RhoA基因沉默联合脐带间充质干细胞移植脑损伤大鼠功能的恢复

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.01.004

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究认为Rho激酶可致使神经生长锥塌陷，对神经修复具有抑制作用。
目的：脐带间充质干细胞移植同时联合RNAi介导的RhoA基因沉默，观察两者对脑损伤大鼠恢复的影响。
方法：健康Wistar大鼠84只，采用液压颅脑损伤仪，给予253.312 5-303.975 kPa液压冲击力，制成重型液压颅脑损伤模型，随机分成为对照组，脐带间充质干细胞移植组，联合组(脐带间充质干细胞移植联合RhoA基因沉默)。CM-Dil标记的脐带间充质干细胞移植后采用改良神经功能损伤评分系统(mNSS)评价大鼠神经功能恢复情况，在创伤性脑损伤后21-28 d进行Morris水迷宫试验。4周后处死并行全脑冷冻切片苏木精-伊红染色及荧光显微镜观察CM-Dil标记的脐带间充质干细胞的存活和分布情况，采用RT-PCR检测各组损伤区脑组织RhoA基因的表达量。
结果与结论：移植后1，2，3，4周，大鼠神经学缺损评分脐带间充质干细胞移植组低于对照组(P < 0.05)，联合组明显低于对照组(P < 0.01)。Morris水迷宫试验各组平均逃避潜伏期均逐渐缩短, 联合组3-5 d时平均潜伏时间较脐带间充质干细胞移植组缩短(P < 0.05)，较对照组明显缩短(P < 0.01)；联合组穿越平台次数及在目标象限游泳距离与总距离百分比均高于对照组和脐带间充质干细胞移植组(P < 0.05)。移植4周后，脑组织冰冻切片和苏木精-伊红染色切片中的神经元数量和CM-Dil阳性细胞数联合组多于脐带间充质干细胞移植组，脐带间充质干细胞移植组多于对照组(P < 0.05)；联合组RhoA mRNA表达水平较对照组和脐带间充质干细胞移植组显著降低(P < 0.05)。提示脐带间充质干细胞移植可明显改善重型颅脑损伤后大鼠的神经学功能，联合应用RhoA基因沉默有协同效果。

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, RhoA, 基因沉默, 脐带间充质干细胞, 间充质干细胞, 移植, 脑损伤, Morris水迷宫试验, 神经功能, CM-Dil标记, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Several studies have demonstrated that Rho kinase can lead to collapse of nerve growth cone and exhibits an inhibitory effect on nerve repair.
OBJECTIVE: To investigate the effects of human umbilical cord mesenchymal stem cells combined with RNAi-mediated RhoA gene silencing on recovery of traumatic brain injury in rats.
METHODS: Eighty-four healthy Wistar rats were prepared into models of traumatic brain injury by 253.312 5- 303.975 kPa hydraulic pressure impact force. Then traumatic brain injury models were randomly divided into control group, umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation group and umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation+RhoA gene silencing group (combination group). After transplantation of CM-Dil-labeled umbilical cord mesenchymal stem cells, rat neurological function was evaluated through the use of a modified neurological severity scores. At 21-28 days after traumatic brain injury development, the Morris water maze test was performed. After 4 weeks, following sacrifice, the whole rat brain was frozen, sliced, stained with hematoxylin-eosin and finally the survival and distribution of CM-Dil-labeled umbilical cord mesenchymal stem cells were observed under fluorescent microscope. RhoA gene expression in the injured region in each group was detected using RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: At 1, 2, 3 and 4 weeks after traumatic brain injury, the modified neurological severity scores were significantly lower in the umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation group than those in the control group (P < 0.05), and the scores were significantly lower in the combination group than those in the control group (P < 0.01). Morris water maze test results showed that the mean escape latency was gradually shortened in each group. The mean escape latency across 3-5 days after traumatic brain injury development in the combination group was significantly shorter than that in the umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation group (P < 0.05) and in the control group (P < 0.01). The number that rats crossed the platform and the percentage of swimming distance in the target quadrant to total distance were significantly higher in the combination group compared to the control group and the umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation group (P < 0.05). At 4 weeks after cell transplantation group, the number of neurons and CM-Dil-positive cells in the umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation group was significantly lower compared to the combination group but it was significantly higher compared to the control group (both P < 0.05). RhoA mRNA expression in the combination group was significantly lower compared to the control group and umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation group (P < 0.05). These findings suggest that umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation can greatly improve the neurological function of rats with traumatic brain injury, and it exhibits better effects after combined with RhoA gene silencing.

