自体外周血干细胞移植治疗周围神经损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.01.029

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (1): 181-185.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.01.029

• 干细胞临床实践 clinical practice of stem cells • 上一篇

自体外周血干细胞移植治疗周围神经损伤

金文虎，魏在荣，孙广峰，唐修俊，王达利

遵义医学院附属医院烧伤整形外科，贵州省遵义市 563003

收稿日期:2012-04-28 修回日期:2012-05-26 出版日期:2013-01-01 发布日期:2013-01-01
通讯作者: 魏在荣，教授，硕士生导师，遵义医学院附属医院烧伤整形外科，贵州省遵义市 563003 zairongwei@sina.com.cn
作者简介:金文虎★，男， 1982年生，黑龙江省密山市人，朝鲜族，2009年遵义医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事创伤修复研究。jinwenhu1982@163.com

Autologous peripheral blood stem cell transplantation for treatment of peripheral nerve injury

Jin Wen-hu, Wei Zai-rong, Sun Guang-feng ,Tang Xiu-jun, Wang Da-li

Department of Burn and Plastic Surgery, Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563003, Guizhou Province, China

Received:2012-04-28 Revised:2012-05-26 Online:2013-01-01 Published:2013-01-01
Contact: Wei Zai-rong, Professor, Master’s supervisor, Department of Burn and Plastic Surgery, Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563003, Guizhou Province, China zairongwei@sina.com.cn
About author:Jin Wen-hu★, Master, Attending physician, Department of Burn and Plastic Surgery, Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563003, Guizhou Province, China jinwenhu1982@163.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：关于神经干细胞对周围神经损伤的治疗已有多篇报道，但外周血干细胞对周围神经损伤治疗鲜有报道。
目的：探讨自体外周血干细胞移植治疗周围神经损伤使失神经骨骼肌重获神经再支配的临床应用。
方法：应用外周血干细胞治疗周围神经损伤6例，同时与周围神经损伤单纯行神经断端吻合或神经移植10例比较。2组患者术后常规肌注鼠神经生长因子一两个疗程，同时给予针灸、理疗、经皮电刺激治疗及功能康复训练。
结果与结论：两组患者随访均超过6个月。干细胞移植组运动神经传导速度和感觉神经传导速度的恢复率要明显高于单纯神经吻合组。提示周围神经损伤后给予修复局部用外周血干细胞移植能够使远端失神经骨骼肌早期重新获得神经再支配。

关键词: 干细胞, 干细胞临床实践, 周围神经, 神经移植, 神经再生, 干细胞, 自体外周血干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Neural stem cells for treatment of peripheral nerve injury have been much reported. But few studies are reported regarding peripheral blood stem cells for treatment of peripheral nerve injury.
OBJECTIVE: To investigate the clinical application of autologous peripheral blood stem cells transplantation reinnervating denervated skeletal muscle in the treatment of peripheral nerve injury.
METHODS: Six patients received peripheral blood stem cells transplantation for treatment of peripheral nerve injury. At the same time, 10 controls received only anastomosis or nerve transplantation. All patients were intramuscularly administered mouse nerve growth factors one or two treatment courses. In addition, acupuncture, physical therapy, transcutaneous electrical stimulation and functional rehabilitation were also given.
RESULTS AND CONCLUSION: Two groups of patients were followed up over 6 months. The motor nerve and sensory nerve recovered better in patients who received peripheral blood stem cells transplantation than in patients who underwent simple neural anastomosis. These findings suggest that peripheral blood stem cells transplantation can reinnervate the distal denervated skeletal muscle after peripheral nerve injury.

Key words: stem cells, clinical practice of stem cells, peripheral nerve, neural transplantation, neural regeneration, stem cells, autologous peripheral blood stem cells

中图分类号:

R394.2

金文虎，魏在荣，孙广峰，唐修俊，王达利. 自体外周血干细胞移植治疗周围神经损伤[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(1): 181-185.

Jin Wen-hu, Wei Zai-rong, Sun Guang-feng,Tang Xiu-jun, Wang Da-li. Autologous peripheral blood stem cell transplantation for treatment of peripheral nerve injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(1): 181-185.

图/表（结果） 4

2.1 外周血干细胞采集质量所采集的外周血干细胞样本单个核细胞比例及CD34⁺细胞比例见表1，6例患者外周血单个核细胞比例均数为(92.08±1.93)%，CD34⁺细胞比例为(1.43±0.35)%。

表1 患者外周血干细胞采集质量比较

Table 1 Collection quality of peripheral blood stem cells

2.2 参与者数量分析纳入患者16例，分为2组，按意向性处理分析均进入结果分析。

2.3 两组患者基线资料比较年龄及神经受伤时间分别用t 检验(P > 0.05)，2组在年龄及神经损伤时间上无明显区别。见表2。

表2 两组基线资料比较

Table 2 Comparison of baseline information between stem cells transplantation group and neural anastomosis group

