缺氧诱导因子1α基因转染脂肪干细胞与自体脂肪移植

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.01.017

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (1): 106-111.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.01.017

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缺氧诱导因子1α基因转染脂肪干细胞与自体脂肪移植

王和庚¹，黎洪棉^1，2，柳大烈³，南华³，赵培冉⁴，梁双武⁴

1 以往研究证实，缺氧诱导因子1α基因转染脂肪干细胞可促进移植脂肪组织局部的血管再生，促进脂肪细胞的成活，增加脂肪组织的质量保持率，减少脂肪移植术后的纤维坏死程度。
2 实验旨在观察缺氧诱导因子1α基因转染脂肪干细胞对自体移植脂肪组织存活率的影响。
3 实验的创新之处在于课题组进行了以缺氧诱导因子1α基因转染对人类脂肪源性基质细胞体外增殖影响及促进脂肪颗粒成活的实验研究，并证实缺氧诱导因子1α基因转染脂肪干细胞可促进移植脂肪组织局部的血管再生，促进脂肪细胞的成活，增加脂肪组织的质量保持率，减少脂肪移植术后的纤维坏死程度。

收稿日期:2012-04-19 修回日期:2012-05-18 出版日期:2013-01-01 发布日期:2013-01-01
通讯作者: 黎洪棉，教授，主任医师，硕士生导师，中山大学附属中山医院整形美容外科，广东省中山市 528403 binrong2112@163.com
作者简介:王和庚★，男，1972年生，硕士，副主任医师，主要从事烧伤整形临床与基础研究工作。drwanghegeng@126.com
基金资助:
中国博士后科学基金(20090450910)；广东省医学科研课题(A2011739)；中山市科技计划项目(20113A008)。

Hypoxia-inducible factor-1α gene transfected adipose-derived stem cells promote the survival of autologous fat grafts

Wang He-geng¹, Li Hong-mian^1,2, Liu Da-lie³, Nan Hua ³, Zhao Pei-ran⁴, Liang Shuang-wu⁴

1 Postdoctoral Research Center, Department of Plastic and Aesthetic Surgery, Affiliated Zhongshan Hospital of Sun Yat-Sen University, Zhongshan 528403, Guangdong Province, China
2 Postdoctoral Research Center, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
3 Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 501282, Guangdong Province, China
4 Research Center for Tissue Engineering, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China

Received:2012-04-19 Revised:2012-05-18 Online:2013-01-01 Published:2013-01-01
Contact: Li Hong-mian, Professor, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Plastic and Aesthetic Surgery, Affiliated Zhongshan Hospital of Sun Yat-Sen University, Zhongshan 528403, Guangdong Province, China binrong2112@163.com Wang He-geng and Li Hong-mian contributed equally to this paper.
About author:Wang He-geng★, Master, Associate chief physician, Postdoctoral Research Center, Department of Plastic and Aesthetic Surgery, Affiliated Zhongshan Hospital of Sun Yat-Sen University, Zhongshan 528403, Guangdong Province, China drwanghegeng@126.com
Supported by:
Supported by: China Postdoctoral Science Research Foundation, No. 20090450910*; Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province, No. A2011739*; Science and Technology Development Program of Zhongshan, No. 20113A008

摘要/Abstract

摘要：

背景：自体颗粒脂肪组织作为理想的填充材料用于美容与重建修复领域，但因其移植后组织大量被吸收，严重影响了远期效果。
目的：观察缺氧诱导因子1α基因转染脂肪干细胞对自体移植脂肪组织存活率的影响。
方法：取健康成年人吸脂术后的脂肪组织分离脂肪干细胞并行原代及传代培养，传至第3代，调整细胞浓度为1×109 L-1，经缺氧诱导因子1α基因转染后调整细胞浓度为1×1011 L-1备移植时使用；同时选用同一抽脂术后的脂肪组织颗粒并进行纯化，利用纤维蛋白胶的物理特性制备不同成分脂肪组织复合移植物，在20只裸鼠背部皮下随机分离3个腔隙，实验分为3组：基因修饰组移植经缺氧诱导因子1α基因修饰的脂肪干细胞+脂肪组织+纤维蛋白胶；基因未修饰组移植单纯脂肪干细胞+脂肪组织+纤维蛋白；生理盐水组移植生理盐水+脂肪组织+纤维蛋白。
结果与结论：移植后3个月和6个月，各组移植物血管密度比较，基因修饰组>基因未修饰组>生理盐水组，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；各组移植物脂肪细胞纤维坏死率比较，基因修饰组<基因未修饰组<生理盐水组，组间比较差异有显著性意义( P < 0.05)；各组移植物脂肪质量保持率比较，基因修饰组>基因未修饰组>生理盐水组，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)。结果证实，缺氧诱导因子1α基因转染脂肪干细胞可促进移植脂肪组织局部的血管再生，促进脂肪细胞的成活，增加脂肪组织的质量保持率，减少脂肪移植术后的纤维坏死程度。

