最新进展的转基因技术在骨与软骨缺损修复中的应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.02.030

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (2): 353-257.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.02.030

• 组织构建学术探讨 tissue construction academic discussion • 上一篇下一篇

Latest transgenic technology in bone and cartilage defect repair

Ru Jia¹, Li Qiang²

1 Guilin Medical College, Guilin 541004, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
2 Department of Limb Trauma and Hand Surgery, Affiliated Hospital of Guilin Medical College, Guilin 541001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2012-04-19 Revised:2012-06-25 Online:2013-01-08 Published:2013-01-08
Contact: Li Qiang, Department of Limb Trauma and Hand Surgery, Affiliated Hospital of Guilin Medical College, Guilin 541001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Ru Jia★, Studying for master’s degree, Guilin Medical College, Guilin 541004, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China rujiadeweiyi@sina.com
Supported by:
Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No. 31160199

摘要/Abstract

摘要：

背景：组织工程技术在骨与软骨的修复方面已经取得巨大进步，其中转基因技术的引入在最近几年也引起人们广泛的关注。
目的：总结近5年来转基因技术在骨与软骨缺损修复中的最新研究进展。
方法：应用计算机检索CNKI数据库和PubMed数据库2007年1月至2012年3月关于转基因技术治疗骨与软骨缺损方面的文献，中文检索词“基因，治疗，骨，软骨，缺损”。英文检索词“gene，therapy，bone，cartilage，defect”，最终纳入22篇符合要求的文献。
结果与结论：基因治疗为骨和软骨再生带来了一种新的治疗理念，它可以把具有特异性的目的基因精确转移入靶细胞内，并特异性的表达。目前应用于骨与软骨缺损的基因主要包括骨形态发生蛋白，转化生长因子，碱性成纤维细胞生长因子，胰岛素样生长因子，血管内皮细胞生长因子，Bcl-xl基因等。应用基因治疗可以诱导骨与软骨的形成，为骨与软骨的修复提供了崭新的途径。

关键词: 组织构建, 组织构建学术探讨, 基因, 治疗, 骨, 软骨, 缺损, 骨形态发生蛋白, 转化生长因子, 碱性成纤维细胞生长因子, 胰岛素样生长因子, 血管内皮生长因子, SOX, Bcl-xl, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Tissue engineering technology has made a great progress in bone and cartilage repair, and the introduction of transgenic technology in recent years also has caused widespread concern.
OBJECTIVE: To summarize the development of transgenic technology in the repair of bone and cartilage defects in the past 5 years.
METHODS: Relevant articles about transgenic technology in bone and cartilage defect which were published from January 2007 to March 2012 were retrieved in CNKI and PubMed with the key words of “gene, therapy, bone, cartilage, defect” in Chinese and English, respectively. Finally, 22 articles that met the inclusive criterion were included.
RESULTS AND CONCLUSION: Gene therapy introduces a new treatment concept for bone and cartilage regeneration, which can induce genes into targeted cells with specific expression. Genes for bone and cartilage defects include bone morphogenetic protein, transforming growth factor, basic fibroblast growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor, and Bcl-xl gene. Gene therapy can induce bone and cartilage formation, and provides a new approach for bone and cartilage repairing.

Key words: tissue construction, academic discussion in tissue construction, gene, therapy, bone, cartilage, defect, bone morphogenetic protein, transforming growth factor, basic fibroblast growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor, SOX, Bcl-xl, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

R318

茹嘉，李强. 最新进展的转基因技术在骨与软骨缺损修复中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(2): 353-257.

Ru Jia, Li Qiang. Latest transgenic technology in bone and cartilage defect repair[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(2): 353-257.

