威灵仙提取物干预膝骨关节炎软骨细胞的生长活力

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.02.010

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (2): 241-246.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.02.010

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威灵仙提取物干预膝骨关节炎软骨细胞的生长活力

徐扬，桂鉴超，高峰，徐燕，王黎明，陆一鸣，尹昭伟

南京医科大学附属南京医院(南京市第一医院)骨科，江苏省南京市 210006

收稿日期:2012-05-13 修回日期:2012-09-04 出版日期:2013-01-08 发布日期:2013-01-08
通讯作者: 桂鉴超，主任医师，教授，南京医科大学附属南京医院(南京市第一医院)骨科，江苏省南京市 210006
作者简介:徐扬★，男，1987年生，汉族，江苏省常州市人，南京医科大学在读硕士，主要从事骨关节疾病的治疗和研究。1781828473@qq.com

Effect of radix clematidis extract on viability of knee osteoarthritis chondrocytes

Xu Yang, Gui Jian-chao, Gao Feng, Xu Yan, Wang Li-ming, Lu Yi-ming, Yin Zhao-wei

Department of Orthopedics, Nanjing Hospital of Nanjing Medical University (First Hospital of Nanjing), Nanjing 210006, Jiangsu Province, China

Received:2012-05-13 Revised:2012-09-04 Online:2013-01-08 Published:2013-01-08
Contact: Gui Jian-chao, Chief physician, Professor, Department of Orthopedics, Nanjing Hospital of Nanjing Medical University (First Hospital of Nanjing), Nanjing 210006, Jiangsu Province, China
About author:Xu Yang★, Studying for master’s degree, Department of Orthopedics, Nanjing Hospital of Nanjing Medical University (First Hospital of Nanjing), Nanjing 210006, Jiangsu Province, China 1781828473@qq.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年来研究显示关节软骨细胞过度凋亡是骨性关节炎开始和进展的关键因素，利用药物抑制软骨细胞凋亡来控制骨性关节炎的进展是现在的研究热点。而威灵仙在国内临床治疗骨关节炎时取得了较确切的疗效，但是其具体的作用机制是否通过抑制软骨细胞凋亡来实现尚未见相关报道。
目的：观察中药威灵仙提取物对膝骨关节炎软骨细胞生长活力的影响。
方法：取骨关节炎晚期行膝关节置换的关节软骨，剪碎后，采用酶消化法消化细胞，将处于对数生长期第3代细胞随机分组，实验组分别加入0.01，0.05，0.1，0.5，1.0 g/L威灵仙提取物培养基，对照组仅加入普通培养基进行培养。Live/Dead染色法测定人软骨细胞活力指数，TUNEL染色法测定人软骨细胞凋亡指数。
结果与结论：0.05，0.1 g/L威灵仙提取物能明显提高软骨细胞活力，而0.5，1.0 g/L威灵仙提取物反而降低了软骨细胞活力，其活力指数与对照组比较差异均有显著性意义(P < 0.05)；0.01，0.05，0.1 g/L威灵仙提取物能有效抑制软骨细胞凋亡，1.0 g/L威灵仙提取物反而促进了软骨细胞凋亡，其凋亡指数与对照组比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。结果可见威灵仙提取物在合适的质量浓度时能有效提高人软骨细胞活力，抑制人软骨细胞凋亡，尤以0.1 g/L时效果最佳。