关键词: 干细胞, 干细胞移植, 缺氧诱导因子1, 脂肪干细胞, 脂肪组织移植, 基因转染, 血管再生, 质量保持率, 省级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Autologous fat is an ideal filling material in aesthetic and reconstructive surgery. However, the long-term effects are poor because much tissue is absorbed after grafting.
OBJECTIVE: To investigate the effects of hypoxia-inducible factor-1α gene transfected adipose-derived stem cells on survival of autologous fat grafts.
METHODS: Adipose-derived stem cells were isolated from the subcutaneous adipose tissue of healthy adults after liposuction, primary cultured and sub-cultured. Passage 3 adipose-derived stem cells at a density of 1× 109 cells/L were transfected with hypoxia-inducible factor-1α gene. The cells were then adjusted to 1×1011 cells/L. Simultaneously, autologous fat from the same liposuction was selected and purified. The grafts were made according to physiological characteristics of fibrin glue. Three groups were designated. In the gene-modified group, hypoxia-inducible factor-1α gene-modified adipose-derived stem cells, autologous fat+fibrin glue were transplanted into the back of nude mice. In the non-gene-modified group, adipose-derived stem cells+autologous fat+fibrin glue were transplanted in the identical region. In the saline group, physiological saline+autologous fat+ fibrin glue were transplanted.
RESULTS AND CONCLUSION: At 3 and 6 months after transplantation, the vascular density in the graft was highest in the gene-modified group, followed by non-gene-modified group, and lastly the saline group and there was significant difference between groups (P < 0.05). Fiber necrosis rate of adipose-derived stem cells was lowest in the gene-modified group, followed by non-gene-modified group, and lastly the saline group and there was significant difference between groups (P < 0.05). Fat maintenance rate was highest in the gene-modified group, followed by non-gene-modified group, and lastly the saline group and there was significant difference between groups (P < 0.05). These findings suggest that hypoxia-inducible factor-1α gene transfected adipose-derived stem cells can accelerate the vascularization in the local fat graft transplanted, promote the survival of adipose cells, increase the mass maintenance rate of fat graft and lower the fibrosis necrosis degree after fat grafting.

Key words: stem cells, stem cell transplantation, hypoxia-inducible factor-1, adipose-derived stem cells, fat tissue transplantation, gene transfection, angiogenesis, mass maintenance rate, provincial grants-supported paper, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

王和庚，黎洪棉，柳大烈，南华，赵培冉，梁双武. 缺氧诱导因子1α基因转染脂肪干细胞与自体脂肪移植[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(1): 106-111.

Wang He-geng, Li Hong-mian, Liu Da-lie, Nan Hua, Zhao Pei-ran, Liang Shuang-wu. Hypoxia-inducible factor-1α gene transfected adipose-derived stem cells promote the survival of autologous fat grafts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(1): 106-111.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析实验选用裸鼠20只，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 脂肪干细胞形态学观察原代细胞培养6 h后开始有少量成纤维细胞样细胞散在贴壁，大部分未贴壁细胞为球形或圆形；24 h后大部分贴壁细胞呈宽大扁平的成纤维细胞样细胞，少量为三角形、多边形细胞；随培养时间延长，贴壁细胞呈大小不一的集落状生长，细胞呈典型的长梭形。传代后细胞形态主要为梭形，其生长速度较原代细胞明显增快；连续传代培养至15代，细胞未出现明显衰老现象，见图1a。脂肪干细胞经DiI标记后 24 h在荧光显微镜下观察标记阳性率超过95%以上，脂肪干细胞胞浆呈红色荧光，见图1b。

