脾脏提取DNA与人类白细胞抗原配型实验方法

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.05.002

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (5): 769-776.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.05.002

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脾脏提取DNA与人类白细胞抗原配型实验方法

李海滨，郭海鸽，蔡文娥，覃音红，孙煦勇

解放军第三○三医院移植医学研究院，广西壮族自治区南宁市 530021

收稿日期:2012-09-26 修回日期:2013-01-08 出版日期:2013-01-29 发布日期:2013-01-29
通讯作者: 孙煦勇，博士，主任医师，硕士生导师，解放军第三○三医院移植医学研究院，广西壮族自治区南宁市 530021 xywn@sohu.com
作者简介:李海滨★，男，1979年生，广西壮族自治区岑溪市人，2011年南方医科大学毕业，硕士，实验师，主要从事转基因与克隆，分子生物学，移植免疫学研究。lihaibin303@163.com

DNA extraction from the spleen in human leukocyte antigen matching

Li Hai-bin, Guo Hai-ge, Cai Wen-e, Qin Yin-hong, Sun Xu-yong

Institute of Transplant Medicine, 303 Hospital of PLA, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2012-09-26 Revised:2013-01-08 Online:2013-01-29 Published:2013-01-29
Contact: Su Xu-yong, Doctor, Chief physician, Master’s supervisor, Institute of Transplant Medicine, 303 Hospital of PLA, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China xywn@sohu.com
About author:Li Hai-bin★, Master, Lab technician, Institute of Transplant Medicine, 303 Hospital of PLA, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China lihaibin303@163.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：人类白细胞抗原配型结果报告准确与否，直接影响供受者之间的配对选择，而配型样本的好坏则影响结果的优劣。
目的：建立脾脏提取DNA进行人类白细胞抗原配型实验的实验技术平台。
方法：通过从脾脏分离淋巴细胞提取DNA进行人类白细胞抗原配型实验，并同正常的和严重溶血的外周血提取DNA进行人类白细胞抗原配型的实验进行比较。
结果与结论：通过脾脏和正常外周血提取的DNA经扩增、电泳后均获得了完整的DNA电泳图，脾脏比正常外周血的电泳图更清晰，而严重溶血的标本未能获得清晰完整的DNA电泳图。实验成功建立了脾脏提取DNA进行人类白细胞抗原配型实验的实验技术平台。

关键词: 器官移植, 移植与免疫, 人类白细胞抗原, 配型, 排斥反应, 脾脏, 移植, 相容程度, 溶血, 多聚酶链式反应, 器官移植图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Whether human leukocyte antigen matching results are accurate or not may directly affect the pairing choice between the donors and recipients. Moreover, the quality of the matching samples may influence the pros and cons of the results.
OBJECTIVE: To establish an experimental technology platform for DNA extraction from the spleen in human leukocyte antigen matching.
METHODS: Lymphocytes were isolated and DNA was extracted from the spleen for the human leukocyte antigen matching, compared with DNA extracted from the whole blood which was normal peripheral blood or hematolytic sample.
RESULTS AND CONCLUSION: Intact electrophoretogram of DNA extracted from the spleen and normal peripheral blood was obtained after amplification and electrophoresis, and the electrophoretogram of DNA extracted from spleen was clearer than that extracted from the normal peripheral blood. However, the intact electrophoretogram of DNA extracted from hematolytic sample was not obtained. An experimental technology platform for DNA extraction from the spleen in human leukocyte antigen matching has been successfully established.

Key words: organ transplantation, transplantation and immunology, human leukocyte antigen, matching, rejection, spleen, transplantation, degree of compatibility, hemolysis, polymerase chain reaction, photographs-containing paper of organ transplantation

中图分类号:

R318

李海滨，郭海鸽，蔡文娥，覃音红，孙煦勇. 脾脏提取DNA与人类白细胞抗原配型实验方法[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(5): 769-776.