关键词: 组织构建, 软骨组织构建, 威灵仙, 软骨细胞, 骨关节炎, 凋亡, 细胞活力, 凋亡指数, 活力指数, 组织构建图片文章

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, studies have shown that excessive apoptosis of articular chondrocytes is the key factor for the start and progress of osteoarthritis. To study the progress in the use of drugs that inhibit apoptosis of chondrocytes to control osteoarthritis has become a hotspot. Clematis has obtained exact effect in the domestic clinical treatment of osteoarthritis, but the specific mechanism underlying
inhibition of chondrocytes apoptosis has not been reported.
OBJECTIVE: To observe the effect of radix clematidis extract on cell viability of the knee osteoarthritis chondrocytes.
METHODS: Joint cartilage was shredded after harvested from the patients of osteoarthritis undergoing the knee replacements, and chondrocytes were isolated and cultured by the way of enzymatic digestion. The third-passage cells in the logarithmic growth phase were cultured in vitro and randomly divided into six groups after adherence. The experimental groups were cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, and 1.0 g/L radix clematidis extract, while the control group was given normal medium alone. Live/Dead assay method was adopted to observe the effect of radix clematidis extract with different concentrations on cell viability of the knee osteoarthritis chondrocytes, and TUNEL method was used to assay apoptosis index of the knee osteoarthritis chondrocytes.
RESULTS AND CONCLUSION: 0.05 and 0.1 g/L radix clematidis extracts increased cell viability of chondrocytes, while 0.5 and 1.0 g/L radix clematidis extracts decreased the cell viability of chondrocytes. There was a significant difference in the cell viability between 0.05, 0.1, 0.5, 1.0 g/L radix clematidis extract groups and the control group (P < 0.05). 0.01, 0.05, 0.1 g/L radix clematidis extracts effectively inhibited apoptosis of chondrocytes, while 1.0 g/L radix clematidis extract promote the apoptosis of chondrocytes. There was a significant difference in the apoptotic index between 0.01, 0.05, 0.1, 1.0 g/L radix clematidis extract groups and the control group (P < 0.05). The appropriate concentration of radix clematidis extract could improve chondrocytes viability and restrain chondrocytes apoptosis, and the peak was at 0.1 g/L group. But excessive concentration of radix clematidis extract could reduce chondrocytes viability and promote chondrocytes apoptosis, representing the toxic effects on human articular chondrocytes.

Key words: tissue construction, cartilage tissue construction, clematis, chondrocytes, osteoarthritis, apoptosis, cell viability, apoptosis index, viability index, tissue construction photographs-containing paper

中图分类号:

R318

徐扬，桂鉴超，高峰，徐燕，王黎明，陆一鸣，尹昭伟. 威灵仙提取物干预膝骨关节炎软骨细胞的生长活力[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(2): 241-246.

Xu Yang, Gui Jian-chao, Gao Feng, Xu Yan, Wang Li-ming, Lu Yi-ming, Yin Zhao-wei. Effect of radix clematidis extract on viability of knee osteoarthritis chondrocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(2): 241-246.

图/表（结果） 4

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引言

材料方法

设计：随机区组设计对照实验。

时间及地点：于2011年11月至2012年2月在南京市第一医院骨科实验室完成。

材料：

关节软骨：取自8例膝关节置换患者，其中男2例，女6例，年龄65-80岁，平均年龄69岁。参与研究的患病个体同意将其诊疗经过信息用于科学研究，研究方案经伦理委员会审查和同意。

威灵仙提取物：由威灵仙干品(西安澳晶科技发展有限公司)按照30∶1比例水提而成^[4]，精细粉末，主要有效化学成分为原白头翁素(分子式C₅H₄C₂，相对分子质量96.08)和白头翁素(分子式C₁₀H₈O₄，相对分子质量192.16)。

实验方法：

软骨细胞的分离和培养：参考文献[5]方法，无菌条件下切取人工关节置换后取下的关节软骨置于含双抗的PBS中，带入超净工作台作进行如下操作：用含双抗的PBS反复漂洗3次，眼科手术剪剪除附着软骨块的骨膜及滑膜，并将软骨块剪碎至1 mm³大小，依次用0.25%胰蛋白酶、0.2%Ⅱ型胶原酶消化，终止消化，取消化液离心8 min(1 500 r/min，离心半径13.5 cm)，弃上清，加入完全培养基4 mL重悬细胞，接种到培养皿中，静置 37 ℃、体积分数5%CO₂的培养箱中培养，每隔两三天换液1次，按时在倒置显微镜下观察、拍照，当细胞增殖至皿底80%左右时按适当比例传代培养。