图1 倒置相差显微镜下观察第3代脂肪干细胞生长情况
(×200)

Figure 1 Growth of passage 3 adipose-derived stem cells under inverted phrase contrast microscope (×200)

2.3 各组动物脂肪组织移植后大体观察所有动物术后反应良好，未见异常，移植区未见炎症、血肿或血清肿。所有移植物均可容易地用血管钳剥离包膜后取出3个月时移植物呈圆球形或椭圆球形，直径1.0-1.5 cm，高0.4-0.7 cm，稍硬，有薄层纤维包膜。6个月时移植物仍为圆球形或椭圆球形，直径0.5-1.0 cm，高0.3- 0.5 cm，硬度有所增加。

图2 各组移植物3个月和6个月组织学观察(苏木精-伊红染色，×100)

Figure 2 Histomorphological observation of autologous fat grafts at 3 and 6 mon after transplantation (hematoxylin-eosin, ×100)

2.4 各组动物移植处脂肪组织组织学染色结果 3个月时基因修饰组标本脂肪内脂肪细胞清晰，未见明显的坏死迹象，其间极少存在纤维间隙；基因未修饰组与基因修饰组基本相似；生理盐水组标本脂肪内脂肪细胞基本清晰，可见部分的坏死迹象，其间存在较多纤维间隙。6个月与3个月比较，基因修饰组脂肪细胞减少不明显，纤维间隙较少，对照组脂肪细胞明显减少，纤维间隙较多，基因未修饰组情况介于基因修饰组、生理盐水组两组之间。计算机图像分析结果显示，在3个月和6个月时，基因修饰组与基因未修饰组、基因未修饰组与生理盐水组、基因修饰组与生理盐水组血管密度之间比较，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2，表1。

2.5 移植物脂肪细胞纤维坏死率通过点计数法分析结果显示，在3个月和6个月时，实验组移植物脂肪细胞纤维坏死率与对照组相比均明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)。见表2，图1。
2.6 脂肪组织质量保持率 3个月时，脂肪组织质量保持率显示，基因修饰组(88.75±3.23)%，基因未修饰组(73.69±3.05)%，生理盐水组(57.36±2.08)%，基因修饰组与基因未修饰组、基因未修饰组与生理盐水组、基因修饰组与生理盐水组之间比较，差异有显著性意义(P < 0.05)；6个月时，脂肪组织质量保持率显示，基因修饰组(80.17±3.08)%，基因未修饰组(69.75±2.67)%，生理盐水组(38.21±2.15)%，基因修饰组与基因未修饰组、基因未修饰组与生理盐水组、基因修饰组与生理盐水组之间比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。

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引言

材料方法

设计：细胞学实验及同体随机对照动物实验。

时间及地点：于2010年3至6月在南方医科大学组织工程研究中心完成。

材料：

实验动物：随机选裸鼠20只，平均体质量20 g，雌雄不拘，6-8周龄，由南方医科大学实验动物中心提供，有动物用标准饲料进行饲养；机构许可证号：SYXK(粤) 2005-0052，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

实验方法：

自体脂肪组织颗粒的提取：知情同意并签署手术知情同意书后，无菌条件下选取健康成年女性皮下脂肪吸脂术中吸出的脂质部分(脂肪组织颗粒)20 mL，用生理盐水洗净血液，备用。脂肪体积的计算方法为：将脂肪组织颗粒放入标记好液面的5 mL注射器中，使液面恰好上升0.3 mL，即获得0.3 mL体积的脂肪组织颗粒，0.3 mL脂肪颗粒湿质量约为270 mg。

