2.1 β-磷酸三钙/聚乙烯醇复合水凝胶人工角膜裙边支架迟发型超敏反应实验结果 见表1。

表1数据表明阴性对照组豚鼠6 h致敏分级为1级，24，48 h致敏分级均为0级，属无症状现象。阳性对照组豚鼠6 h致敏分级均为1级，24，48 h致敏分级均有4只为1级和2只为2级，属于致敏现象。实验组6h致敏分级均为1级，24，48 h的致敏分级均为0级，属无症状现象。

2.2 β-磷酸三钙/聚乙烯醇复合水凝胶人工角膜裙边支架急性全身毒性实验结果 实验组和对照组实验后体质量变化结果见表2。



实验组小鼠精神、饮食良好，未见明显毒性反应，无死亡，与对照组比较未见明显差异。样品浸提液注射后24，48，72 h，实验组与对照组体质量比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.3 β-磷酸三钙/聚乙烯醇复合水凝胶人工角膜裙边支架体外细胞毒性实验结果 见表3。

表3结果表明，阳性对照组与其余各组的A值之间均有差异非常显著性意义(P < 0.01)；样品浸提原液与50%浸提液之间的A值差异无显著性意义，两组与空白对照组之间的A值差异均无显著性意义。

样品浸提原液与50%浸提液的细胞相对增殖率分别为99.74%，110.29%，均>80%，按照国标中的评价标准，样品的体外细胞毒性均为0级或1级。阳性对照组为27.97%，体外细胞毒性均为4级。
2.4 β-磷酸三钙/聚乙烯醇复合水凝胶人工角膜裙边支架皮内反应实验结果 见表4。

表4结果表明阴性对照组实验兔2只，观察点10个，均无红斑、无水肿情况，皮内反应为极轻微级；实验组验兔2只，观察点10个，实验组与阴性对照组实验情况基本一致，均无红斑、无水肿情况，皮内反应为极轻微级。

设计：对照观察性实验。
时间及地点：于2011年7月至2012年4月在深圳大学化学与化工学院实验室，深圳大学深圳国家生化工程技术开发中心实验室完成。
材料：β-磷酸三钙，医用级，由上海凯川化工提供；聚乙烯醇，医用级，由上海润捷化学试剂有限公司提供。
实验动物：雄性白化豚鼠24只，体质量250-350 g；昆明小鼠20只，雌雄不拘，体质量17-21g；新西兰白兔2只，雌雄不拘，体质量2.2-2.5 kg；以上动物均购自广东医学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤) 2008-0002。实验过程中对动物的处置符合国家科技部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》。
人工角膜裙边支架材料生物相容性实验的试剂与仪器：
Main reagents and instruments used for a biocompatibility experiment about artificial corneal skirt scaffolds:

实验方法：
β-磷酸三钙/聚乙烯醇复合水凝胶人工角膜裙边支架材料制备：首先，制备5 mL聚乙烯醇水凝胶；其次，在聚乙烯醇水凝胶中加入2 g β-磷酸三钙，经2 h恒温搅拌制得β-磷酸三钙/聚乙烯醇复合水凝胶；再次，加入15 g的致孔剂，经1 h恒温搅拌，倒入模具中经冷冻成型；最后，通过去离子水浸泡除去致孔剂从而得到多孔裙边支架材料。
β-磷酸三钙/聚乙烯醇复合水凝胶人工角膜裙边支架材料生物相容性实验：参照相关国家标准，通过急性全身毒性、迟发型超敏反应、体外细胞毒性和皮内反应等实验评价β-磷酸三钙/聚乙烯醇复合水凝胶人工角膜裙边支架材料的生物相容性^[13-17]。
迟发型超敏反应实验^[17]：
浸提液的制备：以生理盐水为浸提介质，在无菌条件下，取支架样品表面积60 cm²，加入浸提介质20 mL，置37 ℃浸提72 h，0.2 μm滤膜除菌，得到样品浸提液。以无检测样品的浸提介质为阴性对照，4 g/L 2-巯基苯并噻唑为阳性对照。
动物实验包括皮内诱导、局部诱导及激发。①皮内诱导：将24只豚鼠剪去背部区域毛发，分为实验组12只、阴性对照组6只、阳性对照组6只。常规消毒后在每只豚鼠脊柱两侧从头向尾分3对(3个点)进行皮内注射，注射液分别为A液(取完全弗氏佐剂与生理盐水1∶1等体积混合成稳定乳化剂，完全弗氏佐剂是含有灭活分枝丁酸梭菌的矿物油佐剂，能够增强豚鼠的诱导效应力)、B液(样品浸提液或阴性对照液或阳性对照液)，C液(A液与B液等体积混合稳定性乳化剂，辅以佐剂以改变浸提液的物理状态而延长其在体内的滞留时间，使抗原缓慢释放，增强动物的诱导效果)，每点注射0.1 mL。②局部诱导：皮内注射后6 d，各注射部位用10%十二烷基硫酸钠按摩导入，24 h后按组贴敷于B液浸泡至饱和的纱布(4-8 cm²)，半封闭用胶带固定并留置48 h。③激发：局部诱导后14 d，脱去腹部区域毛发，24 h后常规消毒腹部脱毛区域，按组贴敷于C液中浸泡至饱和的纱布(4-8 cm²)，固定并留置 24 h。除去贴敷物后24，48 h观察贴敷区皮肤的红斑、水肿等反应。
评价标准：按Magnusson和Kligman分组标准，记录各观察点激发部位的红斑和水肿的的反应分级。0级，无明显改变；1级，散发性或斑点状红斑；2级，中度融合性红斑；3级，严重红斑和水肿。
急性全身毒性实验^[18]：
浸提液的制备：样品浸提液以生理盐水为浸提介质，在无菌条件下，取样品表面积60 cm2加入浸提介质20.0 mL，置37 ℃浸提72 h。
动物实验：将20只昆明小鼠随机分成实验组和对照组，每组各10只，实验前称质量并记录，样品浸提液用0.22 μm滤膜过滤；对照组每只小鼠尾静脉注射生理盐水1 mL，实验组每只小鼠尾静脉注射样品浸提液1 mL。
观察指标：经静脉注射后24，48，72 h观察小鼠的状态、运动、体质量、毒性表现和死亡动物数量。实验数据采用x_±s表示，两个独立样本均数比较应用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。
急性全身毒性实验评价标准：
Evaluation criteria for acute systemic toxicity test:

体外细胞毒性实验^[19-25]：
材料处理：浸提原液组在无菌条件下，取样品人工角膜表面积18.5 cm²，加含体积分数10%胎牛血清的H-DMEM细胞培养液6.0 mL，于37 ℃浸提24 h；50%浸提液组将样品浸提原液稀释1倍制成；阳性对照组取含5 g/L苯酚的细胞培养液5.0 mL，于37 ℃放置24 h；空白对照组取5.0 mL细胞培养液，于37 ℃放置24 h；以上各组均经过0.22 μm滤膜过滤备用。
细胞培养：将MRC-5细胞接种于25 mL培养瓶中，常规培养在含有体积分数10% 胎牛血清和双抗 (100 U/mL青霉素，100 U/ mL链霉素)的H-DMEM培养基中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度的恒温培养箱中，每三四天更换培养基1次，细胞达融合状态时传代。冻存细胞使用前至少传代培养3次。
细胞悬液制备：将正常传代培养的MRC-5细胞经消化液消化制成浓度为1×10⁷ L^-1的细胞悬液，接种于96孔板，200 μL/孔，每组6孔，置CO₂培养箱内培养。上述细胞悬液培养24 h后，弃去原细胞培养液，供试样品组分别用浸提原液3 cm²/mL或50%浸提液1.5 cm²/mL交换；空白对照组和阳性对照组用相应的对照液交换；交换后于CO₂培养箱内继续培养48-72 h(在对数生长期末，约80%细胞汇合为宜)。四周边缘孔加入H-DMEM培养液200 μL/孔。
MTT实验：检测时每孔加入5 g/L的MTT 20 μL， 37 ℃保温4 h翻转，弃去上清液，每孔加入DMSO 150 μL并振荡10 min，在酶标仪上测定吸光度A值，测定波长为570 nm，参考波长为630 nm，通过公式计算细胞相对增殖率。

