保存心脏表面的湿度，减少物理性摩擦造成的心肌损伤，同时保留了供心足够长度的主动脉以备吻合，该灌注方法在研究中证明操作简便，灌注效果可靠。

在连续灌注供心不停跳保存中左心室有效减压是关键因素，离体供心在不停跳状态下左心室舒张时通过左房和二尖瓣口与外界直接相通，左心室收缩时二尖瓣处于关闭状态，如不进行开放减压在左心室收缩时有将心室内空气打入主动脉进而引起冠状动脉气体栓塞的风险。在不同的研究中，由于研究的方式差异，左心室减压的方式也有所不同，单纯供心不停跳保存可以采用Garbade等^[31]设计的的经主动脉置入带侧孔的主动脉灌注管，由侧孔经主动脉瓣放置左心室减压管，该方法不仅需要专门设计的灌注管，而且如果进行不停跳移植时该减压和灌注方式必须调整。

在前期研究中，作者使用由左房经二尖瓣置管，使左心室收缩时二尖瓣关闭不全，不能形成有效地收缩压，进行左心室减压，但该方法也仅适用于供心保存阶段，在心脏移植时由于肺静脉的血液回流至左心，该方法不能做到有效的左心室减压^[24]。因此在本文中采用心尖部置左心室引流管的方式减压，该减压方式简便可靠，而且有效地避免了左心室膨胀和主动脉进气的风险。

在心脏移植中供心术后心功能的恢复程度是反映供心保护效果的一个重要标志。由于左心室的前负荷和收缩功能是影响术后血流动力学的主要因素，因而左心室动力学变化是评价移植后心功能的一个主要指标^[35]。

在该实验中，不停跳组供心左室舒张末压和左室收缩压明显高于冷保存组，左室内压最大上升和下降速率明显大于冷保存组。显示了不停跳保存组心功能恢复好于冷保存组。由于左室舒张末压和左室舒张末期容积具有良好的相关性，因此通过左心室舒张末压可以直接的反应左心室的前负荷，根据Frank-Starling定律，在适当增加心室的前负荷可以增强心室收缩力，由于不停跳组显示了较高的舒张期末压，也提示心肌收缩力要大于冷保存组，为不停跳组展现出良好的左室收缩压提供了前期基础。同时左室舒张末压是反映左心室的顺应性指标^[36]，从的左室舒张期末压可以发现不停跳组供心左心室的顺应性高于冷保存组，良好的心肌顺应性有利于心室血液的充盈，提高心输出量，促进血流动力学的稳定。左室内压最大上升和下降速率是反映左心室收缩和舒张能力的重要指标，在检测结果中也显示移植后不停跳组左心室内压最大上升和下降速率均好于冷保存组，显示了不停跳组心肌收缩速度和舒张速度恢复良好。同时恢复良好的左心室血流动力学也是提高不停跳保存供心组移植术后早期脱离体外循环成功率的关键因素。心肌超微结构检测能够发现早期的心肌损伤性改变^[37]。在心肌超微结构中，线粒体是细胞能量代谢和合成的主要场所，在氧自由基和缺血再灌注损伤，以及钙超载等反应敏感，而且会使线粒体产生早期改变。

2组供心移植后灌注3 h的心肌超微结构在电镜下显示不停跳保存组线粒体结构完整度较好，无明显肿胀，线粒体嵴明显，无空泡状改变，提示常温连续灌注方法心肌损伤明显小于常规冷保存方法；心肌水肿是供心保存中的一常见现象，无论有无灌注均有发生，心肌水肿使心室壁厚度增加，可以导致微循环中的心肌灌注不全^[38]，在本文中左心室心肌超微结构中显示不停跳组的心肌肌膜无明显水肿性改变，提示该常温灌注下长时间保存对心肌水肿未产生明显影响；在心肌超微结构中，肌小节是心肌收缩的基本结构单位，不停跳组心肌电镜下肌小节保存良好，肌丝清晰，敏感带分界明显，镜下结构显示常温不停跳灌注组优于常规冷保存组。从心肌超微结构上分析，常温不停跳灌注保存对心肌结构有较好的保护效果，保存良好的细胞结构为不停跳组术后心功能的有效恢复提供了良好的解剖基础。

不停跳组由于在实践上避免了停博、复温及缺血和由缺血引起的的再灌注损伤，使供心在移植后避免了心律失常的发生，心功能得到较速的恢复，早期脱离体外循环。减少体外循环时间可以降低由于体外循环带来的血细胞破坏，以及肺脏、肾脏等重要器官和中枢神经系统损伤风险^[39-41]。

冷保存组由于低温保存和缺血/再灌注损伤等因素的影响，造成心律失常发生率高，心功能恢复差，主动脉开放3 h后多能顺利脱机，使体外循环时间延长，也提示长时间冷缺血保存的供心移植术后需要更长时间体外膜肺氧合技术的支持^[42]，以使供心功能得以保护和恢复。

从该实验结果可以看出供心不停跳连续灌注保存，避免了心肌缺血再灌注损伤，心功能得到了良好的保护，心肌超微结构良好，心律失常发生少，左心室血流动力学恢复快，可以早期停止体外循环，从而显示常温不停跳供心获取、保存，以及进行不停跳移植技术的可行性，而且对供心长时间保存有良好的心肌保护效果。不停跳供心保存移植的方法、灌注管理应进一步加大样本完善研究，远期效果有待进一步观察，期望通过更多动物实验为临床提供应用基础和实践经验。

常温不停跳保存供心的超微结构和动力学变化

Myocardial ultrastructure and hemodynamic changes of donor heart preserved in normothemic beating status

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