骨碎补总黄酮依赖PI3K/Akt通路与牙髓干细胞的成骨分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.01.015

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (1): 92-97.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.01.015

• 干细胞与中医药 stem cells and traditional Chinese medicine • 上一篇下一篇

骨碎补总黄酮依赖PI3K/Akt通路与牙髓干细胞的成骨分化

黄晓菲¹，袁苏健¹，杨成²

1 长江航运总医院口腔科，湖北省武汉市 430010
2 华中科技大学同济医学院附属协和医院口腔科，湖北省武汉市 430022

收稿日期:2012-03-21 修回日期:2012-05-16 出版日期:2013-01-01 发布日期:2013-01-01
通讯作者: 杨成，博士，教授，主任医师，博士生导师，华中科技大学同济医学院附属协和医院口腔科，湖北省武汉市 430022 yangc715@126.com
作者简介:黄晓菲★，女，1984年生，湖北省利川市人，汉族，2011年华中科技大学毕业，硕士，医师，主要从事口腔种植与生物材料的研究。huangxf84@yahoo.com.cn

Effects of drynaria total flavonoid on osteogenic differentiation of rat dental pulp stem cells via PI3K/Akt pathway

Huang Xiao-fei¹, Yuan Su-jian¹, Yang Cheng²

1 Department of Stomatology, General Hospital of the Yangtze River Shipping, Wuhan 430010, Hubei Province, China
2 Department of Stomatology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China

Received:2012-03-21 Revised:2012-05-16 Online:2013-01-01 Published:2013-01-01
Contact: Yang Cheng, M.D., Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Stomatology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China yangc715@126.com
About author:Huang Xiao-fei★, Master, Physician, Department of Stomatology, General Hospital of the Yangtze River Shipping, Wuhan 430010, Hubei Province, China huangxf84@yahoo.com.cn

摘要/Abstract

摘要：

背景：PI3K/Akt通路可能在骨碎补总黄酮促成骨分化作用中发挥重要调控作用。
目的：观察骨碎补总黄酮对大鼠牙髓干细胞成骨分化的影响，并对PI3K/Akt通路在其中的作用进行初步探讨。
方法：采用组织块消化法获得大鼠牙髓细胞，克隆化分离培养大鼠牙髓干细胞并进行鉴定。在培养体系中加入不同质量浓度(0.01，0.05，0.1 g/L)的骨碎补总黄酮，观察各组细胞的碱性磷酸酶水平及钙结节形成情况，并用Western Blot法检测各组细胞磷酸化Akt的表达变化。
结果与结论：分离得到的牙髓干细胞的细胞表面标志CD44和CD29呈阳性表达，而CD34表达呈阴性。骨碎补总黄酮组牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性、钙结节形成能力和磷酸化Akt蛋白相对表达量增加，较空白对照组差异有显著性意义，且随骨碎补总黄酮质量浓度的增加而升高，表现出一定浓度和时间依赖性。说明骨碎补总黄酮对大鼠牙髓干细胞成骨分化具有促进作用，且该作用可能是依赖PI3K/Akt通路所介导的。

关键词: 干细胞, 干细胞与中医药, 牙髓干细胞, 骨碎补总黄酮, PI3K/Akt通路, 成骨分化, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: PI3K/Akt pathway may play an important regulative role in osteogenic differentiation of dental pulp stem cells induced by drynaria total flavonoid.
OBJECTIVE: To explore the effects of total flavonoids of drynaria on osteogenic differentiation of rat dental pulp stem cells and investigate the role of PI3K/Akt pathway in the induced differentiation of rat dental pulp stem cells.
METHODS: Rat dental pulp stem cells were harvested by enzymatic digestion, cultured and identified by immunohistochemical staining. The dental pulp stem cells were cultured in media with different concentrations of drynaria total flavonoid (0.01 g/L, 0.05 g/L and 0.1 g/L). Alkaline phosphatase activities and formation of calcified tubercles in cells were determined in each group. Phosphorylated Akt expression in cells was detected by western blot method in each group.
RESULTS AND CONCLUSION: Dental pulp stem cells were positive for CD44 and CD29 expression, but they were negative for CD34. Compared to the blank control group, alkaline phosphatase activities, formation of calcified tubercles and phosphorylated Akt expression were significantly increased in the drynaria total flavonoid group in a dose- and time-dependent manner. These findings suggest that drynaria total flavonoid can promote the osteogenic differentiation of rat dental pulp stem cells, and this effect is likely mediated by PI3K/Akt pathway.