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图/表（结果） 3

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引言

临床实践表明，同种异体移植(除同卵双生子外)的排斥应是成功率的最大障碍。在遗传学中，主要组织相容性复合体是作为一个单位孟德尔式传递的。因此，同胞之间可有人类白细胞抗原相同、半相同和不同3种情况^[1-3]。实践证明，人类白细胞抗原相同的同胞供者的肾移植，90%以上效果良好；单体型不同的供者，效果明显下降；两单型皆不同者则很少存活。人类白细胞抗原本质和功能的揭示，为移植配型提供了重要的理论依据^[4-5]。

肾移植临床医师和科研人员长期以来梦寐以求的目标，是移植物的长期带功而不发生排斥反应^[6]。人类白细胞抗原配型是肾移植患者移植前选择最佳移植供受者配对的重要检测之一，是影响急性排斥反应发生率的重要因素，人类白细胞抗原配型在肾移植的应用对提高肾移植的长期存活率及对抗人类白细胞抗原抗体高敏感患者的肾移植具有重要意义^[7-10]。目前已知与器官移植排斥反应关系最为密切的主要是人类白细胞抗原一类抗原的A、B位点和人类白细胞抗原二类抗原的DR位点，每个位点均有两个抗原表达，一个来自父亲的基因，一个来自母亲的基因。因此，在进行移植手术前，必需对移植受者和供者外周血中淋巴细胞膜上的人类白细胞抗原A，B，DR 3个位点6个抗原进行检测，根据检测结果选择人类白细胞抗原最相配的受者和供者进行移植手术。

国内外大量的临床研究结果表明，受者和供者之间人类白细胞抗原相容程度越高，也就是受者和供者之间人类白细胞抗原A，B，DR 6个抗原中相同的抗原数越多，排斥反应的发生率就越低，移植成功率和移植器官长期存活率就越高。反之，就越容易发生排斥反应，从而降低移植成功率和移植物存活率。美国国立器官共享网络(UNOS)对50 000多例肾移植随访资料的统计分析表明，受者和供者之间人类白细胞抗原A，B，DR六个抗原全相同(相配)与全不同(六抗原错配)的3年和10年移植肾存活率分别相差20%和30%，急性排斥反应的发生率相差25%。所以，受者和供者间良好的人类白细胞抗原配型对移植后减少排斥反应、延长移植物有功能存活时间具有非常重要的临床意义。肾移植配型结果报告准确与否，直接影响供受者之间的配对选择，而配型样本的好坏则影响结果的优劣。外周血中含有一定量的有核细胞，但数量相对较少，而DNA提取试剂盒容易受到血标本是否溶血、是否黄疸血等因素的影响。由于取材时多个因素的影响，移植供体血常常出现溶血，这对需要在短时间内进行人类白细胞抗原配型配对是比较难完成的，而脾脏中含大量的有核细胞，选择脾脏提取DNA有利于克服外周血的缺点。本实验旨在建立利用脾脏提取DNA进行人类白细胞抗原分型的方法，为及时、准确进行人类白细胞抗原配型提供技术平台。

材料方法

设计：体外实验，样本观察。

时间及地点：实验于2011年10月至2012年3月在解放军第三○三医院移植医学研究院的移植医学实验室完成。

材料：脾脏来自器官供体，外周血取自供体，供体样本来源于器官捐献者，捐献者家属均知情同意，器官与相关样本的使用均符合医学伦理学标准。DNA提取试剂盒DNA Isolation Kit，AllSet™ Gold 人类白细胞抗原 ABDRDQ Low Res SSP HLA-SSP扩增板均购自美国Invitrogen公司，Taq 酶购自北京思尔成生物技术有限公司。

