新生小鼠海马神经干细胞体外培养条件下的增殖与分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.01.013

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (1): 79-85.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.01.013

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

新生小鼠海马神经干细胞体外培养条件下的增殖与分化

胡莹莹^1，2，段现花¹，陈梅¹，王德广¹

1 徐州医学院解剖学教研室，江苏省徐州市 221004
2 江苏省徐州医药高等职业学校，江苏省徐州市 221116

收稿日期:2012-04-17 修回日期:2012-05-11 出版日期:2013-01-01 发布日期:2013-01-01
通讯作者: 王德广，博士，教授，硕士生导师，徐州医学院解剖学教研室，江苏省徐州市 221004 deguangwang@xzmc.edu.cn
作者简介:胡莹莹★，女，1984年生，江苏省连云港市人，汉族，徐州医学院在读硕士，主要从事中枢神经损伤及其修复的研究。huyingying_23@163.com

Proliferation and differentiation of neural stem cells from newborn mouse hippocampi in vitro

Hu Ying-ying^{1, 2}, Duan Xian-hua¹, Chen Mei¹, Wang De-guang¹

1 Department of Anatomy, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China
2 Jiangsu Provincial Xuzhou Pharmaceutical Vocational College, Xuzhou 221116, Jiangsu Province, China

Received:2012-04-17 Revised:2012-05-11 Online:2013-01-01 Published:2013-01-01
Contact: Wang De-guang, M.D., Professor, Master’s supervisor, Department of Human Anatomy, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China deguangwang@xzmc.edu.cn
About author:Hu Ying-ying★, Studying for master’s degree, Department of Anatomy, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China; Jiangsu Provincial Xuzhou Pharmaceutical Vocational College, Xuzhou 221116, Jiangsu Province, China huyingying_23@163.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：神经干细胞移植可用于中枢神经损伤的临床治疗。
目的：观察新生小鼠海马神经干细胞在体外培养条件下的增殖和分化。
方法：从新生昆明小鼠海马取材，采用机械分离法对原代细胞进行无血清培养，采用机械法复合酶消化法对原代细胞进行传代，以体积分数为10%胎牛血清诱导分化。免疫荧光行巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白染色，对培养的细胞进行鉴定。CCK-8法检测神经干细胞增殖能力。
结果与结论：从新生小鼠海马分离得到的细胞具有连续传代形成克隆球的能力，克隆球呈巢蛋白免疫反应阳性；加入胎牛血清可诱导分化为β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。提示实验成功建立了体外培养新生小鼠海马组织分离和培养神经干细胞的方法，培养的神经干细胞在体外培养条件下保持着自我增殖和分化的潜能。

关键词: 干细胞, 干细胞培养与分化, 神经干细胞, 细胞球, 细胞培养, 增殖, 分化, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Neural stem cells transplantation can be used for clinical therapy of central nervous system injury.
OBJECTIVE: To observe the characteristics of proliferation and differentiation of neural stem cells cultured in vitro.
METHODS: Neural stem cells were isolated mechanically from newborn Kunming mouse hippocampus and cultured with serum-free cell culture medium. They were obtained by mechanical dissociation and enzymatic digestion. The neurospheres were identified by immunofluorescent staining of Nestin. The differentiation of neural stem cells was induced by 10% fetal bovine serum and identified by immunohistochemistry of β-Ⅲ-tubulin and glial fibrillary acidic protein. CCK-8 assay was used to ascertain the capacity for neural stem cell proliferation.
RESULTS AND CONCLUSION: The neural stem cells obtained from newborn mouse hippocampus had the capacity for forming the neurospheres which were positive for Nestin. The differentiated cells induced by 10% fetal bovine serum expressed β-Ⅲ-tubulin or glial fibrillary acidic protein. The method of isolation and culture of neural stem cells from newborn mouse hippocampus in vitro was successfully established. Neural stem cells have the capacity for self-renewal and the potential for differentiation.