Key words: stem cells, stem cells and traditional Chinese medicine, dental pulp stem cells, drynaria total flavonoid, PI3K/Akt pathway, osteogenic differentiation, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

:R394.2

黄晓菲，袁苏健，杨成. 骨碎补总黄酮依赖PI3K/Akt通路与牙髓干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(1): 92-97.

Huang Xiao-fei, Yuan Su-jian, Yang Cheng. Effects of drynaria total flavonoid on osteogenic differentiation of rat dental pulp stem cells via PI3K/Akt pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(1): 92-97.

图/表（结果） 6

2.1 大鼠牙髓干细胞的分离培养结果见图1。

经酶消化液温和消化后获得疏松组织块与单细胞的混悬液，接种于6孔板后多数组织块能贴于孔底，24 h显微镜下观察即可见有散在单细胞贴壁，72 h后细胞伸展生长，多呈成纤维细胞样，少数细胞增殖较快，有小的细胞克隆形成(图1a)。五六天左右组织块周围有较多单细胞游离出来(图1b)。培养11-13 d可见细胞数量明显增多，部分细胞呈集落样克隆性生长，细胞排列紧密。挑取细胞克隆培养扩增后所获得的牙髓干细胞几乎全为长梭形，有细胞突起(图1c，d)，细胞状态良好，平均传代时间为五六天。

图1 大鼠牙髓干细胞形态特征

Figure 1 Morphological characteristics of rat dental pulp stem cells

2.2 牙髓干细胞表型的鉴定免疫组织化学染色结果显示大鼠牙髓干细胞阳性表达CD44及CD29，而CD34呈阴性表达，见图2a-c。

图2 大鼠牙髓干细胞表面标志鉴定(×200)

Figure 2 Identification of surface markers of rat dental pulp stem cells (×200)

2.3 骨碎补总黄酮对牙髓干细胞中碱性磷酸酶活性的影响实验各组A₄₁₀均高于对照组(P < 0.05)，且在骨碎补总黄酮质量浓度为0.01，0.05及0.1 g/L时的A₄₁₀浓度依赖性增高(P < 0.05)，见表1。

2.4 骨碎补总黄酮对牙髓干细胞钙化结节形成能力的影响成骨诱导四五天后，部分细胞形态由长梭形变为立方形，体积略增大；诱导10 d左右，大部分长梭形细胞变为立方形或多角形，体积增大有短突起形成，细胞出现复层生长，部分区域有细胞结节形成，结节中央有基质样物质沉积。诱导培养21 d后行茜素红钙化结节染色，各组均可见红色结节形成，但实验组钙化能力较对照组增强(P < 0.05)，且有浓度依赖性(P < 0.05)。见图3，4。

图3 大鼠牙髓干细胞钙化结节染色结果(×40)

Figure 3 Alizarin red staining of calcified tubercles in rat dental pulp stem cells (×40)

图4 各组钙化结节染色图像平均吸光度值

Figure 4 Mean absorbance of stained calcified tubercles in each group

2.5 pAkt蛋白表达Western Blot结果随着骨碎补总黄酮浓度的增高，pAkt的相对表达量逐渐增强，见图5，与骨碎补总黄酮有浓度相关性。

图5 Western Blot检测各组磷酸化pAkt蛋白表达

Figure 5 Western blot detection of phosphorylated Akt protein expression in each group

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引言

材料方法

设计：细胞学体外对比观察实验。

时间及地点：于2009年9月至2010年12月在华中科技大学同济医学院附属协和医院普通外科实验室完成。

材料：

实验动物：健康SD大鼠30只，清洁级，雌雄不限，25-30 d龄(平均28 d)，体质量80-100 g (平均87 g)，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。

实验方法：

牙髓干细胞的分离培养：颈椎脱臼法处死大鼠，体积分数75%乙醇消毒皮肤10 min后游离下颌骨，放入含双抗的PBS中，在超净工作台内取下切牙牙髓并剪除根尖1/3，在盛有DMEM低糖培养基的玻璃培养皿中将牙髓组织充分剪碎，以3 g/LⅠ型胶原酶溶液37 ℃水浴消化1.0-1.5 h，待组织块松散后1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入含体积分数10% FBS的培养基后充分吹打成混悬液，然后移入6孔板，置37 ℃、体积分数为5% CO₂的培养箱中培养，隔日半量换液。收集原代细胞的培养上清，1 000 r/min离心10 min后用直径为0.22 μm的一次性滤器过滤，再加入等体积含体积分数10% FBS的DMEM低糖培养基，以此作为克隆化培养的适应性培养基。原代牙髓细胞经过一段时间培养后，挑选其中出现的细胞克隆转移至96孔板继续培养扩增，细胞达到一定数量后依次转移至24孔板、6孔板及培养瓶中培养，待培养瓶中细胞接近80%-90%融合后，按1∶2-1∶4比例进行胰酶消化传代。

