大鼠髁突软骨细胞凋亡与胰岛素样生长因子1的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.033.001

中国组织工程研究

• 软骨组织构建 cartilage tissue construction • 下一篇

大鼠髁突软骨细胞凋亡与胰岛素样生长因子1的影响

魏立¹，江莉婷²，周琦¹，朱雅萍¹，高益鸣²

上海交通大学医学院附属瑞金医院，1上海市伤骨科研究所，2口腔科，上海市 200025

收稿日期:2013-05-13 修回日期:2013-06-18 出版日期:2013-08-13 发布日期:2013-08-13
通讯作者: 高益鸣，上海交通大学医学院附属瑞金医院口腔科，上海市 200025 drgaoym@yahoo.com.cn
作者简介:魏立，女，1982年生，上海市人，汉族，2008年上海交通大学毕业，技师，主要从事软骨细胞凋亡的信号通路方向的研究。weili30@163.com
基金资助:
Medical Guiding Project of Shanghai Science and Technology Committee, No. 114119a3500*

Insulin-like growth factor 1 affects the apoptosis of rat condylar chondrocytes

Wei Li¹, Jiang Li-ting², Zhou Qi¹, Zhu Ya-ping¹, Gao Yi-ming²

1Shanghai Institute of Orthopaedics Injury, 2Department of Stomatology, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200025, China

Received:2013-05-13 Revised:2013-06-18 Online:2013-08-13 Published:2013-08-13
Contact: Gao Yi-ming, Department of Stomatology, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200025, China drgaoym@yahoo.com.cn
About author:Wei Li, Technician, Shanghai Institute of Orthopaedics injury, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200025, China weili30@163.com
Supported by:
上海市科委医学引导项目(114119a3500)

摘要/Abstract

摘要：

背景：胰岛素样生长因子1参与了髁突软骨生长与改建，是软骨发育关键因子。
目的：探索胰岛素样生长因子1对体外培养大鼠髁突软骨细胞凋亡的作用，以及对凋亡相关因子Bcl-2和Bax mRNA及蛋白表达变化的影响。
方法：体外培养并鉴定出生后1，28 d大鼠髁突软骨细胞后，将每个年龄组的髁突软骨细胞分别分为实验组和对照组。饥饿培养24 h后，实验组加入100 μg/L重组大鼠胰岛素样生长因子1细胞因子孵育48 h，对照组正常培养。
结果与结论：与对照组相比，实验组加入重组胰岛素样生长因子1后，髁突软骨细胞数量增多，增殖速度显著增加(P < 0.05)。实时PCR和Western blot检测显示，加入重组胰岛素样生长因子1培养48 h后，各组髁突软骨细胞中bcl-2 mRNA和蛋白表达增加，bax mRNA和蛋白表达减少(P < 0.05)。提示胰岛素样生长因子1可以促进新出生及青春期大鼠髁突软骨细胞增殖，抑制其凋亡，并可能通过Bcl-2和Bax介导抑制凋亡。

关键词: 组织构建, 软骨组织构建, 胰岛素样生长因子1, 下颌骨髁突, 软骨细胞, 细胞凋亡, 细胞增殖, Bax, Bcl-2, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: Insulin-like growth factor 1 is the key factor during cartilage development, which is involved in the growth and reconstruction of condylar cartilage.
OBJECTIVE: To study the effect of insulin-like growth factor 1 on cell apoptosis and the apopotosis-associated factors of Bcl-2, Bax mRNA and protein expressions of rat condylar chondrocytes.
METHODS: The 1-day-old and 28-day-old rat condylar chondrocytes were cultured and identified in vitro. The condylar chondrocytes with different ages were divided into experimental group and control group. After being starved for 24 hours, chondrocytes in the experimental group were incubated with 100 μg/L recombined rat insulin-like growth factor 1 for 48 hours, while the chondrocytes in the control group were incubated normally.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, after being incubated with recombined insulin-like growth factor 1, the number of condylar chondrocytes was increased with high speed proliferation (P < 0.05). Real-time RCR and western blot analysis revealed that the expression levels of Bcl-2 mRNA and protein were increased after added with recombined rat insulin-like growth factor 1, while the expression levels of Bax and protein were decreased (P < 0.05). The results indicate that insulin-like growth factor 1 can promote the proliferation and reduce cell apoptosis of newborn and adolescent rat condylar chondrocytes, which may be mediated by Bcl-2 and Bax.