威灵仙培养基的制备：10 g威灵仙提取物溶解于 100 mL双蒸水，过滤除菌后，用完全培养基分别制成终质量浓度为0.01，0.05，0.1，0.5，1.0 g/L的威灵仙培养基，4 ℃保存备用。

细胞培养与分组：人软骨细胞培养于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液中、37 ℃、体积分数5% CO₂的培养箱中培养。实验组：用终质量浓度为0.01，0.05，0.1，0.5，1.0 g/L的威灵仙培养液培养。对照组：用普通培养液培养。

威灵仙对软骨细胞活力的影响：将样本分为实验组、对照组，采用文献[6]报道的LIVE/DEAD染色方法，将制备好的第3代细胞爬片用HBSS漂洗3次，分别用0.2%SYTO10和0.2%DEAD RED试剂室温避光反应 15 min，用新鲜的HBSS漂洗2次，新鲜配制的4%戊二醛固定15 min，中性树胶封固后在荧光显微镜下观察。

威灵仙对软骨细胞凋亡的影响：将样本分为实验组、普通对照组、阳性对照组，采用文献[6]报道的TUNEL染色方法，将晾干的细胞爬片用40 g/L多聚甲醛室温固定1 h，4 ℃的体积分数为70%乙醇中放置过夜，以改善细胞的渗透性浸入封闭液中，新鲜配制的体积分数为3% H₂O₂室温封闭10 min，新鲜配制的0.1%TritonX-100通透液8 ℃促渗2 min。

预处理好的爬片PBS漂洗2次，干燥后每个爬片滴加50 μL TdT酶反应液，加盖玻片37 ℃避光湿润反应 60 min，PBS漂洗3次，500 μL DAPI工作液洗1次，再加500 μL DAPI工作液，37 ℃染色15 min。甲醇漂洗 1次，甘油封固，分别用波长450-500 nm的紫外光激发(绿)和340-380 nm的紫外光激发(蓝)，荧光显微镜下观察并拍照。

主要观察指标：

LIVE/DEAD染色法测定不同威灵仙药物浓度下软骨细胞活力的变化：荧光显微镜下，每张爬片选5个高倍视野，采用Imagine J软件计数其中有活力的软骨细胞总数(绿色)和失去活力的软骨细胞总数(红色)。

TUNEL染色法测定不同威灵仙药物浓度下软骨细胞凋亡率的变化：荧光显微镜下，每张爬片选5个高倍视野，采用Imagine J软件计数其中TUNEL阳性细胞数和DPAI复染的细胞总数。

统计学分析：采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析。软骨细胞活力指数和凋亡指数的组间比较用t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义，P > 0.05为差异无显著性意义。

讨论

细胞凋亡是一个正常的生理过程，是一种由基因调控的主动地去除非需要或损伤细胞的程序性死亡过程，然而过度凋亡则是病理性的。本文作者和其他学者在骨关节炎软骨损伤的动物模型研究中发现，软骨细胞凋亡与软骨基质中的纤维连接蛋白的表达成正相关，并与软骨破坏的程度成正相关^[7-11]。Weng等^[12]在大鼠骨关节炎动物模型研究中发现，减轻凋亡能够降低软骨的破坏。而Hashimoto研究发现骨关节炎软骨细胞凋亡明显高于正常关节软骨细胞，且骨关节炎软骨细胞凋亡主要由一氧化氮和Fas两种途径介导，两者相互独立，同时软骨细胞凋亡受到bcl-2和bax基因调控，Bcl-2 mRNA表达的升高保护软骨细胞免遭凋亡，Bax mRNA的升高可以引起软骨细胞凋亡^[13]。因此利用药物抑制软骨细胞凋亡来防治骨关节炎逐渐成为大家研究的热点。

实验中采用的中药威灵仙皂含白头翁素、白头翁内酯、甾醇、糖类、皂甙、内酯、酚类、氨基酸等化学成分，主要的功效是祛风除湿，通络止痛，消痰水，散癖积。临床上用来主治痛风顽痹、风湿痹痛，肢体麻木，腰膝冷痛，筋脉拘挛，屈伸不利，脚气，疟疾，症瘕积聚，破伤风，扁桃体炎，诸骨鲠咽^[14-15]。在既往的研究中已被证实能够保护关节软骨，从而延缓骨关节炎的发展。