Key words: stem cells, stem cell culture and differentiation, neural stem cells, cell sphere, cell culture, proliferation, differentiation, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

:R394.2

胡莹莹，段现花，陈梅，王德广. 新生小鼠海马神经干细胞体外培养条件下的增殖与分化[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(1): 79-85.

Hu Ying-ying, Duan Xian-hua, Chen Mei, Wang De-guang. Proliferation and differentiation of neural stem cells from newborn mouse hippocampi in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(1): 79-85.

图/表（结果） 4

2.1 神经干细胞自我复制及形态学观察原代培养的神经干细胞接种于培养瓶后，倒置显微镜下观察，视野内布满单细胞，呈悬浮状，细胞透亮，折光度好，同时可见少量细胞碎片。

原代培养24 h后，可见部分细胞相联，表现出“抱团”生长的趋势，悬浮状。3 d后继续观察，视野内可见数个由若干细胞组成的细胞团，其内细胞联系松散，细胞团立体感尚可，呈桑葚状，悬浮状生长，细胞折光度好，部分细胞保持单细胞状态生长。传代前观察，视野内可见大量球形的细胞团——细胞球，呈悬浮生长，大小不一，边缘光滑，立体感强；细胞透亮，联系紧密，折光度好；培养基内存在少量单细胞，附着于培养瓶底部。传代后，培养基内既可见大量单细胞悬浮存在，同时可见不规则形状的小细胞团。第3代的神经干细胞形态及性质趋同，悬浮生长，状态好，生长能力强，细胞球大小较均一；部分细胞球产生次级细胞球，结构紧密；背景干净，见图1。

图1 倒置显微镜观察体外培养神经干细胞形态变化
Figure 1 Morphology of neural stem cells cultured in vitro under inverted microscope

2.2 神经干细胞特异性标记物：巢蛋白染色神经干细胞接种于包被有多聚赖氨酸玻片的24孔板中1.5- 3.0 h即可完成细胞球贴壁过程，此时观察到细胞球边缘伸出细小的突起，可进行免疫细胞化学实验——巢蛋白染色。激光共聚焦显微镜(FLUOVIEW OLYMPUS FV10i)下观察，巢蛋白免疫荧光染色结果为阳性，见图2a-c，Hochest 33258复染细胞核，细胞核结构明显，呈圆形或椭圆形。此外，实验对同批培养的细胞球进行胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色，细胞球中的部分细胞胶质纤维酸性蛋白阳性表达，见图2d-f，说明培养的细胞球并非全部为神经干细胞，其内部至少含有胶质纤维酸性蛋白等其他类型的细胞。实验中设定的阴性对照均不显色。

图2 细胞球巢蛋白和胶质纤维酸性蛋白表达情况(标尺=50 μm)
Figure 2 Expression of nestin and glial fibrillary acidic protein in the neurospheres (bars: 50 μm)

2.3 神经干细胞诱导分化及免疫荧光染色使用促分化培养基培养第3代干细胞，3 d后可见，以细胞球为中心，细胞向外周迁延，突起明显，呈放射状；至第7天，各细胞球形态基本消失，其内部细胞延展平铺于培养板底壁。此时，各细胞突起细长，交错成网，胞体呈圆形、椭圆形或多角形。神经干细胞诱导分化后7 d，对星形胶质细胞、神经元特异性标记物进行免疫荧光染色，结果显示胶质纤维酸性蛋白和β-微管蛋白Ⅲ表达阳性，见图3。
β-微管蛋白Ⅲ阳性细胞胞体呈梭形或椭圆形，突起细长，交错成网；胶质纤维酸性蛋白阳性细胞胞体呈多角形，突起较多，错杂成络。Hochest 33258复染细胞核，显示胞核大而圆。实验中设定的阴性对照均不显色。

图3 神经干细胞体外诱导分化结果
Figure 3 Induced differentiation of neural stem cells

2.4 CCK-8法神经干细胞增殖能力的测定第3代神经干细胞自传代后2 d内，其增殖尚处于潜伏期，生长缓慢；3 d后开始进入快速生长期，并在5 d时增殖能力最高，以后的时间内继续处于自我复制状态，在本观察期内未见平台期，见图4。

图4 CCK-8法检测培养不同时间神经干细胞增殖能力
Figure 4 Detection of neural stem cell proliferation capacity after culture for different time periods by CCK-8 assay