中图分类号:

R394.2

冯士军，韩建国. RhoA基因沉默联合脐带间充质干细胞移植脑损伤大鼠功能的恢复[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(1): 23-30.

Feng Shi-jun, Han Jian-guo. Treatment of traumatic brain injury in rats by RhoA gene silencing combinedwith umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(1): 23-30.

图/表（结果） 12

2.1 实验动物数量分析实验选用Wistar大鼠84只，分为3组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 脐带间充质干细胞形态观察见图1。

图1 扩增纯化后的第3代人脐带间充质干细胞(×200)

Figure 1 Morphology of amplified, cultured passage 3 human umbilical cord mesenchymal stem cells after amplification and purification under the microscope (×200)

培养四五天后，贴壁细胞明显增多，细胞为长梭形或多角形，并可见有丝分裂，部分细胞克隆呈集落状生长，形态呈单一的长梭形，胞体中央膨大，培养八九天，细胞铺满培养瓶底面，成漩涡状生长，漩涡中心的细胞为复层生长，周围大部分细胞胞体呈单层的漩涡状或辐射状。

流式细胞仪检测结果显示CD34，CD45，CD29，CD90，CD105及CD49阳性，脐带间充质干细胞均一性好，纯度达98%以上。24 h时，CM-Dil标记的脐带间充质干细胞在荧光显微镜下呈红色荧光， FCM检测细胞标记率达100%，见图2。

图2 培养24 h时CM-Dil标记的人脐带间充质干细胞(×100)

Figure 2 The CM-Dil labeled human umbilical cord mesenchymal stem cells after cultured for 24 h (immunofluorescence staining, × 100)

2.3 大鼠神经功能评价三组大鼠神经功能评分与损伤前组比较，在伤后各时间点NSS评分增高(P < 0.01)；伤后第1天3组NSS评分差异无显著性意义(P> 0.05)；伤后1，2，3，4周，大鼠神经学缺损评分脐带间充质干细胞组低于对照组(P < 0.05)，联合组明显低于对照组，差异有非常显著性意义(P < 0.01)，见表1。

表1 对照组、脐带间充质干细胞组和联合组大鼠创伤性脑损伤后神经损伤严重程度评分 Table 1 Neurological deficit scores of rats at different time points

2.4　Morris水迷宫行为学检测结果各组平均潜伏时间均逐渐缩短，1 d各组之间差异无显著性意义，2 d联合组逃避潜伏期较对照组、脐带间充质干细胞组明显缩短(P < 0.05)，3-5 d联合组逃避潜伏期较对照组缩短更明显(P < 0.01)。空间探索试验穿越平台次数：与联合组相比, 脐带间充质干细胞组和对照组穿越原平台次数明显减少，差异有显著性意义(P < 0.05，P < 0.01)；目标象限游泳时间占总时间的百分比：与联合组相比，脐带间充质干细胞组和对照组明显减少(P < 0.05，P < 0.01)。见表2。

表2 对照组、脐带间充质干细胞组和联合组大鼠水迷宫测试结果比较

Table 2 The water maze test of rats in each group (x(_)±s, n=28)

2.5 大鼠损伤处脑组织苏木精-伊红染色和荧光显微镜观察移植4周后苏木精-伊红染色对照组可见损伤处脑组织被胶质细胞和胶质纤维充填，形成胶质瘢痕，软化灶形成，见图3。

注：对照组大鼠损伤的脑组织内注射培养液图3 对照组可见损伤处脑组织断裂，结构紊乱，有明显空洞形成，局部脑萎缩，软化灶形成(苏木精-伊红染色，× 40)

Figure 3 Histopathological section of control group (hematoxylin-eosin staining, ×40), showing fragmented brain tissue with disordered structure, obvious cavitation, local cerebral atrophy and formation of softened loci in the injury site

脐带间充质干细胞组见在移植部位出现典型的神经细胞样形态学改变，组织瘢痕和软化灶小于对照组，而大于联合组，见图4。

图4 脐带间充质干细胞组见在移植部位出现典型的神经细胞样形态学改变，组织空洞小于对照组，而大于联合组(苏木精-伊红染色，× 40)