图/表（结果） 1

2.1 基因治疗的概念基因治疗是在DNA重组技术的基础上发展起来的，通过基因载体将目的基因导入特定的靶细胞中，通过替代、修复、对抗等方式调节特定目的基因产物的表达，从而来达到治愈疾病的目的。基因治疗的主要包括以下4步：转导、复制、翻译和表达。基因转导的方式包括体内途径和体外途径两种方式。体内途径即将目的基因直接导入细胞内，并将特定目的基因表达。体外途径是将靶基因在体外进行修饰，使其具有生物活性作用，然后导入细胞体内。

2.2 基因治疗在骨与软骨缺损治疗中的应用

2.2.1 目的基因的研究目前应用于骨与软骨缺损的基因主要包括骨形态发生蛋白2，4和转化生长因子，人Bcl-xl基因，人转化生长因子1等多种基因。

2.2.2 骨形态发生蛋白骨形态发生蛋白是目前证实对骨形成最强效的细胞因子，骨形态发生蛋白属于转化生长因子β超家族成员，在骨形态发生蛋白家族中对骨的形成起主要诱导作用的是骨形态发生蛋白2，4，7。王旭霞^[1]的研究中通过利用腺病毒做载体将骨形态发生蛋白2基因转染入成骨细胞内进行培养，碱性磷酸酶检测结果显示实验组与对照组之间有明显的差异，证实骨形态发生蛋白2基因可以促进成骨细胞向骨的分化。研究表明利用腺病毒介导骨形态发生蛋白2转染鼠肌母细胞，结果显示实验组骨缺损明显修复^[2]。Tang等^[3]将人骨形态发生蛋白2基因转染入骨髓间充质干细胞中黏附于羟基磷灰石，植入骨缺损部位。在植入后的第4周实验组有新骨形成，第8周缺损处有成熟的骨组织形成。孙洋等^[4]将人骨形态发生蛋白4复制腺病毒复合凝胶海绵直接植入SD大鼠的骨缺损处，术后8周实验组与对照组骨缺损均得到修复，但是实验组无论从成骨时间、成果效果、新生骨的数量等方面都优于对照组。Chen等^[5]将人骨形态发生蛋白7的质粒置于骨缺损区与自体骨移植组，支架移植组和空白组做比较，术后第4周各组骨密度比较差异具有显著性意义。Zhu等^[6]利用腺病毒做载体将骨形态发生蛋白7基因转染入骨髓间充质干细胞中与珊瑚黏附作为实验组，未转染的细胞与珊瑚黏附作为对照组共同植入羊的股骨缺损处。每月进行X射线和生物机械性检测，结果显示在植入第3个月实验组就有明显的骨再生，而对照组在第6个月的时候才出现，数据显示骨形态发生蛋白7基因可以促进骨的再生。有作者利用腺病毒将转化生长因子β1和骨形态发生蛋白7基因转染兔骨髓间充质干细胞，黏附于骨基质明胶移植修复同种异体兔关节软骨缺损，利用原位杂交技术检测实验组Ⅱ型胶原蛋白基因表达增多，细胞培养液中己糖醛酸水平明显升高^[7]。Li等^[8]将骨形态发生蛋白7基因转染入兔骨髓间充质干细胞中与纳米羟基磷灰石/聚酰胺支架黏附，置于兔的下颌骨缺损区，X射线，组织学和免疫组化分析，结果显示实验组较其他组较早的形成骨组织和矿物质沉积。

2.2.3 转化生长因子转化生长因子是转化生长因子超家族的一员，其包括转化生长因子β1，β2，β3三种亚型。3种亚型在调控细胞增殖分化和发育的过程中均起到重要的作用。近年对转化生长因子诱导各种来源的间充质干细胞向成骨和成软骨方向分化的影响越来越受到相关学者的关注。在丁然^[9]的实验中利用人转化生长因子β3基因转染前软骨干细胞，与未转染的前软骨干细胞分别植入KLD-12自组装纳米凝胶内在体外进行培养，实验组与对照组细胞周围均发现Ⅱ型胶原的沉积，且实验组Ⅱ型胶原染色阳性细胞率较对照组多。动物体内实验显示实验组有明显的软骨修复，而在对照组未观察到修复迹象。Cao等^[10]利用腺病毒将转化生长因子β1基因转移入骨髓间充质干细胞中，将其黏附于聚乳酸-羟基乙酸支架上，然后移植入兔的胫骨缺损处进行体内实验，结果显示实验组转化生长因子β1的表达高于对照组，免疫组化显示实验组较对照组与空白组有明显的成骨潜能。在转化生长因子β3联合骨形态发生蛋白2基因治疗猪关节软骨修复的实验^[11]，共转染的骨髓间充质干细胞复合脱钙骨植入猪的关节软骨缺损区，大体观察显示手术后2周缺损区域内填充组织呈暗红色，4周时修复组织色泽暗红中带有灰白，8周时缺损区呈白色不透明，软骨样组织填充，12周时修复组织与周围正常软骨组织基本融合在一起，色泽相近，质似软骨。而在未转染骨髓间充质干细胞复合脱钙骨组，单纯脱钙骨组在12周时与周围正常的软骨组织仍有明显的界限。