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引言

材料方法

设计：细胞学体外对照实验。

时间及地点：实验于2010年10月至2011年6月在徐州医学院神经生物学研究中心完成。

材料：

实验动物：普通级新生1-3 d昆明小鼠，体质量约1.3 g，雌雄不拘，由徐州医学院实验动物中心提供。实验中对动物处置符合动物伦理学要求。

方法：

神经干细胞的体外分离及原代培养：取新生昆明种小鼠，0.5%碘伏浸泡消毒皮肤。超净台内断头，无菌条件下开颅取脑，在冰块预冷的培养皿内分离出双侧海马组织，将其放入含有4 ℃预冷的DMEM/F12基础培养基的培养皿中，仔细去除血管和脑膜，并用DMEM/F12基础培养基冲洗。将海马组织剪碎(约1 mm×1 mm×1 mm即可)，用抛光的改良式巴氏吸管轻轻吹打成单细胞悬液，400目滤网过滤，以1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入37 ℃复温的DMEF/F12完全培养基，即DMEM/F12基础培养基加入20 μg/L表皮生长因子、20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2% B27。锥虫蓝染色计数活细胞数，以5×10⁸ L^-¹的浓度接种于5 cm×5 cm的培养瓶中，送入37 ℃、体积分数为5%的CO₂、平衡湿度培养箱中。倒置相差显微镜观察细胞生长、分裂及增殖情况。培养至第3天时细胞换液。

神经干细胞传代：原代培养至第6天，此时细胞球直径为100-120 μm，收集细胞液于50 mL离心管中，以800 r/min离心5 min，弃上清。轻轻吸去上清，向离心管内加入2 mL Accutase原液，于超净台内消化10 min，其间用抛光的改良式巴氏吸管轻轻吹打细胞液。消化完毕，800 r/min离心5 min，弃上清。用37 ℃复温的DMEM/F12基础培养基洗涤1次后，1 500 r/min离心5 min。加入复温的完全培养基，吹打重悬后接种、培养。3 d后半量换液，1周左右视细胞球直径大小情况传代。

巢蛋白免疫细胞化学染色：培养至第3代的神经干细胞，待细胞球直径达100 μm时，收集细胞。调整密度，以10倍镜下每视野中5-10个细胞球为最佳，接种于含有已包被多聚赖氨酸(0.1 g/L)的无菌玻片的24孔板中，送回培养箱内继续培养1.5-3.0 h，其间镜下观察细胞球的贴壁情况。待大部分细胞球贴壁后，用37 ℃复温的0.01 mol/L PBS(pH 7.34)缓和洗涤3次，5 min/次。用4 ℃预冷的40 g/L多聚甲醛室温固定20 min，PBS洗涤3次，5 min/次。4 ℃预冷的0.3% Triton X-100室温孵育20 min，PBS洗涤3次，5 min/次。用体积分数为10%的山羊血清室温封闭1 h。加入小鼠抗巢蛋白单克隆抗体(用含有体积分数为5%山羊血清的0.01 mol/L PBST稀释)，室温孵育30 min，转移至4 ℃冰箱内继续孵育过夜。次日，取出培养板，室温复温30 min。PBS洗涤3次，5 min/次。避光加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG二抗，避光室温孵育5 h后，PBS避光洗涤3次， 5 min/次，用Hochest 33258复染细胞核，荧光倒置显微镜下观察并拍照。