脂肪干细胞分离培养及传代培养：取健康成年人吸脂术后的脂肪组织5 mL，PBS反复冲洗后，用Ⅰ型胶原酶消化进行原代细胞分离和接种培养。24 h后换液1次，以后每3 d换液1次。6-8 d细胞生长融合达80%-90%后，经2.5 g/L胰蛋白酶消化，按1︰3进行传代培养。选取生长良好的第3代细胞供本实验使用。倒置相差显微镜下观察原代及传代脂肪干细胞形态及生长状况。

脂肪干细胞鉴定：参考文献[8]方法进行。

缺氧诱导因子1α基因修饰脂肪干细胞悬液的制备：人脂肪干细胞的分离培养鉴定、缺氧诱导因子1α与基因体外转染脂肪干细胞及外源基因在脂肪干细胞的表达鉴定另文发表。移植前2 d取对数生长期的脂肪干细胞，离心后加入无血清培养液，轻柔吹打混匀成单细胞悬液，计数后调整种植密度为1×10⁹ L^-¹。按感染复数(MOI)为200 PFU/细胞将含缺氧诱导因子1α基因的腺病毒颗粒储存液加入培养瓶中，放入培养箱中孵育48 h，离心弃上清，用少量无血清培养液重悬成单细胞，计数后调整细胞浓度为1×10¹¹ L^-¹，置于冰上待移植用；同时制备细胞浓度为1×10¹¹ L^-¹未经缺氧诱导因子1α基因修饰的单纯脂肪干细胞悬液置于冰上待移植用。将移植后剩余细胞悬液进行锥虫蓝染色，脂肪干细胞活性仍在95%以上。

脂肪组织移植过程：在裸鼠20只背侧随机选择3个移植点，各受区间相隔距离约3.0 cm，各点做一横切口，长0.5 cm，用血管钳在切口皮下各分离出1个腔隙作为受区，大小以植入脂肪时不溢出为度。实验分为3组:①基因修饰组移植物由浓度为10 μL经缺氧诱导因子1α基因修饰的脂肪干细胞悬液+500 mg的脂肪组织颗粒与适量纤维蛋白胶混合成凝胶状，随机植入一个受区深筋膜下。②基因未修饰组移植物10 μL未经缺氧诱导因子1α基因修饰的单纯脂肪干细胞悬液+500 mg的脂肪组织颗粒与适量纤维蛋白胶混合成凝胶状，植入另一个受区。③生理盐水组移植物由10 μL生理盐水+500 mg的脂肪组织颗粒与适量纤维蛋白胶混合成凝胶状植入第3个受区，植入后用黑丝线缝合切口，留一根长线为标记，用手指轻轻抚平。在移植后3个月和6个月，每次随机收取10只动物的脂肪移植物，进行以下的检测。

结果检测方法：

大体观察：观察动物术后反应，术区有无异常，如炎症、血肿等，对取出的移植物进行大体观察，如包膜情况、硬度、有无囊肿形成，测量移植物大小及湿质量。

计算机图像分析血管密度：石蜡包埋脂肪组织，切片，苏木精染色，用显微镜观察病理改变。在200倍光镜下对苏木精-伊红染色切片随机选择10个非重叠视野分别进行图像分析，计算出每平方毫米中的血管密度(软件由Media Cybernetic Inc USA)。

点计数法定量分析：采用Gundersen提出的方网测试系统“点计数”技术，定量评价移植物脂肪细胞存活情况及纤维坏死率^[9]。方网测试系统由20条直线及其相交的100个点组成，每组移植物选取截面积最大的一张切片，每张切片随机选取10个互不重叠的200倍视野，共计1 000个点进行测试，测试者与测试切片遵循双盲原则。未落在实体组织上的点则不计算在内，点数值即是阳性点数占落在实体组织总点数的百分数。具体计算参照以下公式：

其中Pi指实际落在目标组织上的点数，Pc指落在所有实体组织上的总点数，P则是指修正后的点数值。

分别计算10个高倍视野下，落在存活脂肪组织以及纤维坏死组织的总点数，并计算得出修正后的点数值，作为移植物脂肪存活及纤维坏死程度的定量参考。

移植后脂肪组织质量保持率(R)的计算方法：

W为取出的脂肪移植物的湿质量；0.5 为植入脂肪的质量。

主要观察指标：①移植物大体情况。②移植物血管密度。③脂肪细胞纤维坏死率。④脂肪组织质量保持率。

统计学分析：由第一作者应用SPSS 11.5进行统计处理，数据以x(_)±s表示，采用两样本t 检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