2.2.4 碱性成纤维细胞生长因子碱性成纤维细胞生长因子对多种细胞有促有丝分裂作用，能促进软骨细胞基质的分化及软骨细胞的增殖与成熟，促进软骨基质的合成，使蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成增多。在碱性成纤维生细胞长因子及SOX-9基因转染骨髓间充质干细胞修复关节软骨的实验^[12]，转染后的骨髓间充质干细胞联合聚乳酸-羟基乙酸在体外进行培养，通过ELISA法检测显示转染组碱性成纤维细胞生长因子蛋白含量较其他组高，复合体植入动物关节软骨缺损区进行体内实验，实验结果显示在12周时实验组软骨缺损已近修复，修复软骨与正常软骨整合良好，各层清晰，与正常软骨类似。空白对照组内修复组织内见少量的软骨样细胞，细胞形态异常，聚乳酸-羟基乙酸已降解，纤维组织填充。对照组(聚乳酸-羟基乙酸复合未转染骨髓间充质干细胞)见有部分软骨样细胞，软骨基质不明显，有纤维瘢痕组织，聚乳酸-羟基乙酸已降解。Song等^[13]研究利用病毒将碱性成纤维细胞生长因子基因转移到骨髓间充质干细胞内，用RT-PCR，Western Bolt检测碱性磷酸酶、骨钙素RNA和蛋白的表达明显增加。将转染细胞联合β磷酸钙盐一同植入动物体内骨缺损处，组织学染色显示实验组中骨含量和血管的密度明显高于未转染细胞组。Cao等^[14]将转染有碱性成纤维细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞黏附于聚乳酸-羟基乙酸支架上，植入兔关节缺损区，通过组织化学和免疫组化检测显示，转染组有软骨缺损区有明显的修复。

2.2.5 胰岛素样生长因子基因胰岛素样生长因子是最近发现的一种具有骨生成诱导蛋白，其中胰岛素样生长因子1和胰岛素样生长因子3具有成骨作用，是成骨细胞分化的正调节因子，可以促进多种骨诱导因子的分泌，促进骨钙素的分泌和骨结节的形成，主要在骨的矿物化过程中发挥重要作用。胰岛素样生长因子3基因转染骨髓间充质干细胞进行体外培养^[15]，结果显示骨生长标志基因骨钙素、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶的表达明显增加，矿化结节染色阳性，而未转染组除了Ⅰ型胶原有轻度的表达外，其余为阳性结果。将转染细胞以凝胶海绵为支架植入骨缺损部位，X射线观察骨的缺损愈合情况，苏木精-伊红染色观察组织的生长状况、成骨细胞和成纤维细胞的分布情况。结果显示实验组骨缺损得到了修复，实现了骨连接，但未转染组没有见骨缺损的修复，骨断端为纤维组织连接。Lattanzi 等^[15]将人胰岛素样生长因子3通过腺病毒转染入真皮纤维母细胞，将转染后的纤维母细胞复合于羟基磷灰石和胶原的复合支架材料上修复小鼠骨缺损，结果显示转染组骨缺损区骨修复较其他组明显。在胰岛素样生长因子1基因治疗骨缺损的实验^[16-17]，利用腺病毒将胰岛素样生长因子3转染入兔的骨髓间充质干细胞，建立胫骨缺损的新西兰大白兔模型，以聚乳酸-羟基乙酸为支架材料，结果显示在4，8周时阳性对照组和Ad-LMP-1转染组的成骨数量明显增加，随着时间延长，成骨均以线性增长，Ad-LMP-1转染组的成骨量则显著高于阳性对照组，说明Ad-LMP-1可促进成骨量增加。Parrilla等^[18]将胰岛素样生长因子3转染入兔上皮纤维母细胞联合羟基磷灰石/胶原支架植入兔子的骨缺损区，术后第3周在缺损区可以明显观察到自体成骨细胞的出现，但是在未转染细胞组和空白对照组未见明显的骨形成。