Key words: tissue construction, cartilage tissue construction, insulin-like growth factor 1, mandibular condyle, chondrocytes, cell apoptosis, cell proliferation, Bax, Bcl-2, provincial grants-supported paper

中图分类号:

R318

魏立，江莉婷，周琦，朱雅萍，高益鸣. 大鼠髁突软骨细胞凋亡与胰岛素样生长因子1的影响[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.033.001.

Wei Li, Jiang Li-ting, Zhou Qi, Zhu Ya-ping, Gao Yi-ming. Insulin-like growth factor 1 affects the apoptosis of rat condylar chondrocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.033.001.

图/表（结果） 5

2.1 培养的大鼠髁突软骨细胞的鉴定结果甲苯胺蓝染色显示，各组细胞染成浅蓝色，核深染，可见一两个核仁，胞质内可见紫红色异染基质出现，说明有葡萄糖胺聚糖合成。
免疫组化染色可见各组细胞胞质呈棕黄色，胞核不着色，Ⅱ型胶原呈强阳性表达，见图1，2，说明培养的细胞具有软骨细胞的特征。
2.2 重组胰岛素样生长因子1对髁突软骨细胞形态的影响倒置显微镜下显示，加入重组胰岛素样生长因子1后各组髁突软骨细胞数量增多，增殖速度显著增加，细胞变为圆形，胞浆均匀，核大而圆，呈铺路石状，见图3，4。
2.3 重组胰岛素样生长因子1对髁突软骨细胞活性的影响加入100 μg/L重组胰岛素样生长因子1培养24，48 h后，鼠龄为1，28 d的SD大鼠的髁突软骨细胞活性增加，见图5。

2.4 重组胰岛素样生长因子1对髁突软骨细胞凋亡的影响 DAPI染色结果显示，饥饿培养48 h后，大鼠髁突软骨细胞细胞核出现凋亡形态改变，核浓缩，呈现蓝色荧光；而加入100 μg/L重组胰岛素样生长因子1培养48 h后，大鼠髁突软骨细胞中凋亡细胞数量明显减少，见图6。
2.5 重组胰岛素样生长因子1对髁突软骨细胞中bcl-2，bax mRNA表达水平的影响实时PCR分析结果显示，与对照组相比，1 d SD大鼠组实验组加入重组胰岛素样生长因子1培养的髁突软骨细胞中抑凋亡基因bcl-2 mRNA表达波动不明显，但在28 d时表达显著增加，而 1 d及28 d SD大鼠组实验组促凋亡基因bax mRNA表达水平减少(P < 0.05)，见图7，且在28 d时bcl-2/bax mRNA比值增加最为显著，见表1。

2.6 重组胰岛素样生长因子1对髁突软骨细胞中Bcl-2和Bax 蛋白表达水平的影响 Western 检测显示，1，28 d大鼠髁突软骨细胞均在约26 bp(Bcl-2)和21 bp(Bax)处看到特异性条带，加重组胰岛素样生长因子1处理 48 h后，可见各组髁突软骨细胞内Bcl-2蛋白条带颜色较深，Bax条带较对照组颜色较浅，而内参β-actin蛋白表达无明显变化，见图8。定量分析显示，加重组胰岛素样生长因子1处理48 h后髁突软骨细胞中Bcl-2/Bax明显增加(P < 0.01)，见图9。

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引言

骨骼和肌肉的生长发育受到一系列功能性因素、全身激素水平及生长因子的复杂调控^[1-2]。在这些内源性因子中，生长激素起了核心作用，而生长激素的效应部分受胰岛素样生长因子1介导^[3]。胰岛素样生长因子1一部分在肝脏中合成^[4]，一部分由组织自分泌/旁分泌产生^[5]。近期基因学研究表明，在生长发育过程中，组织内分泌/旁分泌产生的胰岛素样生长因子1比肝脏产生来源的作用更为重要^[5-7]。