方法：

有核细胞的获取：剪取花生大小的脾脏置于无菌平皿，除去脾表面的一层致密结缔组织被膜，用无菌小剪刀轻轻剪碎至泥巴状，加入5-10 mL PBS，搅拌后静置5 min，吸取上清3 mL轻轻加入到已平衡温度并置于 15 mL离心管的人淋巴细胞分离液面上，室温、 2 000 r/min，离心半径12.5 cm，离心10 min，吸取淋巴细胞分离液上层的白膜层，即为淋巴细胞，用PBS洗涤2次，然后加入PBS重悬细胞，并调整细胞浓度为 10⁹ L^-1。

DNA提取及人类白细胞抗原分型分析：按照Invitrogen DNA Isolation Kit 试剂盒说明步骤提取模板DNA：分别吸取500 µL严重溶血标本、同一供体的未溶血的血液标本(血液标本也可2 000 r/min，离心5 min后将部分血浆弃去，混匀后吸取同样体积的血液)与脾脏细胞悬液，加入到3个2 mL离心管，然后每管均按以下方法步骤进行：加入800 µL红细胞裂解液，漩涡震荡混匀，静置5 mim，然后12 000×g，离心3 mim，去上清，再次加入1 000 µL红细胞裂解液，漩涡震荡混匀，12 000×g，离心3 mim，去上清，加入125 μL红细胞核裂解液，混匀，65 ℃反应30 min，加入275 µL蛋白清除液，混匀后置于4 ℃ 10 mim，14 000×g离心10 min 后取上清移至另一离心管，加入500 µL 体积分数90%乙醇，混匀后置于-20 ℃ 10 mim，14 000×g离心10 min，再加入体积分数70%乙醇12 000×g，重离心3 min，去上清，晾干10-15 min 后加入125 μL DNA溶解液，4 ℃暂时保存。

按照Invitrogen扩增步骤说明进行PCR扩增：将608 μL去离子水加入到PCR缓冲液中，漩涡混匀，加入7 μL Taq 酶，混匀，取10 μL加到第96孔做阴性对照，然后将上述的DNA溶液125 μL加入并混匀，接着将混合液按 10 μL/孔加到除第96孔外其余各孔中，加样后，并在样本上覆盖一层液体石蜡油(约10μL/孔)，最后加上封板膜，并在膜上标上编号和日期等即可到PCR仪上进行扩增。

按照HLA-SSP模式说明对样本进行扩增，扩增程序： 96 ℃预变性 60 s 1个循环；96 ℃变性25 s，70 ℃退火50 s，72 ℃延伸，5个循环；96 ℃变性25 s，65 ℃退火50 s，72 ℃延伸45 s，21个循环；96 ℃变性25 s，65 ℃退火60 s，72 ℃延伸120 s，4个循环；4 ℃结束。

扩增产物用2%的琼脂糖在水平电泳仪上进行电泳，凝胶成像系统观察结果并拍照，最后用计算机分析软件分析结果。

主要观察指标：观察利用上述3种样本提取DNA进行人类白细胞抗原分型，观察其获得的DNA的量及经扩增后电泳的电泳图，确定通过脾脏提取DNA进行人类白细胞抗原分型的方法是可行的，且比另外两种样本更优，从而为及时、准确进行人类白细胞抗原分型提供良好技术平台。

统计学分析：在第二作者的协助下，采用珠海黑马仪器有限公司的Hema GSG凝胶图像分析系统Version 4.0进行拍照并利用Invitrogen-SSP UniMatch4.0.7 Beta(RUO)(ABDRDQ-028v2)对电泳图进行分析。