牙髓干细胞鉴定：取生长良好的第3代牙髓干细胞，胰酶消化后用培养基重悬，调整细胞浓度为1×10⁸ L^-¹，接种到已放入灭菌玻片的6孔板中，培养24 h细胞贴壁后弃上清，加入PBS洗涤两三次，自然干燥后用40 g/L多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗涤2次，按免疫组化染色试验盒要求完成后续步骤，检测大鼠牙髓干细胞中CD44、CD29及CD34的表达。

实验分组：取骨碎补总黄酮0.25 g加入25 mL灭菌PBS中，过细菌滤器制备成质量浓度为1 g/L的骨碎补总黄酮溶液，后加入经典成骨诱导培养基(DMEM低糖培养基，其中含体积分数10%FBS、10^-⁸ mmol/L地塞米松、 10 mmol/L β-甘油磷酸钠和50 mg/L VitC)，制备成骨碎补总黄酮终质量浓度为0.01，0.05及0.1 g/L的诱导培养基，并按此分组。

碱性磷酸酶活性检测：取生长良好的第4代牙髓干细胞，调整细胞浓度为1×10⁷ L^-¹，接种到24孔板中，每孔加入细胞悬液均为1 mL，培养24 h细胞贴壁后弃上清，用PBS洗涤2次后加入含上述质量浓度骨碎补总黄酮的诱导培养基1 mL，对照组加入1 mL不含骨碎补总黄酮的诱导培养基，实验组和对照组均设6个重复孔。培养 9 d，弃上清后用PBS冲洗3次，吸干后加入0.2% Triton-100溶液100 μL，4 ℃过夜，至倒置显微镜下见细胞结构完全消失。将上述样本按碱性磷酸酶活性检测试剂盒方法用酶标仪在410 nm波长处检测吸光值(A₄₁₀)，取每组6孔的平均值，以间接反映碱性磷酸酶活性。

钙化结节染色：取生长良好的第4代牙髓干细胞，调整细胞浓度为1×10⁷ L^-¹，以每孔3 mL接种于6孔板中，培养24 h细胞贴壁后弃上清，加入PBS洗涤两三次，后加入含上述质量浓度骨碎补总黄酮的诱导培养基 3 mL，设不加骨碎补总黄酮的诱导培养基3 mL为对照组，每组设3个复孔，每隔三四天换液1次，继续培养3周后茜素红染色法行钙化结节染色，在光镜下观察钙化结节染色情况，并用Image-Pro6.0软件进行图像分析。

Western Blot检测磷酸化Akt蛋白表达：参考Xiao等^[5]的方法，按上法将细胞分组培养于6孔板中，每组设3个复孔，培养9 d后将各组细胞用冷PBS预洗2次，加入细胞裂解液冰上孵育30 min，用细胞刮收集裂解物，将上述液体12 000 r/min 4 ℃离心10 min，收集上清蛋白，BCA法测定样品蛋白浓度，将各蛋白样品在10%SDS-PAGE胶中电泳，之后将其转到PVDF膜上，取出PVDF膜后室温振摇5%BSA封闭1 h后加入稀释的一抗(β-actin抗体、pAkt抗体，1∶1 000)4 ℃孵育过夜，洗脱后加入二抗(1∶2 000)孵育一两个小时，最后用ECL曝光显影、照像。

主要观察指标：①大鼠牙髓干细胞的分离培养结果。②牙髓干细胞表型的鉴定。③牙髓干细胞中碱性磷酸酶活性。④牙髓干细胞钙化结节形成结果。⑤pAkt蛋白表达 Western Blot结果。

统计学方法：实验数据以x(_)±s表示，使用SPSS 10.0软件进行统计学分析。采用单因素方差分析方法，以P < 0.05为显著性水准。

讨论

干细胞是人体内的一种较原始、未分化的细胞，具有自我更新、高度增殖和多向分化的能力，可分为胚胎干细胞和成体干细胞，而后者为目前研究的热点。Gronthos等^[1]第一次成功的分离并鉴定了人牙髓干细胞，Shi等^[6]进一步阐明了牙髓干细胞的生物学特性，使人们认识到其做为牙组织工程种子细胞的可能性，因此牙髓干细胞成为当今口腔医学研究的一个新热点。