设阴性对照，用0.01 mol/L PBS代替一抗，其余步骤相同。

神经干细胞诱导分化及免疫细胞化学染色：培养至第3代的神经干细胞，待细胞球直径达 100 μm时，改用促分化培养基，即撤去表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和B27，DMEM/F12培养基内加入体积分数为10%的胎牛血清。收集细胞并调整密度接种于已包被多聚赖氨酸的24孔板中，每隔3 d半量换液1次。密切观察神经干细胞生长、分化以及细胞形态变化等情况。细胞诱导分化10 d左右，对其进行免疫化学染色，实验步骤基本同巢蛋白免疫细胞化学染色。使用的一抗分别为兔抗胶质纤维酸性蛋白多克隆抗体和小鼠抗β-微管蛋白Ⅲ单克隆抗体，二抗为FITC标记的山羊抗小鼠IgG、TRITC标记的山羊抗兔IgG，Hochest 33258复染细胞核，荧光倒置显微镜观察并拍照。设阴性对照，用0.01 mol/L的PBS代替一抗，其余步骤相同。

CCK-8法检测神经干细胞增殖能力：取第3代神经干细胞，待细胞球直径达100 μm时，用Accutase将其制备成单细胞悬液，用复温的DMEM\F12培养基洗涤1次，继续用完全培养基，调整浓度至5×10⁸ L^-¹接种于7个(传代周期约为7 d)96孔板中，每个培养板设5个平行孔，每孔中加入100 µL细胞悬液，送入37 ℃、体积分数为5%CO₂、平衡湿度培养箱中培养。次日相同时间，随机取出1个培养板，向每孔中加入10 μL CCK-8试剂，于培养箱内继续孵育4 h，取450 nm波长处检测各孔A值。连续7 d相同时间点重复实验。

主要观察指标：神经干细胞在体外培养中的形态变化，免疫荧光法检测神经干细胞特异性标记物及诱导分化情况，CCK-8法检测神经干细胞的增殖能力。

统计学分析：由第一作者采用SPSS 16.0软件完成统计处理，实验数据以x(_)±s表示，多个样本均数之间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

目前应用体外培养技术所获得的神经干细胞主要是采用Reynolds和Weiss所创立的“神经球”法和单层贴壁培养法^[8-9]。Sun等^[10]应用投射扫描电镜等技术对上述两种培养方式所培养的神经干细胞增殖及分化能力和潜力进行了比较，发现贴壁培养的神经干细胞前3代增殖能力高于悬浮培养的神经干细胞，自第5代起，则逐渐下降；与此同时，贴壁培养的神经干细胞只能在前6代维持未分化状态，此后即进入分化阶段，而悬浮培养所得的神经干细胞超过10代以上都能维持多潜能未分化的状态。Reynolds等^[11]认为，悬浮生长是神经干细胞保持未分化状态的必要条件，是进行分化、移植等实验研究的前提。实验从新生昆明小鼠海马取材，采用经典的无血清悬浮培养法对神经干细胞进行体外分离和培养^[8]。

神经干细胞的生长需要适宜的浓度，具有一定的浓度依赖性^[12]。Hupspas等^[13]将小鼠胚胎脑神经干细胞以不同浓度接种培养时发现，低浓度的单细胞培养中没有克隆形成，最适细胞浓度为(2.5-10)×10⁷ L^-¹，且不同的细胞浓度下，形成的神经球大小不同。本实验中，神经干细胞原代及传代培养均以5×10⁸ L^-1作为接种浓度较为适宜。观察发现，细胞球在形成之前，即在接种24 h后，细胞相互接触、相互联接，呈“抱团”状生长；若干个“抱团”生长的细胞团又表现出聚集生长的现象，细胞团生长状态良好，此后形成的细胞球大小均匀。而单个细胞以及单个细胞团往往生长缓慢，甚至停止生长或死亡。Ropepe等^[14]认为神经干细胞抱团后可能通过细胞旁分泌、自分泌和细胞间的信号传导使干细胞表面的FGF-2和表皮生长因子受体数目增多，或者受体对生长因子的敏感性增强，从而刺激了神经干细胞的增殖。

课题组前期实验观察也发现，神经干细胞接种密度过高，容易形成体积巨大的细胞球(直径超过200 μm)，由于球体中央的细胞无法给取营养物质，而发生凋亡；以目前的实验方法而言，原代培养接种的细胞并非纯神经干细胞，实验仅对第3代细胞球中的星形胶质细胞进行了免疫细胞化学染色，结果显示，细胞球中存在少量星形胶质细胞，不排除神经元、胶质细胞等其他细胞的存在。课题组经过长期的实践摸索认为，体外培养的神经干细胞，以5×10⁸ L^-¹浓度接种进行原代培养，其第3代细胞球纯度可达到90%以上，最为适合后续的实验研究^[15]。