近几年，研究结果表明：加速移植体的血管重建、防止纤维化和抑制脂肪细胞凋亡坏死是提高颗粒脂肪移植成活率的有效手段^[10-13]。移植后的脂肪组织能否成活，受到局部和全身因素的影响^[14]，如供区与受区的部位，脂肪颗粒的纯化与体积，体质与营养等，但早期主要与局部的血液循环能否及时有效地建立有关^[15]。缺氧诱导因子1的稳定和活性是由缺氧诱导因子1α决定的，缺氧诱导因子1α的表达主要受氧浓度调节，通常只在低氧细胞核中存在；而缺氧诱导因子1β不受氧浓度的影响，在正常细胞和缺氧细胞的细胞核和细胞质中均有表达^[16-17]。近几年来，越来越多的证据显示，缺氧诱导因子1α 在治疗脑缺血再灌注方面，取得突破性进展^[18-20]。同时对间充质干细胞的迁移、促进成骨分化以及的缺血皮瓣的血管再生等方面都起着重要的作用^[21-23]。

当机体缺血缺氧时，缺氧诱导因子1α和缺氧诱导因子1β形成二聚体，被活化后其对下游靶基因的转录、表达启动了机体对缺血缺氧的一系列适应机制，目前已经明确的受缺氧诱导因子1 调控的靶基因有70多个^[24]。这些基因主要参与：①细胞增生、存活、凋亡、运动、黏附、构成。②促进缺血/缺氧后微循环的重建以及血管生成。③糖、氨基酸、核酸、铁和能量代谢。④改善缺血/缺氧后能量代谢障碍，增强血管张力。⑤促进血红蛋白合成。⑥细胞外基质代谢等。实验结果证实，缺氧诱导因子1 产生的可能机制可能是缺氧诱导因子1通过靶基因促进血管内皮生长因子表达，进而促使新生血管生成，加速移植物血运重建，从而促进移植物种子细胞的成活。

由于自体脂肪移植后的吸收率较高，因此如何提高脂肪移植后的存留率、减少移植后吸收，使之长期产生支撑效果，成为该项技术的关键。实验结果表明，移植后3个月和6个月，各组移植物血管密度比较，基因修饰组>基因未修饰组>生理盐水组，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；各组移植物脂肪细胞纤维坏死率比较，基因修饰组<基因未修饰组<生理盐水组，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；各组移植物脂肪质量保持率比较，基因修饰组>基因未修饰组>生理盐水组，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)。结果证实，缺氧诱导因子1α基因转染脂肪干细胞可促进移植脂肪组织局部的血管再生，促进脂肪细胞的成活，增加脂肪组织的质量保持率，减少脂肪移植后的纤维坏死程度。　

作者认为在进行脂肪移植操作过程中还要做到以下几点，方能达到最佳的治疗效果：①使用10 mL或 20 mL注射器进行脂肪抽吸，有效避免了取材与注射过程中脂肪颗粒的损伤。②采用离心纯化方法，离心速率为300 r/min以下，时间为5 min，能有效去除杂质且不会过度破坏脂肪细胞的完整性，提高了单位体积内的细胞浓度，增加了移植脂肪颗粒的总量，减少了术后发生各类并发症的危险，相对减少了脂肪细胞的术后吸收率。③使用较细(2.5 mL)的注射器接，以钝头的针管将脂肪颗粒注射成点状或线状，形成多隧道、多层次的注射。在穿刺后退针的同时注入脂肪颗粒，在形成隧道的同时将脂肪颗粒定位于受植床内部。采用多层次、多间隙的均匀分散注入法，增加了移植组织与受区组织的接触面，而有利于再血管化获得成活，减少吸收。

缺氧诱导因子1α基因转染脂肪干细胞与自体脂肪移植

Hypoxia-inducible factor-1α gene transfected adipose-derived stem cells promote the survival of autologous fat grafts

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