研究表明，骨与软骨的生长与改建是在细胞增殖与凋亡的稳态中进行：当细胞增殖速率大于凋亡，骨与软骨过生长，而当细胞凋亡超过增殖，则发生降解^[8]。胰岛素样生长因子1不仅参与了下颌骨髁突软骨生长发育的调控^[9-10]，亦参与了髁突软骨增殖、凋亡的调控^[11-13]。Hajjar等^[14]发现正常大鼠髁突软骨中增殖细胞核抗原阳性细胞分布与胰岛素样生长因子1一致，而在给大鼠佩戴下颌推进装置后可见增殖细胞核抗原与胰岛素样生长因子1表达增强，细胞增殖加快以及髁突软骨改建。Chen等^[15]发现胰岛素样生长因子1通过促分裂原活化蛋白激酶-细胞外调节蛋白激酶信号通路来促进软骨细胞增殖，从而引起颞下颌关节髁突软骨过生长。此外，研究表明，髁突软骨内胰岛素样生长因子1表达下调引起细胞凋亡可能与一些病理状态有关，如骨关节炎、颞下颌关节功能紊乱^[16-17]。然而，胰岛素样生长因子1凋亡信号通路在髁突软骨细胞中的表达变化趋势尚缺乏报道，其具体作用机制亦尚不清楚。

凋亡参与了髁突软骨生长改建的重要过程，Matsuda等^[18]研究显示出生后，凋亡细胞主要集中在髁突软骨细胞增殖层、肥大软骨细胞层，认为软骨细胞凋亡可能与颞下颌关节腔形成、软骨改建有关。随着对胰岛素样生长因子1认识的不断深入，发现胰岛素样生长因子1对髁突软骨细胞凋亡有着重要的调控作用。由于出生后经历从吞咽到咀嚼的功能改变，髁突软骨所受的机械负荷也发生改变^[19]，不同阶段的髁突软骨细胞对胰岛素样生长因子1的应答是否不同尚未见报道。因此，实验拟在体外培养的1，28 d龄SD大鼠髁突软骨细胞中加入重组胰岛素样生长因子1，探索胰岛素样生长因子1对大鼠髁突软骨细胞凋亡的作用及对凋亡相关因子Bcl-2和Bax表达的影响。

材料方法

设计：细胞学体外对比观察实验。

时间及地点：于2011年1月至2012年2月在上海交通大学医学院附属瑞金医院上海市伤骨科研究所完成。

材料：

实验动物：出生后1，28 d SD清洁级大鼠各30只，雌雄不限，饲养在标准实验室条件下，12 h昼12 h夜循环，室内温度恒定在20 ℃，湿度48%，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，生产许可证号：SCXK(沪) 2007-0005，实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

髁突软骨细胞检测的主要材料和仪器：

方法：

大鼠髁突软骨细胞的体外培养及鉴定：参照作者所在实验组前期方法进行取材及培养^[20]，在外科显微镜下无菌分离出生后1，28 d SD大鼠双侧髁突软骨，经过0.25%胰酶(pH 7.2-7.4)恒温37 ℃摇床消化30 min，弃上清液；0.1%Ⅱ型胶原酶恒温37 ℃摇床消化2 h，每隔1 h过滤离心收集软骨细胞；加入DMEM培养液(含体积分数10%胎牛血清，1×10⁸ U/L青霉素，100 mg/L链霉素)悬浮细胞；按1.0× 10⁸ L^-1浓度接种于10 cm培养皿，静置于37 ℃，饱和湿度，体积分数5%CO₂，95%空气的培养箱，进行细胞培养，当原代软骨细胞贴壁生长至80%-90%满底时传代，并进行甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组化染色。

Ⅱ型胶原免疫组化染色：选取出生后1，28 d SD大鼠P2代处于对数生长期的髁突软骨细胞用0.25%胰酶消化后，按1.0×10⁸L^-1细胞浓度接种在放有盖玻片的24孔板中，待细胞爬满后取出玻片，控制在同一反应条件下分别行Ⅱ型胶原免疫组化检测，常规ABC法染色，DAB 显色，比较结果。具体方法如下：PBS漂洗；体积分数3%H₂O₂去离子水孵育5-10 min，以消除内源性过氧化物酶活性，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min；滴加正常的山羊血清室温孵育10-15 min，倾去，勿洗；滴加1∶100稀释的Ⅱ型胶原单克隆抗体，4 ℃过夜；P BS冲洗5 min，3次；滴加生物素标记的二抗，室温孵育30 min；PBS冲洗5 min，3次；滴加辣根酶标记的链霉卵白素，室温孵育15 min；PBS冲洗5 min，3次；DAB显色剂显色，镜下观察颜色深浅，控制反应；蒸馏水终止显色；苏木精复染，1%盐酸乙醇分化，水中蓝化；常规系列乙醇脱水，二甲苯透明，树脂封固。阴性对照以正常羊血清代替一抗。