巢蛋白被认为是中枢神经系统发育过程中神经干细胞或神经前体细胞的标志之一。一旦神经干细胞或神经前体细胞朝向终末方向分化成神经元和胶质细胞时，巢蛋白便停止表达，因此巢蛋白被广泛应用于神经干细胞的鉴定^[16-17]。本实验培养的神经细胞球表达神经干细胞的特异性抗原巢蛋白，说明培养的神经干细胞在外源性因子的调节下，能够在体外以传代的方式自我复制、维持自我更新的状态。实验中，收集细胞球，以10倍镜下每视野中5-10个细胞球接种于包被有多聚赖氨酸玻片的24孔板中，培养箱内贴壁时间严格控制在1.5-3.0 h，镜下观察贴壁情况，一旦细胞球边缘伸出细小突起，即进行后续实验。根据前期的实验经验，作者认为，对神经干细胞进行免疫化学染色，需控制接种细胞球浓度。接种浓度太高，细胞球之间呈悬浮状相互接触，重叠在一起，增加贴壁的难度；即便贴壁，在后续的实验中也容易发生细胞球大片脱落；此外，密集的细胞球往往不能采集到理想的图片。接种浓度太低，在经过一系列洗涤过程后，所剩细胞球则寥寥无几。细胞球贴壁时间太长，立体感消失，中央部位的细胞向四周延展、平铺；激光共聚焦显微镜观察发现，细胞球扫描层次减少，球体贴壁层面呈现为树枝状或是骨架状，细胞浆内巢蛋白染色呈阳性，胞核变形、拉长。因此分析为，此时的神经干细胞正处于贴壁分化的早期阶段，在促贴壁条件下，细胞球贴壁面的细胞向外侧伸出突起，并具有一定的趋向性，若干细胞汇集在一起，其突起交织成较粗大的树枝状或骨架状。推测这样的构造可以增强细胞贴壁的牢固程度，并且神经干细胞在贴壁后，其内部细胞最先构造出结实的“框架”，随后球体中央的细胞沿着此框架向外周延展、平铺，形成单层细胞，最终分化为相关终末细胞，这可能与神经干细胞的迁移潜能特性有关。

实验中，神经干细胞经体积分数为10%胎牛血清诱导后分化为星形胶质细胞和神经元，并未对其他神经细胞如少突胶质细胞进行鉴定，不排除培养的神经干细胞可以分化为少突胶质细胞等其他神经细胞。不同浓度胎牛血清对神经干细胞的分化是有影响的。课题组前期的实验观察发现，胎牛血清浓度越高(体积分数为15%)，神经干细胞分化为星形胶质细胞的比例就越大，即神经干细胞分化成星形胶质细胞的倾向与胎牛血清的浓度呈正相关，这与Ballarin等^[18]报道相一致。实验也发现，体积分数为10%胎牛血清诱导神经干细胞分化的细胞生长快、数量多、突起长、折光性好，细胞核圆形或椭圆形，从形态上观察呈典型的星形胶质细胞及神经元。因此，实验用含体积分数为10%胎牛血清的促分化培养基诱导神经干细胞分化是合适的。

神经干细胞的生物学性状是当今神经科学领域亟待攻克的课题。实验通过体外培养小鼠海马神经干细胞，重在观察神经干细胞在体内外培养条件下增殖、分化的特点，旨在弄清神经干细胞在体内外增殖、分化的异同，为临床应用神经干细胞治疗疾病提供了更广阔的材料。前人在对哺乳动物脑内神经干细胞增殖、迁移等现象和机制有了较深入的研究。尽管如此，神经干细胞还有许多需要解决的问题，包括体外培养的神经干细胞与脑内的神经干细胞其生物学性状是否一致，在体外如何诱导其分化为需要的表型，这些都是有待深入研究的内容。

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