2.4 两组患者术后6个月运动神经传导速度及感觉神经传导速度检测值及与健侧比较恢复率和患肢肌力 2组共16例患者术后伤口全部Ⅰ期愈合。连续均超过随访6个月，最长随访24个月。于术后6个月通过肌电图中运动神经传导速度和感觉神经传导速度，肌力等对比检查发现干细胞移植组神经功能恢复要明显好于单纯神经吻合组。干细胞移植组运动神经传导速度和感觉神经传导速度的恢复率要明显高于单纯神经吻合组，并且肌力恢复也比较理想，见表3。

表3 两组患者术后6个月运动神经传导速度及感觉神经传导速度检测值及与健侧比较恢复率和患肢肌力

Table 3 Motor/sensory nerve conduction velocities, recovery rate relative to healthy side, and muscular power of the affected limb at 6 mon after surgery

2.5 典型病例介绍见图1。
患者男，26岁，因在外院行右小腿包快切除后伴活动障碍5 d入院。入院查体：患者右足下垂，右踝关节、右足各趾不能背屈，第1趾蹼感觉功能障碍。右小腿外侧、足背感觉功能未见异常。诊断为右小腿神经鞘瘤切除后右腓总神经损伤(运动支缺损，感觉支不全离断)，入院后完善辅助检查后行右腓总神经探查，发现右腓总神经部分缺损，缺损长度约7 cm，切取同侧腓肠神经约7 cm桥接移植修复，同时行自体外周血干细胞移植。干细胞移植后连续随访16个月，第13个月到上海复旦大学附属华山医院复诊，肌电图提示右腓总神经损伤术后：腓总神经支配肌均可见募集反应(单纯组-单存混合组)，刺激可引出复合肌肉动作电位。彩超提示：右侧腓总神经移植段两吻合口神经对位良好。患者查体：右足踝关节，右足各趾有背屈功能，肌力4级，已能自由行走。右足感觉和对侧无明显差异。患者右足运动功能恢复比较理想。
2.6 干细胞移植后不良反应干细胞移植后患者均未发生发热、过敏、免疫等局部或全身反应。

图1 右腓肠神经移植修复右腓总神经及术后随访

Figure 1 Photographs regarding repair of right peroneal nerve injury by right sural nerve grafting and postoperative follow-up examination

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引言

材料方法

设计：分组对比观察。

时间及地点：实验于2009年1月至2011年1月在遵义医学院附属医院细胞工程实验室及手术室共同完成。

对象：选择同期前来遵义医学院附属医院烧伤整形外科就诊的周围神经损伤患者，入院距神经损伤时间从2 h-1个月不等。

诊断标准：经临床症状、体征及神经诱发电位监测明确诊断周围神经损伤。

纳入标准：①明确诊断周围神经损伤采用自体外周血干细胞治疗者。②明确诊断周围神经损伤采用单存行神经断端吻合或移植治疗者。③患者对治疗均知情同意，并签署知情同意书。

排除标准：①患者查体有轻度神经损伤表现，肌力≥4级。②但辅查及术中探查无明显损伤。③手术中探查神经离断断面不足断面面积1/4、神经有卡压，但无明显神经纤维的变性改变。

将符合标准的患者分为自体外周血干细胞移植组和单纯神经断端吻合或神经移植组。其中外周血细胞移植组患者6例，男性5例，女性1例；年龄21-49岁，平均年龄为34岁；分别为上臂桡神经损伤1例，腓骨头附近腓总神经缺损1例，上臂尺神经卡压1例，上臂尺神经断裂1例，大腿中段坐骨神经断裂1例，腓骨头附近腓总神经断裂1例；单纯神经断端吻合或神经移植组10例，男性8例，女性2例；年龄18-48岁，平均年龄为32岁；其中上臂桡神经损伤2例，上臂尺神经损伤2例，上臂正中神经离断1例，前臂正中神经、尺神经损伤各1例，大腿坐骨神经离断1例，小腿上段胫神经离断1例，腓骨头处腓总神经离断1例。

方法：

干细胞移植组：

外周血干细胞的动员：患者于入院当日签署干细胞治疗知情同意书，第2日起开始皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子(北京四环生药业)0.15 mg/(kg•d)，于第3，4日改为0.075 mg/(kg•d)。每日监测血常规，待白细胞增至(20-30)×10⁹ L^-¹行外周血干细胞采集。

外周血干细胞的采集与鉴定：采用费森尤斯血细胞分离机选用干细胞采集程序收集外周血干细胞，根据患者当日血常规值设定采集参数，全血流速为50 mL/min，全血与抗凝剂比例为10∶1，每循环收集的白膜量为6.5-7.0 mL，共收集4-6个循环。采集后取少量样本行流式细胞术鉴定采集物中单个核细胞及CD34⁺细胞比例。