2.2.6 血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子是最有活力的血管生长因子，可以直接或间接影响血管再生的各个环节，贯穿骨折修复的全过程。刑艳莉等^[19]将重组人骨形态发生蛋白4和血管内皮生长因子121按比例混合成双基因混悬液直接注入骨的桡骨缺损区中，与注入重组人骨形态发生蛋白4组，注入血管内皮生长因子121组和空白对照组做比较，术后12周观察，混合实验组缺损区可见大量的新生编织骨样组织，内含大量的成骨细胞和骨陷窝，骨痂改建成熟，骨髓腔再通。重组人骨形态发生蛋白4组缺损区骨小梁结构中见多量增生活跃的成骨细胞，小梁骨减少，由新生编织骨替代，骨板排列无规律，形成致密板层骨，骨性骨痂大部分改建，骨髓腔部分再通。血管内皮生长因子121组缺损区可见大量的网状骨小梁结构，期间富余血管，可见到新生的类骨质形成，类骨质内增生活跃立方形的成骨细胞大量存在，有大量的软骨细胞。空白组缺损区边缘有部分不规则的骨小梁结构，缺损中央区为大量的纤维结缔组织。证实血管内皮生长因子能促进软骨内成骨及骨折愈合过程中的血管再生。Keeeny 等^[20]将转染入血管内皮生长因子165质粒与胶原/磷酸钙支架一同植入动物的骨缺损区，植入后观察发现转染组的骨体积是未转染组的两倍。

2.2.7 SOX基因 SOX基因家族是一个新发现的基因家族，其主要特征是具有一个保守基序-HMG-box，可以和DNA进行序列特异性的结合。该家族在胚胎发育、性别分化、神经系统及骨骼系统发育过程中起着重要的作用。SOX-9蛋白被认为是该家族中对骨骼系统发育最有影响的一员。SOX-9转染骨髓间充质干细胞以聚乳酸-羟基乙酸为支架修复骨缺损动物模型^[20]，苏木精-伊红染色显示在12周时软骨缺损已修复，软骨细胞成熟，细胞外有大量软骨基质，并有大量的胶原纤维。Im等^[21]利用电穿透将SOX-5，SOX-6，SOX-9基因转染入人脂肪干细胞在体外培养21 d，利用RT-PCR和western blot检测SOX-5、SOX-6、SOX-9、COL1A1、COL2A1和COL10A1的基因和蛋白呈阳性表达。把转染后的微粒植入SD大鼠的骨缺损区，3周后可见丰富的蛋白多糖，矿物质沉积明显的减少。

2.2.8 Bcl-xl基因 Bcl-xl是细胞程序性凋亡基因家族Bcl-2基因蛋白家族的重要成员之一，研究表明Bcl-xl可通过多种途径来抑制各种凋亡诱导因素例如营养匮乏、辐射等多种导致的细胞凋亡，较Bcl-2具有更好的抗凋亡作用。除了抗凋亡作用，Bcl-xl还具有一定的抗炎作用。有作者将Bcl-xl-BMSCs胶原植入动物骨缺损处，术后第12周Bcl-xl-BMSCs胶原组的修复组织呈现类透明软骨样组织，组织厚度、边缘密合情况均较满意^[22]。

参考文献

[1] 王旭霞.膜引导结合Adv-BMP-2局部基因治疗老年性骨缺损的实验研究[D].济南:山东大学,2008.

[2] 焦鲲,罗树林,尹峰. 腺病毒介导的骨形态发生蛋白-2基因治疗骨缺损的研究[J].上海交通大学学报:医学版,2009,29(2):171-176.

[3] Tang Y, Tang W, Lin Y,et al. Combination of bone tissue engineering and BMP-2 gene transfection promotes bone healing in osteoporotic rats. Cell Biol Int. 2008;32(9):1150-1157.