实验获得的大鼠牙髓组织，其中含有多种细胞成分如成牙本质细胞、成纤维细胞、组织细胞和未分化的间充质细胞^[7]。作者采用组织块消化法和克隆传代培养，得到的牙髓干细胞存活率高且数量较多，贴壁的细胞生长呈成纤维样细胞形态。由于缺乏特异性的表面标志物，目前多数学者主要依靠其细胞形态、克隆样生长和体外多向分化等生物学特性及间充质干细胞表面标志物对牙髓干细胞进行鉴定。牙髓干细胞具有与骨髓间充质干细胞相类似的表面标志，CD44、CD105、CD29、Stro-1等间充质干细胞表面标志呈阳性表达，而CD34等造血干细胞的表面标志呈阴性表达^[8-9]。实验采用CD44、CD34和CD29对牙髓干细胞加以鉴定，结果显示CD44和CD29均呈阳性表达，而CD34为阴性表达，这与其他学者的实验结果是相符的。

骨碎补为水龙科植物槲蕨的干燥根茎，是骨伤科常用药^[10]。现代医学研究显示，骨碎补的主要有效成分包括柚皮甙和总黄酮，前者对脂质代谢有一定改善作用，后者总黄酮能明显抑制骨密度下降，在抑制破骨细胞活性的同时，促进成骨细胞增殖和碱性磷酸酶活性，从而增加骨形成^[10]。

胡其勇、蒋俊强、郭晶洁等^[4,11-12]先后进行了骨碎补对牙周膜细胞和牙髓细胞的作用研究，并证实骨碎补具有促进细胞增殖和增强成骨分化的能力，但骨碎补总黄酮对牙髓干细胞的作用尚未见相关研究。碱性磷酸酶是成骨前体细胞的重要标志，其活性可以反映细胞成骨方向分化趋势的强弱^[13]，碱性磷酸酶和钙化结节染色的结果进一步表明，骨碎补总黄酮有明显的促成骨分化的作用，其在本次试验的最低质量浓度0.01 g/L即表现出一定的促成骨作用，随其浓度的增加其促成骨分化的作用也随之增强。

PI3K/Akt通路属于酪氨酸激酶受体介导的信号传导系统，广泛存在于多种细胞中，是参与细胞生长、增殖、分化调节的一条重要的信号传导通路^[14]。活化后的Akt可引起下游因子(如mTOR、GSK3、Bax、NF-γB、Caspase等)的变化，参与细胞生长、分化、分裂及迁徙的调节，处于PI3K/AKT信号通路的中心位置，其磷酸化水平可以反应整个信号通路的活性^[15]。实验通过对pAkt蛋白的检测发现，在骨碎补总黄酮促进大鼠牙髓干细胞成骨分化的过程中，pAkt的表达量有明显增加，且与骨碎补总黄酮浓度呈现一定的相关性，表明在此过程中存在PI3K/Akt通路的激活。其原因可能与pAkt激活下游的mTOR将有丝分裂信号传递给p70^S6K，以及通过阻断葡萄糖合成酶3β(GSK3β)，使细胞周期驱动蛋白如细胞周期素、细胞周期依赖性蛋白激酶2、4的翻译上调，同时抑制FOXO家族蛋白的活性，减少CDK-4抑制剂如p27Kip1和p130Rb2等的表达，使细胞进入S期并诱导DNA的合成，加速细胞周期，从而发挥促进细胞分化的作用^[16]。

实验初步证实了骨碎补总黄酮对大鼠牙髓干细胞成骨分化有一定的促进作用，其机制可能与激活细胞内PI3K/Akt通路有关，提示骨碎补总黄酮有可能用于人牙槽骨骨质缺损的治疗。但实验尚未摸索出骨碎补总黄酮的最佳作用浓度，且仅对其中可能发挥作用的一条机制进行了初步探讨，但其给药方式、其他可能发挥作用的调控机制等仍需进一步的研究。

骨碎补总黄酮依赖PI3K/Akt通路与牙髓干细胞的成骨分化

Effects of drynaria total flavonoid on osteogenic differentiation of rat dental pulp stem cells via PI3K/Akt pathway

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