Figure 4 Histopathological section of umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation group (hematoxylin-eosin staining staining, ×40), displaying typical neural cell-like morphology with the cavitates those were smaller as compared to the control group but larger as compared to the combination group

联合组出现典型的神经细胞样形态学改变且软化灶消失，有少量瘢痕，见图5。

注：联合组大鼠损伤脑组织内注射脐带间充质干细胞悬液+siRNA表达质粒+Lipofectamine 2000

图5 联合组出现典型的神经细胞样形态学改变且软化灶消失，有少量瘢痕(苏木精-伊红染色，× 40)

Figure 5 Histopathological section of combination group (hematoxylin-eosin staining, ×40), displaying typical neural cell-like morphology with absence of softened foci but a small amount of scars

荧光显微镜观察结果显示大鼠损伤灶脑组织中的CM-Dil阳性细胞数：对照组为0，脐带间充质干细胞组为(28.42±6.47)个/高倍视野，联合组为(51.64±10.32)个/高倍视野，三者经过方差分析后两组之间的比较用Dunnett t 检验。各组之间差异有显著性意义(P< 0.01)，见图6-8。

注：对照组大鼠损伤的脑组织内注射培养液图6 对照组冰冻切片荧光显微镜下观察未见CM-Dil标记的阳性细胞(×200)

Figure 6 Control group (fluorescence microscope, ×200), displaying absence of CM-Dil-labeled cells 图7 脐带间充质干细胞组冰冻切片荧光显微镜下CM-Dil标记的阳性细胞少于联合组多于对照组(×200)

Figure 7 Umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation group (×200), displaying CM-Dil-labeled cells were significantly fewer than those in the combination group but significantly more than those in the control group (×200)

注：联合组大鼠损伤脑组织内注射脐带间充质干细胞悬液+siRNA表达质粒+Lipofectamine 2000

图8 联合组冰冻切片荧光显微镜下观察可见有大量散在的CM-Dil标记的阳性细胞(×200)

Figure 8 Combination group (fluorescence microscope, ×200), displaying a large number of scattered CM-Dil-labeled cells (× 200)

2.6 RT-PCR检测RhoA mRNA结果经siRNA沉默RhoA基因4周后，联合组RhoA基因表达量较对照组、脐带间充质干细胞组RhoA基因表达量显著降低，差异有显著性意义(P < 0.05)。见图9，表3。

注：对照组大鼠损伤的脑组织内注射培养液；脐带间充质干细胞移植组大鼠损伤脑组织内注射脐带间充质干细胞悬液；联合组大鼠损伤脑组织内注射脐带间充质干细胞悬液+siRNA表达质粒+Lipofectamine 2000；说明联合组RhoA基因表达量较对照组、脐带间充质干细胞组RhoA基因表达量显著降低图9 对照组、脐带间充质干细胞组和联合组 RhoA mRNA电泳条带图

Figure 9 RhoA mRNA electrophoretic bands of each group

Figure 9 RhoA mRNA electrophoretic bands of each group 注：对照组大鼠损伤的脑组织内注射培养液；脐带间充质干细胞移植组大鼠损伤脑组织内注射脐带间充质干细胞悬液；联合组大鼠损伤脑组织内注射脐带间充质干细胞悬液+siRNA表达质粒+Lipofectamine 2000；与对照组比较，^aP < 0.05；与脐带间充质干细胞组比较，^bP < 0.05；说明联合组RhoA基因表达量较对照组、脐带间充质干细胞组RhoA基因表达量显著降低

表3 对照组、脐带间充质干细胞组和联合组沉默RhoA基因4周后RhoA mRNA的表达

Table 3 RhoA mRNA expression at 4 wk after RhoA gene silencing

参考文献

[1] Arabi YM, Haddad S, Tamim HM,et al. Mortality reduction after implementing a clinical practice guidelines–based management protocol for severe traumatic brain injury. J Crit Care.2010;25(2):190-195.

[2] Lee HC, Chuang HC, Cho DY, et al. Applying Cerebral Hypothermia and Brain Oxygen Monitoring in Treating Severe Traumatic Brain Injury. World Neurosurg. 2010;74(6): 654-660.

[3] Engelmann CM, Siert L. Cognitive disturbances following severe traumatic brain injury. Ugeskr Laege. 2007; 169(3): 217-219.

[4] Liliang PC, Liang CL, Weng HC, et al. Proteins in Serum Predict Outcome After Severe Traumatic Brain Injury. J Surg Res. 2010;160(2): 302-3078.