外周血干细胞移植：患者于外周血干细胞采集当日行干细胞移植，选用臂丛或蛛网膜下腔麻醉方式。术中仔细探查游离损伤神经近远端，修整神经外膜，切除病变及变性神经纤维，对合神经断端，吻合神经外膜。将所采集的外周血干细胞于吻合断端前后5-10 cm范围内间隔1 cm注射0.5-1.0 mL至神经外膜及周边组织，以吻合口为中心用浸有外周血干细胞的胶原蛋白包裹其远近两端8-10 cm，最后覆盖莱维生物补片，缝合肌肉皮肤。再沿神经走形方向每间隔2.0-3.0 cm肌肉注射外周血干细胞约1 mL。若有缺损采用变换肢体位置或神经移植法吻合神经。

单纯神经断端吻合组：仅行神经吻合或神经移植术。

移植后处理：干细胞及神经吻合或神经移植后每组病员均行抗炎、止血处理及常规肌注相同剂量的鼠神经生长因子(金路捷，20 μg/支，武汉海特制药)20 μg/d，28 d为1个疗程，治疗一两个疗程，同时予以针灸、理疗、经皮电刺激治疗及功能康复训练。

主要观察指标：①所采集的外周血干细胞的单个核细胞及CD34⁺细胞含量。②两组患者治疗前后运动神经传导速度、感觉神经传导速度及肌力的变化。

统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件进行分析，所得数据以x(_)±s表示，两组比较采用t 检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

目前治疗神经离断主要是通过精细的显微外科技术能够较快地恢复损伤神经，它可以恢复神经纤维解剖上的连续性。利用近端神经再生时具有特异性与选择性的特点，使再生神经纤维较准确的生长达到靶器官。同时应用其他的治疗方法为神经元及神经再生创造良好的微环境，最大程度恢复其支配功能。但神经再生目前仍被公认为以1 mm/d的速度缓慢进行的。在高位神经损伤行端端缝合后，由于距离长、再生速度慢、靶肌肉萎缩变性和运动终板退变等原因，极大地限制了功能的恢复^[3-4]。此外断端吻合后，吻合口及周边组织瘢痕愈合形成卡压致血-神经屏障破坏引起神经束膜水肿，进而引发结缔组织改变和有髓纤维脱髓鞘，最终导致神经功能丧失^[5]。

近年来随着对干细胞研究的不断深入，不断有报道采用干细胞移植方法治疗神经系统疾病，下肢血管缺血性疾病，心血管疾病，血液系疾病，免疫类等。干细胞在特定条件下，可按一定程序分化，形成新的功能细胞，移植到受体中可表现出多向分化潜能和很强的可塑性，这一特性使其成为替代衰老、修复受损组织的理想种子细胞。目前对造血干细胞的研究比较深入，它属于成体干细胞的一种，而外周血干细胞是骨髓经动员后被释放到血液中的造血干细胞^[6-7]，具备成体干细胞的特点。研究发现经动员的外周血中干细胞与正常骨髓中的于细胞数量相当^[8]，目前外周血干细胞发展迅速，几乎完全取代了利用骨髓作为干细胞的来源。外周血干细胞经过微环境及等诱导可转化为心肌细胞^[9-10]，神经细胞^[11-12]，血管内皮细胞^[13-15]。这些外周血干细胞可以用在以上方面，提示可能在外周神经损伤中发挥作用。此外，外周血干细胞除了具备干细胞的特点外，还具有取材方便、分离获取容易、免疫原性弱、安全性好，无需考虑伦理学问题等特点这些特点使外周血干细胞能在临床上大量开展及使用。

近来的关于干细胞促进周围神经生长的动物实验有较多报道，干细胞主要作用是促进了许旺细胞的生长从而促进神经纤维的恢复^[16-17]、临床应用中有报道应用脂肪干细胞^[18]，神经干细胞治疗周围神经损伤，但是鲜有关于自体外周血干细胞对周围神经损伤治疗的报道。本院自应用外周血干细胞治疗周围神经损伤以来，目前未发现有明显的毒性及排异反应，并且通过随访，患者均获得良好的感觉及运动功能。和上述几种干细胞治疗外周神经损伤相比，外周血干细胞具有取材方便、分离获取容易，免疫原性弱、安全性好等优势，这初步说明本方法是安全的。另外，在手术中用胶原蛋白包裹神经吻合口远近端8-10 cm，胶原蛋白外用莱维生物补片包裹。胶原蛋白内可浸入干细胞3 mL左右。胶原蛋白可使更多干细胞聚集在神经吻合口周围、吸收可遗留潜在腔隙，减少了瘢痕卡压。但是和所有干细胞移植一样是否会存在远期致肿瘤性等不良反应，如何更好的选择适应证，提高疗效，需更进一步研究。此外外周血干细胞提取及体外扩增需要一定的时间，提取后要在2 h内注射完毕，需要手术与实验室密切配合把握注射时间，否则细胞降解可能错过最佳治疗时机。

自体外周血干细胞移植治疗周围神经损伤

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