细胞相对增殖率评价：根据细胞相对增殖率均值，按体外细胞毒性评分标准对样品细胞毒性程度进行评价。0级，细胞相对增殖率≥100%；1级，细胞相对增殖率80%-99%；2级，细胞相对增殖率50%-79%；3级，细胞相对增殖率30%-49%；4级，细胞相对增殖率0-29%。
皮内反应实验^[26]：
材料处理：实验样品组在无菌条件下，取样品表面积30 cm²，分别加入生理盐水、芝麻油各10.0 mL，置于37 ℃浸提72 h；阴性对照组在无菌条件下，取生理盐水、芝麻油各10.0 mL，置于37 ℃放置72 h；0.22 μm滤膜过滤备用。
动物实验：取新西兰白兔2只，在兔脊柱两侧用儿童脱毛器脱毛。用体积分数为75%乙醇消毒皮肤，在脊柱两侧各选择10个点，每点间隔2 cm，每点皮内注射 0.2 mL。一侧前后5点分别注射实验样品生理盐水浸提液和阴性对照生理盐水；另一侧前后5点分别注射实验样品芝麻油浸提液和阴性对照芝麻油。注射后分别在24，48，72 h观察注射局部及周围皮肤组织反应。
皮肤反应记分系统：
Scoring system of intradermal reactions:

兔皮内刺激反应类型：0-0.4分，极轻微；0.5-1.9分，轻度；2-4.9分，中度；5-8分，重度。
将实验组和阴性对照组的全部红斑和水肿的记分相加[2(动物数)×3(观察点)×2(记分类型)]，再除以总观察数，计算出实验组和阴性组的综合平均记分。
主要观察指标：β-磷酸三钙/聚乙烯醇复合水凝胶人工角膜裙边支架材料的生物相容性。

1   通过急性全身毒性、迟发型超敏反应、体外细胞毒性和皮内反应等实验，可评价多孔β-磷酸三钙/聚乙烯醇复合水凝胶人工角膜裙边支架材料生物相容性。
2   实验研制的多孔β-磷酸三钙/聚乙烯醇复合水凝胶人工角膜裙边支架材料具有良好的生物相容性。
3   参考GB/T 16886.10-2005、行业标准YY/T 0127-2、国标GB/T 16886.5-2003、及行业标准YBB 0006-2003，以迟发型超敏反应、体外细胞毒性和皮内反应及急性全身毒性反应对β-磷酸三钙/聚乙烯醇复合水凝胶人工角膜裙边支架材料进行严格的生物相容性检验，可确保医用材料使用的安全性。
4   实验通过迟发型超敏反应、急性全身毒性、体外细胞毒性及皮内反应4个方面评价多孔β-磷酸三钙/聚乙烯醇复合水凝胶人工角膜裙边支架材料的生物相容性性能虽已较为全面，但作为用于眼内植入的材料，应测定其遗传毒性，以便进一步提高安全性。

由β-磷酸三钙与聚乙烯醇制备的多孔β-磷酸三钙/聚乙烯醇复合水凝胶人工角膜裙边支架材料是一种具有高含水量、良好柔软性、高生物活性的复合水凝胶，比其他生物材料更像人体组织。多孔裙边支架与角膜组织能充分地达到生物性愈合，从而使人工角膜支架部分与角膜组织的结合更牢固、更稳定，并能起到支持光学部分和人工角膜长期存留的作用。但任何生物材料在应用于人体之前，必须经过严格的生物相容性检验，以确保医用材料使用的安全性。实验主要通过对材料的迟发型超敏反应、急性全身毒性、体外细胞毒性和皮内反应进行相关实验评价材料实际的生物相容性。