[5] Sekhon MS, Dhingra VK, Sekhon IS,et al.The safety of synthetic colloid in critically ill patients with severe traumatic brain injuries. J Crit Care.2011;26(4):357-362.

[6] Yoo BY, Shin YH, Yoon HH,et al.Application of mesenchymal stem cells derived from bone marrow and umbilical cord in human hair multiplication.J Dermatol Sci. 2010, 60(2): 74-83.

[7] Xu Y,Meng H,Li C,et alUmbilical cord-derived mesenchymal stem cells isolated by a novel explantation technique can differentiate into functional endothelial cells and promote revascularization. Stem Cells.2010;19(10):1511-1522.

[8] Matsuse D,Kitada M,Kohama M,et al. Human umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells differentiate into functional Schwann cells that sustain peripheral nerve regeneration.J Neuropathol Exp Neurol.2010;69(9):973-985.

[9] Yuan GF, Li HX. Zhongguo Xiandai Yixue Zazhi. 2011;21(13): 1435-1438.苑国富,李红星.大鼠颅脑损伤后亚低温治疗对RhoA 及Nogo- A 表达的影响[J].中国现代医学杂志,2011, 21(13):1435-1438.

[10] Wang QY, Liu WG, Wang ZY. Zhongguo Guke Linchuang yu Jichu Yanjiu Zazhi.2010;2(4):292-296.王求永,刘文革,王振宇.FTY720对大鼠急性脊髓损伤后RhoA 表达的影响[J].中国骨科临床与基础研究杂志,2010,2(4):292-296.

[11] Ahmed Z, Dent RG, Suggate EL, et al. Disinhibition of neurotrophin-induced dorsal root ganglion cell neurite outgrowth on CNS myelin by siRNA-mediated knockdown of NgR, p75NTR and Rho-A. Molecular and Cellular Neuroscience.2005;28(3):509-523.

[12] Chen L,Hui GZ,Zhang S,et al.Zhonghua Chuangshang Zazhi. 2009;25(6):498-502.陈镭,惠国桢,张赛,等.人脐血间充质干细胞移植促进大鼠颅脑损伤后神经功能的恢复[J].中华创伤杂志,2009,25(6):498- 502.

[13] Horisawa T, Ishibashi T, Nishikawa H, et al. The effects of selective antagonists of serotonin 5-HT7 and 5-HT1A receptors on MK-801-induced impairment of learning and memory in the passive avoidance and Morris water maze tests in rats: Mechanistic implications for the beneficial effects of the novel atypical antipsychotic lurasidone . Behavioural Brain Res. 2011;220 (1): 83-90.

[14] Mutlu O, Ulak G, Celikyurt IK et al, Effects of olanzapine, sertindole and clozapine on learning and memory in the Morris water maze test in naive and MK-801-treated mice.Pharmaco Biochem Behav. 2011;98(3): 398-404.

[15] Li L, Ding J, Marshall C, et al.Pretraining affects Morris water maze performance with different patterns between control and ovariectomized plus d-galactose-injected mice. Behavioural Brain Research.2011;217(1): 244-247.

[16] Hang RH, Xu YJ, Xie HF.Evaluating on recognition impairment after traumatic brain injury with WCST.Fa Yi Xue Za Zhi. 2011;27(5):346-349.

[17] Han SR, Yee GT, Choi CY,et al.Cortical laminar necrosis in an infant with severe traumatic brain injury.J Korean Neurosurg Soc. 2011;50(5):472-474.

[18] Shultz SR, Macfabe DF, Foley KA, et al.Sub-concussive brain injury in the Long-Evans rat induces acute neuroinflammation in the absence of behavioral impairments.Behav Brain Res. 2011;229(1):145-152.

[19] Settervall CH, Sousa RM, Silva SC.In-hospital mortality and the Glasgow Coma Scale in the first 72 hours after traumatic brain injury.Rev Lat Am Enfermagem. 2011;19(6):1337-1343.

[20] Yamashita S, Hasuo H, Tokutomi T,et al. Edaravone attenuates impairment of synaptic plasticity in granule cell layer of the dentate gyrus following traumatic brain injury. Kurume Med J. 2011;58(2):47-58.

[21] Han SR, Yee GT, Choi CY, et al Cortical laminar necrosis in an infant with severe traumatic brain injury.J Korean Neurosurg Soc. 2011;50(5):472-474.