细胞分组：取出生后1，28 d第2代对数生长期髁突软骨细胞，以1.0×10¹¹L^-1细胞浓度接种至6孔板，每个时间点设3个复孔，每孔加入2 mL DMEM完全培养基，隔天换液，根据本课题前期预实验结果，镜下观察细胞长至60%-70%，换无血清DMEM培养液饥饿24 h后进行细胞分组。各年龄组实验组分别加入体积分数0.1%胎牛血清，100 μg/L重组大鼠胰岛素样生长因子1继续培养 48 h，正常对照组不加重组大鼠胰岛素样生长因子1培养，仅有培养液没有细胞的孔为空白对照，并在倒置相差显微镜下进行细胞形态学观察。

CCK-8检测髁突软骨细胞活性：取各组第2代对数生长期髁突软骨细胞，以1×10⁵/孔的密度接种至96孔板，每孔100 μL，以不含细胞的培养液设空白对照组。将96孔板置于37 ℃，体积分数5%CO₂饱和湿度细胞培养箱孵育24 h，细胞贴壁后，移出孔内培养液，饥饿培养 24 h，实验组及空白对照组加入100 μg/L重组大鼠胰岛素样生长因子1，正常对照组加入无血清DMEM培养液，每个时间点设3个复孔，分别继续培养24，48 h，在每个时间点前1.0-2.0 h，加入10 μL CCK-8混匀，以 450 nm处的吸光度(A_{450 nm})作为细胞活性值，每组检测3次，取平均值。

DAPI观察髁突软骨细胞凋亡形态学变化：取各组第2代对数生长期髁突软骨细胞，以1.0×10¹¹L^-1细胞浓度接种至6孔板中，置于37 ℃，体积分数5%CO₂饱和湿度细胞培养箱孵育24 h，细胞贴壁形成细胞爬片。饥饿培养 24 h，实验组加入100 μg/L重组大鼠胰岛素样生长因子1，正常对照组加入无血清DMEM培养液，在培养48 h后，弃培养液，PBS冲洗3次，无水甲醇固定15 min，吸出固定液，DAPI染色剂500 μL避光染色，吸去染液，PBS 冲洗2次，于荧光显微镜下观察。

实时定量PCR检测髁突软骨中bcl-2和bax mRNA的表达水平：按TRIzol法在培养后48 h提取各组髁突软骨细胞总RNA，取RNA 1 μL电泳检测RNA是否降解，紫外分光光度计测量RNA浓度和纯度；按ABI试剂盒使用说明书使用DNase I处理除去基因组DNA纯化总RNA。根据RNA浓度，20 μL反应体系，分别取2 μg总RNA按程序反转录成cDNA，待冷却后置于-20 ℃保存备用。

引物序列：

以cDNA链为模板进行PCR反应，PCR按两步法进行PCR扩增：预变性：95 ℃ 30 s； PCR反应：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，扩增40个循环。DEPC水为阴性对照，每个模板做3个复孔。加样完成后，将96孔板置于ABI 7500 real-time PCR仪进行反应。结果采用相对定量2^-△△Ct法分析^[21]。

△△Ct=[Ct_目的基因₍_加药组₎-Ct_β-actin(_加药组₎]－[Ct_目的基因₍_正常组₎ -Ct_β-actin(_正常组₎]

Western blot检测髁突软骨中Bcl-2和Bax的表达水平：在培养后48 h，收集各年龄组SD大鼠髁突软骨细胞，弃培养液，6孔板每孔用1×PBS 1 mL清洗2遍，每孔加入 350 μL 2×SDS细胞裂解液，同时每孔加入7 μL蛋白酶抑制剂，用细胞刮槽刮下细胞，99 ℃煮10 min， 5 000 r/min离心2 min，上样，行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(12%分离胶，5%积层胶)。电泳条件：80 V/h。电泳结束后，用Bio-Rad半干转移仪将蛋白从凝胶中转移到PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭2 h。分别将Bcl-2和Bax(1∶1 000稀释)加入5%脱脂奶粉中， 4 ℃孵育过夜，用1×TBST洗脱15 min，重复3次，次日以二抗(1∶5 000)室温孵育2 h，用1×TBST洗脱15 min，重复3次。用ECL化学发光试剂盒处理。然后分析灰度，再计算灰度系数比，实验重复3次。