讨论

移植是治疗各个器官终末期疾病的手段之一，在肾移植中, 虽然影响移植肾功能和存活率的因素很多^[11]，但人类白细胞抗原配型对肾移植存活及对移植肾排斥的影响已基本得到共识^[12]。临床实践表明：器官移植的成败取决于供受者间组织相容性，其中人类白细胞抗原的匹配程度起关键作用^[13]，人类白细胞抗原是肾移植术后的早期急性排斥反应的早期预测和预防的重要因素^[14-15]，是介导器官移植排斥的主要因素^[16-18]，供受者人类白细胞抗原相容程度与肾移植效果好坏与移植物长期存活有很大关联^[19-20]。供受者之间的组织不相容性是激活受者免疫系统、引起移植物发生排斥的重要因素^[21-22]，供受者的人类白细胞抗原差异大，需要的免疫抑制强，导致移植后相关并发症增加，使移植相关风险增高；人类白细胞抗原配型良好的供肾的半寿期明显大于人类白细胞抗原配型不良的供肾^[23]，良好的配型能降低肾移植后早期的急性排斥，能促进移植肾初期功能状态的恢复、移植肾成活，提高人/肾存活率^[24-25]，在降低药物的用量和药物的毒副作用的同时减轻了患者的经济负担。鉴于人类白细胞抗原配型对肾移植的重要性，而肾脏的所有组织上均有人类白细胞抗原-Ⅰ类抗原的表达，在肾小球、肾小管、内皮等部分组织中均有人类白细胞抗原-Ⅱ类抗原表达，因此，有关人类白细胞抗原配型对肾移植的影响受到人们的特别重视^[7]。

人类白细胞抗原是目前已知的具有最复杂多态性的人类基因系统^[26-28]，其基因分型方法能检出血清学分型不能检出的许多等位基因的特异性，有助于人类白细胞抗原系统的的多态性和基因的机构与功能的进一步研究。PCR-SSP为序列特异性引物PCR，是临床和基础研究中应用较多的人类白细胞抗原基因分型方法^[29]。人类白细胞抗原是一组位于第六号染色体短臂上的基因^{[23, 30-32]}，其特异性取决于α重链，根据不同基因位点的产物和功能，目前认为与肾移植相关度最高的是人类白细胞抗原A、人类白细胞抗原B、人类白细胞抗原DR，其中B位点比A位点重要，DR位点比B位点更重要^{[13, 14, 32]}。PCR-SSP分型不仅能分辨全部血清学人类白细胞抗原特异性，而且可根据临床及研究需要设计不同的引物，从而得出特异性的等位基因位点。本实验采用的HLA-SSP抗原板，前30孔决定A、B，后65孔决定Bw、DR、DRw、DQ。其分型的原理是根据人类白细胞抗原各等位基因的核苷酸序列，设计一套针对每一等位基因特异性的或组特异性的引物，通过PCR 特异性扩增该基因片段，从而达到分析人类白细胞抗原多态性的目的^[14]。

相对于其他的人类白细胞抗原基因分型方法，本实验采用的人HLA-SSP分型方法只在DNA提取阶段所耗的时间较长，但整个过程操作简便、所需样本量少，特异性高，技术条件易掌握，非常适合捐献器官或尸体器官移植的快速配型实验。及时、准确的人类白细胞抗原配型，为临床选择良好的供受者提供了参考^[33]。过去，临床实验室人类白细胞抗原配型多采用供、受者外周血进行检测，但是，一旦血样严重溶血，人类白细胞抗原实验结果则会出现扩增后无DNA条带或缺条带现象，导致不能及时、准确地给临床做出配型报告，不能及时选择合适的受体准备手术，延长了移植物在体外的等待时间，造成临床工作十分被动。在总结本实验室前人的基础上，结合作者在操作过程中发现，准确的人类白细胞抗原配型受样本、温度、扩增程序、操作者的水平等因素影响，尤其是样本，对于溶血样本，采用本试剂盒进行操作，容易出现条带缺失现象。在供体器官和血样采集过程中，由于操作或运输原因经常容易造成溶血，从而导致了供体的配型不能及时、准确得出报告，造成了器官移植的延误。为弥补溶血造成的后果，满足临床术前选择受者需要，作者采用脾脏分离有核细胞提取DNA来进行人类白细胞抗原配型，获得了很好的结果。脾脏是体内最大的外周淋巴器官^[34-35]，包含较多的T细胞、B细胞，还含有较丰富的巨噬细胞，经淋巴细胞分离液分离后可获得较多的有核细胞，远远多于外周血中的有核细胞，利用脾脏细胞提取的DNA浓度高于用血直接提取的DNA浓度，电泳后获得的条带完整、清晰。但是由于本实验没有测定其分光光度值，浓度之间的比较以及浓度梯度的选择，尚需进一步研究；另外为尽量减少移植物在体外的等待时间，耗时更短、敏感性更高的人类白细胞抗原配型实验技术平台需要在本实验室建立起来，以满足移植的基础研究和临床的需要。