[22] Hang RH, Xu YJ, Xie HF,et al. Evaluating on recognition impairment after traumatic brain injury with WCST.Fa Yi Xue Za Zhi. 2011;7(5):346-349.

[23] He JT, Mang J, Mei CL,et al. Neuroprotective effects of exogenous activin a on oxygen-glucose deprivation in PC12 cells.Molecules. 2011;30(17):315-327.

[24] Li GX,Wang CM,Gong LP,et al.Zhongguo Linchuang Shenjing Waike Zazhi. 2009,14(5):288-290.黎国雄,王传湄, 龚利平,等.神经干细胞立体定向脑内移植治疗大鼠重型颅脑损伤[J].中国临床神经外科杂志,2009,14(5): 288-290.

[25] Zhao EY, Wang LD, Wen QQ, et al. Fasudil hydrochloridedifferentiates bone marrow mesenchymal stem cells into neurons via Notch signaling. Neural Regen Res. 2010;5(11):814-819.

[26] Dergham P,Ellezam B,Essagian C,et al.Rho signaling pathwaytargeted to promote spinal cord repair. J Neurosci. 2002;22(15):6570-6577.

[27] Govek EE,Newey SE,Aelstl V. The role of the Rho GTPases in neuronal development. Genes Dev.2005;19(10): 1-49.

[28] Neuhof S,Moers J,Ricks M. Proliferation, diferentiation, and cytokine secretion of human umbilical cord blood-derivedmononuclear ceils in vitro.Exp Hematol.2007; 35(7):1119-1131.

[29] Pang KM, Sung MA, Alrash-dan MS, et al. Trans-plantation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord versus human umbilical cord blood for peripheral nerve regenera-tion. Neural Regen Res. 2010;5(11):838-845.

[30] Ha Y,Choi JU,Yoon DH,et a1.Neural phenotype expression of cultured human cord blood cells in vitro. Neurureport. 2001; 12(16):3523-3530.

[31] Buzahska L,Jurga M,Domafiska-Janik K.Neumnal differentiation of human umbilical cord blood neural stem- like cell line.Neurodegener Dis.2006;3(1-2):19-26.

[32] Wang D,Zhang JJ,Mang JJ.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010,14(14): 2539-2544.王东,张建军,马景鑑.神经干细胞NgR基因沉默立体定向移植治疗大鼠脑损伤[J].中国组织工程研究与临床康复,2010, 14(14): 2539-2544.

[33] Neuhof S,Moers J,Ricks M.Proliferation,diferentiation,and cytokine secretion of human umbilical cord blood-derived mononuclear ceils in vitro.Exp Hematol.2007;35(7): 1119-1131.

[34] Zhou GQ,Jin Y,Zhang P.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(45):8416-8420.周国庆,金怡,张鹏.沉默RhoA基因对骨髓间充质干细胞静脉移植治疗脑梗死大鼠的作用[J].中国组织工程研究与临床康复, 2010,14(45):8416-8420.

引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2010年4月至2011年6月在包头医学院第一附属医院完成。

材料：

实验动物：清洁级Wistar大鼠100只，雌雄各半，体质量250-300 g, 购自中国医学科学院动物实验室，动物质量合格证号：SCXK20070026。实验中对动物处置方法符合动物伦理学

要求。

实验方法：

靶向RhoA的siRNA表达质粒构建和扩增：根据NCBI基因数据库检索出大鼠RhoA的mRNA基因全长，将其编码区用基因沉默设计软件设计siRNA，RhoA的siRNA靶序列为：5’- GAA GUC AAG CAU UUC UGU CTT -3’，5’-GAC AGA AAU GCU UGA CUU CTT -3’，由上海生工生物工程公司合成。

脐带间充质干细胞的制备及鉴定：实验经过伦理委员会批准取足月妊娠剖宫产健康胎儿的脐带(经产妇知情同意)，PBS充分冲洗，剔除血管后，剩余的组织切割成直径约1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，应用1 g/LⅡ型胶原酶，2.5 g/L胰酶37 ℃消化30 min，离心，去上清，将组织块与细胞接种于培养皿，含体积分数5%胎牛血清的DMEM培养基中培养。第1次传代后每3 d按1∶3比例传代，进行扩增培养。取P3代细胞，消化后加人PE FITC标记的CD73、CD105、HLA-DR、CD31、VWF、KDR、CD34、CD45、CD235a流式抗体及相应对照标记，流式细胞仪检测。