主要观察指标：大鼠髁突软骨细胞的鉴定、加入 100 μg/L重组大鼠胰岛素样生长因子1细胞因子后髁突软骨细胞形态变化、细胞凋亡情况、细胞核的形态改变以及细胞中Bcl-2和Bax mRNA和蛋白的表达水平。

统计学分析：
数据以x(_)±s表示，采用SPSS 17.0统计软件进行分析，所有数据的组间比较均采用两独立样本配对t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

颞下颌关节响应来自咬合力的持续性机械刺激，保持着自身的改建能力^[22]。咬合力的改变，会引起颞下颌关节生化环境的改变，破坏软骨细胞增殖与凋亡之间的平衡^[23]，从而导致髁突的病理性改建，如下颌骨不对称畸形，骨关节炎。细胞凋亡参与了下颌髁突软骨发育的重要过程^[24-26]，维持软骨内环境的稳定，包括去除老化及有害的细胞。软骨细胞增殖与凋亡信号的平衡，协调了软骨生长及适应性改建。

研究表明，胰岛素样生长因子1参与了髁突软骨凋亡的调控。Yokota等^[27]对12 d龄的大鼠髁突软骨体外培养时发现，胰岛素样生长因子1表达下调会引起胰岛素样生长因子连接蛋白3表达下调及caspase 3表达上调，从而促进了软骨细胞凋亡，提示髁突软骨未分化间充质细胞的生存需要胰岛素样生长因子1信号通路的调控。实验结果显示，在新出生及青春前期大鼠髁突软骨细胞中，胰岛素样生长因子1表达上调后，各组髁突软骨细胞数量增多，增殖速度显著增加，细胞变为圆形，核大而圆，bcl-2 mRNA及蛋白表达均上调，而bax mRNA及蛋白表达下调，提示Bcl-2与Bax可能是胰岛素样生长因子1下游发挥调控软骨细胞分化的因子，胰岛素样生长因子1通过调控下游Bcl-2与Bax表达来对髁突软骨细胞发挥促增殖，抑制凋亡的作用。实验结果显示bcl-2/bax基因水平比值较正常组增大，bcl-2与bax的比值反应了髁突软骨中经凋亡信号途径调控软骨细胞增殖或凋亡的过程，当bcl-2/bax比值增大，细胞趋向增殖，当bcl-2/bax比值减少，细胞走向凋亡^[28]。bcl-2家族是细胞程序性死亡中重要的调节子，包括抑凋亡基因(bcl-XL，bcl-2，卡波氏肉瘤病毒-bcl-2，bcl-W)以及促凋亡基因(bax和bid)^[29]。Wu等^[30]给实验组8周龄兔佩戴下颌骨推进装置，发现右侧颞下颌关节中Bcl-2/Bax比率在3 d后持续下降，从而认为Bcl-2和Bax表达与髁突软骨细胞凋亡相关。此后，Wu等^[31]进一步对实验组兔进行关节盘前置换后髁突软骨细胞内凋亡关键蛋白表达研究发现，Fas，caspase-8、Bcl-2/Bax比率与髁突软骨细胞内凋亡活性的增加相关。Huang等^[32]对新西兰大白兔颅下颌关节研究显示，Bcl-2以及Bax蛋白存在于颅下颌关节软骨中，并且通过凋亡信号途径参与软骨细胞的生存或死亡。此外，实验结果还显示，各年龄组实验组caspase 3 mRNA表达呈下降趋势(数据未展示，在髁突软骨细胞内活化caspase 3蛋白表达仍在进一步检测摸索中)，bcl-2与bax mRNA比值增大，这些现象在28 d时最为明显，提示胰岛素样生长因子1表达升高抑制了细胞凋亡程序，胰岛素样生长因子1可能通过提高bcl-2/bax比值，降低caspase3基因表达，来抑制髁突软骨细胞凋亡，且在青春前期的SD大鼠髁突软骨细胞发育中作用最为显著，但是其作用机制尚不完全清楚。