人类白细胞抗原基因分型技术的不断发展，促进了人类对其多态性的更深层次的认识。随着分子生物学基因测序技术的进一步发展，人们对人类白细胞抗原配型的研究也将会越来越深入；目前本实验室采用的还是低分辨技术，配型效果同其他实验室一样还存在一定的局限性^[36]，因为供者和受者之间人类白细胞抗原相容程度越高，排斥反应的发生率就越低，移植成功率和移植器官长期存活率就越高，因此，目前发展起来的人类白细胞抗原高分辨技术，能使通过这种高分辨分型的移植技术能明显提高配型效果，从而使患者康复得更快，更有保证。伴随相关学科如免疫学的发展，人们就可能在研究其配型的基础上对机体的免疫系统进行修饰，届时人类白细胞抗原配型也将从基因水平上的配型上升到功能配型，即供者的人类白细胞抗原分子对受者的免疫系统无刺激，不会引起受者的排斥反应，这将是广大移植研究工作者和广大移植患者梦寐以求的，人类白细胞抗原配型在移植(器官、组织、细胞移植)中的应用前景更加广阔，这也是实验室在原有的基础上要升级的方向^[37-40]。

综上所述，本实验成功建立了利用脾脏提取DNA 进行人类白细胞抗原分型的技术方法，为及时、准确进行人类白细胞抗原配型，为临床进行受体配对并及时进行移植手术提供了技术平台。

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人类白细胞抗原基因分型技术的不断发展，促进了人类对其多态性的更深层次的认识。随着分子生物学基因测序技术的进一步发展，人们对人类白细胞抗原配型的研究也将会越来越深入；目前本实验室采用的还是低分辨技术，配型效果同其他实验室一样还存在一定的局限性^[36]，因为供者和受者之间人类白细胞抗原相容程度越高，排斥反应的发生率就越低，移植成功率和移植器官长期存活率就越高，因此，目前发展起来的人类白细胞抗原高分辨技术，能使通过这种高分辨分型的移植技术能大大提高配型效果，从而使患者康复得更快，更有保证。伴随相关学科如免疫学的发展，人们就可能在研究其配型的基础上对机体的免疫系统进行修饰，届时人类白细胞抗原配型也将从基因水平上的配型上升到功能配型，即供者的人类白细胞抗原分子对受者的免疫系统无刺激，不会引起受者的排斥反应，这将是广大移植研究工作者和广大移植患者梦寐以求的，人类白细胞抗原配型在移植（器官、组织、细胞移植）中的应用前景更加广阔，这也是实验室在原有的基础上要升级的方向。

本文创新性：实验主要是观察脾脏提取DNA进行人类白细胞抗原分型的方法的可行性，并同正常外周血和严重溶血的外周血提取DNA进行人类白细胞抗原配型的实验进行比较，确定通过脾脏提取DNA进行人类白细胞抗原分型的方法是可行的，且比另外两种样本更优，从而为及时、准确进行人类白细胞抗原分型提供良好技术平台。随着DNA提取技术的不断改进，利用正常外周血与溶血严重的血液样本获得的数据或许也可以获得与利用脾脏获取的数据同样清晰完整，但利用脾脏操作的广泛性及稳定性是值得推广应用的。文章的不足之处没有测定其分光光度值，浓度之间的比较以及浓度梯度的选择，尚需进一步研究。

脾脏提取DNA与人类白细胞抗原配型实验方法

DNA extraction from the spleen in human leukocyte antigen matching

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