[4] 孙洋,赵宇,汪春兰,等.骨形态发生蛋白4转基因治疗大鼠的胫骨缺损[J].中国组织工程研究与临床康复, 2007,11(19): 3778-3780.

[5] Chen JC, Winn SR, Gong X,et al. rhBMP-4 gene therapy in a juvenile canine alveolar defect model.Plast Reconstr Surg. 2007;120(6):1503-1509.

[6] Zhu L, Chuanchang D, Wei L,et al. Enhanced healing of goat femur-defect using BMP7 gene-modified BMSCs and load-bearing tissue-engineered bone. J Orthop Res. 2010; 28(3):412-418.

[7] 龙华,袁华,马保安,等. 腺病毒介导TGF-β1及BMP-7基因共表达感染骨髓基质干细胞修复兔关节软骨缺损[J]. 中国骨与关节损伤杂志, 2008;23(6):471-474.

[8] Li J, Li Y, Ma S,et al. Enhancement of bone formation by BMP-7 transduced MSCs on biomimetic nano-hydroxyapatite/ polyamide composite scaffolds in repair of mandibular defects. J Biomed Mater Res A. 2010;95(4): 973-981.

[9] 丁然. 运用转染hTGF-β3基因的前软骨干细胞与自组装纳米肽支架KLD-12治疗软骨缺损的研究[D].武汉:华中科技大学,2010.

[10] Cao YG, Wang R, Song K,et al. Effects of transforming growth factor-beta1 gene therapy on bone rarefaction around endosseous implant. Hua Xi Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 2007; 25(4):335-338.

[11] 金耀峰. TGF-β3、BMP-2双基因转染的骨髓基质干细胞联合DBM修复关节软骨缺损的实验研究[D]. 昆明:昆明医学院,2010.

[12] 徐忠世. bFGF及SOX-9基因转染骨髓基质细胞组织工程修复软骨缺损[D].武汉:华中科技大学,2009.

[13] Song K, Rao NJ, Chen ML,et al. Enhanced bone regeneration with sequential delivery of basic fibroblast growth factor and sonic hedgehog. Injury. 2011;42(8):796-802.

[14] Cao B, Xu ZS, Xiao DM,et al. Biocompatibility of polylactic-co-glycolic acid for culturing bFGF gene-transfected bone marrow stromal cells and application of the cell complex for repairing rabbit cartilage defect. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 2009;29(6):1123-1126.

[15] Lattanzi W, Parrilla C, Fetoni A,et al. Ex vivo-transduced autologous skin fibroblasts expressing human Lim mineralization protein-3 efficiently form new bone in animal models.Gene Ther. 2008;15(19):1330-1343.

[16] 杨渝勇. LMP-3基因转移对骨髓间充质干细胞的调节作用及其用于治疗骨缺损的研究[D]. 重庆:重庆医科大学,2008.

[17] 鲜成树,王科学,吴勇刚,等. 腺病毒介导LMP-1基因治疗骨缺损的实验研究[J].现代预防医学, 2011,38(8): 1511-1513.

[18] Parrilla C, Lattanzi W, Rita Fetoni A,et al. Ex vivo gene therapy using autologous dermal fibroblasts expressing hLMP3 for rat mandibular bone regeneration. Head Neck. 2010;32(3):310-318.

[19] 邢艳莉,汪春兰,曹东升,等. 双基因rhBMP-4/VEGF121在治疗兔桡骨缺损中的作用[J].安徽医科大学学报,2010,45(2): 172-175.

[20] Keeney M, van den Beucken JJ, van der Kraan PM,et al.The ability of a collagen/calcium phosphate scaffold to act as its own vector for gene delivery and to promote bone formation via transfection with VEGF(165). Biomaterials. 2010;31(10): 2893-2902.

[21] Im GI, Kim HJ. Electroporation-mediated gene transfer of SOX trio to enhance chondrogenesis in adipose stem cells. Osteoarthritis Cartilage. 2011;19(4):449-457.

[22] 胡彬. 人Bcl-xL基因的克隆、表达及其修饰的骨髓基质干细胞用于兔关节软骨缺损修复的实验研究[D].西安:第四军医大学,2009.