一般认为，细胞的凋亡从接受细胞凋亡信号开始，经过一系列信号感应及传递过程，最终产生效应，在这一过程中，不仅有细胞线粒体的肿胀、核溶解以及质膜连续性的破坏等结构变化^[33]，这一过程受各种凋亡基因调控，包括促凋亡基因p53，ced-3/ICE蛋白酶和Bax家族^[34]，以及抑凋亡基因ced-9/Bcl-2和腺病毒蛋白EIB，共同调控细胞程序性死亡。当凋亡信号激活后，凋亡细胞的死亡由一组蛋白质，即caspase家族介导^[35-36]，包括起始蛋白caspase 2，8，9及终结蛋白caspase 3，6，7，而一旦caspase 3被激活，那么凋亡过程不可逆转。实验证实，在新出生及青春期大鼠髁突软骨细胞内，当胰岛素样生长因子1表达上调后，细胞增殖加快，bcl-2 mRNA表达上调，bax及caspase 3 mRNA表达下调，提示细胞凋亡减少。然而，在髁突软骨细胞内，调节胰岛素样生长因子1效应的机制还未被完全阐明，目前认为主要有4条途径，包括2条经典途径^[37]：①由磷脂酰肌醇3-激酶及其下游的丝氨酸组成的磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸信号转导通路。当胰岛素样生长因子1与其跨膜受体胰岛素样生长因子1受体结合后，通过胰岛素受体底物(胰岛素受体底物1)酪氨酰基磷酸化，激活磷脂酰肌醇3-激酶，从而激活丝氨酸及下游信号途径，最终能引起许多生理性底物(如Bcl-2家族成员之一的BAD，caspase，forkhead转录因子等)的磷酸化^[38-39]，并能维持细胞代谢、生存并阻止多种刺激诱导的细胞凋亡。②激活Ras/Raf/促分裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶1/2信号途径，促分裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶在静止期细胞中处于去磷酸化状态，激活的促分裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶把信号传递到细胞核内，从而启动有丝分裂^[40-41]。胰岛素样生长因子1介导的抑凋亡效应是由于胰岛素样生长因子1能阻滞一氧化氮介导的去分化和各类凋亡信号(如蛋白激酶Cα及蛋白激酶Cζ的抑制、细胞外调节蛋白激酶及p38激酶的激活及其下游核因子κB，p53(抑癌基因)，Bax，caspase3的激活)。加入特异性反义寡核苷酸后，髁突软骨内胰岛素样生长因子1 mRNA表达显著下调，caspase3表达增加，推测胰岛素样生长因子1抑制了髁突软骨中凋亡途径的激活。结合先前的研究，髁突软骨中的凋亡还与一些病理状态有关，如骨关节炎，但是在颞下颌关节紊乱及髁突软骨生长改建中胰岛素样生长因子1的作用与凋亡起始的关联有待进一步研究。另2条途径包括：③胰岛素样生长因子1介导的蛋白激酶蛋白激酶A、蛋白激酶C胞内级联信号，产生胰岛素样生长因子1促增殖、分化和凋亡效应，然而在不同的细胞胰岛素样生长因子1效应不同，在关节软骨细胞内胰岛素样生长因子1介导的蛋白激酶C，蛋白激酶A信号途径部分与磷脂酰肌醇3-激酶、促分裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶1/2，Gβγ亚基重叠。外源性胰岛素样生长因子1通过磷脂酰肌醇3-激酶抑制细胞外调节蛋白激酶1/2、上调p38激酶以及蛋白激酶C信号，从而促细胞增殖及分化。④近来有学者提出一条14.3.3蛋白途径^[38]，这4条信号途径，都使Bcl-2调节子BAD磷酸化，从而阻止caspase3的活化，最终导致细胞凋亡。进一步研究表明在体外培养的32D细胞系(缺乏胰岛素受体底物1的小鼠造血细胞)中，胰岛素样生长因子1受体至少通过磷脂酰肌醇3-激酶/胰岛素受体底物1、Shc/促分裂原活化蛋白激酶、14.3.3/Raf这3条不同的途径来介导凋亡，并最终导致BAD磷酸化，这些途径部分重叠，其中任意2条通路就能提供生存信号^[38]。但在髁突软骨细胞中的具体机制国内外尚未见报道，还有待进一步研究。

综上，髁突软骨细胞中胰岛素样生长因子1表达升高抑制了细胞凋亡程序，胰岛素样生长因子1可能通过提高Bcl-2/Bax比值，降低caspase3基因表达，来抑制髁突软骨细胞凋亡，且在青春前期的SD大鼠髁突软骨发育中作用最为显著，但是其作用机制尚不完全清楚，有待后续进一步研究。

大鼠髁突软骨细胞凋亡与胰岛素样生长因子1的影响

Insulin-like growth factor 1 affects the apoptosis of rat condylar chondrocytes

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