陈飞雁等^[16]发现威灵仙主要通过以下途径对骨关节炎产生防治作用：含有软骨细胞合成代谢的主要成分，促进和维持软骨细胞合成蛋白多糖和Ⅱ型胶原；抑制白细胞介素1β等细胞因子，阻止白细胞介素1β及其下游分子对软骨的损伤效应。马勇等^[17]发现威灵仙能促进软骨细胞增殖及转化生长因子β1 mRNA 的表达，这可能是其治疗骨关节炎的作用及可能机制之一。而威灵仙对软骨细胞活力和凋亡的影响尚未有报道。

实验用LIVE/DEAD染色法研究不同质量浓度威灵仙对体外培养的膝骨关节炎软骨细胞活力的影响，结果显示0.01，0.05，0.1 g/L质量浓度威灵仙组较普通对照组软骨细胞的生长活力明显提高，尤以0.1 g/L威灵仙组的提升效果最为明显。而0.5，1 g/L质量浓度威灵仙组较普通对照组失去活力细胞数目明显增加，细胞生长活力显著降低。而采用TUNEL染色法研究不同质量浓度威灵仙对体外培养的膝骨关节炎软骨细胞凋亡的影响，结果同样显示0.01，0.05，0.1 g/L质量浓度威灵仙组较普通对照组软骨细胞凋亡数明显减少，尤以0.1g/L威灵仙组细胞凋亡抑制效果最为明显。而0.5，1 g/L质量浓度威灵仙组较普通对照组凋亡细胞数目增加，表现为促软骨细胞凋亡效果。作者分析认为威灵仙对膝骨关节炎软骨细胞生长活力的影响与药物的质量浓度、药物在细胞内的作用机制、信号传导途径及调控因子和软骨细胞的生存环境等多因素密切相关。

通过此实验结果，可以提出以下假设：威灵仙质量浓度在0.01-0.1 g/L时，药物与细胞表面受体结合，随着质量浓度的增高，药物有效成分与受体结合越来越多，受体亲和力及细胞生长环境也越来越好，提高软骨细胞活力和抑制软骨细胞凋亡的效果也越来越明显，且在0.1 g/L时达到最佳药物有效浓度。一旦威灵仙质量浓度达到0.5 g/L时，因为细胞表面受体已经饱和，而药物浓度过高又导致软骨细胞的生长环境发生显著的改变，药物的作用效果出现逆转，威灵仙对软骨细胞产生毒性反应，药物效果表现为降低软骨细胞活力和促进软骨细胞凋亡，且浓度越高对细胞的毒性越大。

目前中医药对软骨细胞凋亡影响的研究已经有了很大的进展。朱萱萱等^[18]发现痛痹颗粒及拆方的含药血清能够促进软骨细胞增殖，通过降低软骨细胞分泌一氧化氮来抑制软骨细胞的凋亡。张世华等^[19]研究发现补肾壮骨胶囊能有效抑制软骨细胞凋亡，防治骨性关节炎，其作用机制与抑制bax，促进bcl-2表达有关。这些研究都为下一步的研究提供了方向和理论依据。因此，接下来课题组将主要从威灵仙能否抑制软骨细胞分泌一氧化氮，能否有效控制滑膜炎症以及能否影响软骨细胞凋亡的相关癌基因的表达等方面入手研究威灵仙抑制软骨细胞凋亡，提高软骨细胞活力的具体作用机制。

通过该实验发现威灵仙多糖作为软骨保护药物在合适的药物浓度下的确对提高骨关节炎软骨细胞的生长活力具有积极作用，但是由于其成分比较复杂，所需的调节环境和调节机制也很复杂，在真正应用于临床治疗骨关节炎上还需要更进一步的实验室研究和临床药物验证。

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