脐带间充质干细胞的CM-Dil标记：吸取CM-Dil液5 µL至1.5 mL的EP管中，加入1 mL完全培养液，吹打均匀，即得CM-Dil标记液。取贴壁达90%融合的细胞，吸弃培养液，PBS洗3次，加入上述标记液40 µL/cm²，于37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度恒温培养箱中孵育20 min，吸弃标记液，加入37 ℃的完全培养液5 mL，孵育， 10 min后吸弃，继续加入培养液重复清洗2次。培养24 h后在倒置荧光显微镜下观察CM-Dil标记效果及细胞形态变化。随机选取5个视野，计数CM-Dil阳性细胞数及细胞总数，计算标记率。移植时用PBS洗涤细胞3次，将终浓度调为1×10¹⁰ L^-¹备用。

动物模型的建立及分组：清洁级Wistar大鼠以体积分数10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉后，采用液压颅脑损伤仪，按国际通用标准，对大鼠给予253.312 5- 303.975 kPa峰值的冲击压力，制成重度大鼠液压颅脑损伤模型^[11]。损伤后出现自主呼吸暂停者，立即用小动物呼吸机给予面罩吸氧。共打击100只，打击后立即死亡7只，伤后第2天内死亡9只，其余84只进行分组实验。随机区组法分为3组，每组28只。

建模后72 h将大鼠再次麻醉，打开原先骨窗，用5 µL微量注射器立体定向注射。对照组大鼠向损伤的脑组织内注射3 μL的不含脐带间充质干细胞的培养液(于骨窗边缘分3点注入，每点1 μL，深度为硬膜下3.0 mm，留针10 min，缓慢退针，缝合头皮)；脐带间充质干细胞移植组向损伤的脑组织内注射脐带间充质干细胞悬液 3 μL(2×10⁵ L^-¹)；联合组向损伤的脑组织内注射脐带间充质干细胞悬液3 μL (2×10⁵ L^-¹)，同时将预先溶于PBS中的siRNA表达质粒与Lipofectamine 2000轻柔混合后静置20 min，用10 μL微量注射器注射于大鼠脑组织损伤区注射1次(分3个不同角度注射使质粒分布均匀)，缝合头皮。3组腹腔均注射庆大霉素2 000 U抗菌治疗，回笼饲养。

神经功能评估：根据神经损伤严重程度评分(NSS)方法^[12]，于伤前、伤后1 d及伤后1，2，3，4周进行，评分的标准如下：13-18分：重型颅脑损伤；7-12分：中型颅脑损伤；1-6分：轻型颅脑损伤。评分采用盲法，两人同时间对大鼠进行独立观察评分，取低值为准。评分越低表示神经运动功能恢复越好。

Morris水迷宫试验：在创伤性脑损伤后23-28 d进行Morris水迷宫装置检测学习记忆能力^[13-15]。①空间定航实验：历时5 d半，记录每只大鼠从入水到找到并爬上平台所需的时间，即逃避潜伏期。②空间探索实验：第5天下午撤掉平台，让大鼠在迷宫内自由活动2 min，记录其经过平台原址的次数(times of passing platform)。

苏木精-伊红染色和荧光显微镜观察：每组在伤后4周随机各取6只大鼠麻醉处死，取材行损伤处组织学检查以证实恢复程度。取损伤处组织，40 g/L多聚甲醛固定，行常规冰冻切片，对组织切片进行苏木精-伊红染色及荧光显微镜观察。每张切片在高倍镜(×200)下任取10个视野，计算每个视野中的CM-Dil 阳性细胞数，取均值作为各组CM-Dil阳性细胞数。

RT-PCR检测RhoA mRNA：每组在伤后4周随机各取6只大鼠麻醉处死，取材行损伤处组织Trizol试剂法提取大鼠脑损伤区的组织总RNA，按PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit 说明书操作，以反转录法先合成第一链cDNA，再以cDNA 为模板进行PCR 扩增。RhoA mRNA引物序列：正义链，5’-TAG AGT TGG CTT TAT GGG ACA C-3’，反义链，5’-GCT TCA CAA GAT GAG GCA CC-3’；预扩增引物长度为428 bp；以β-actin 作内参照，引物序列：正义链，5’- CAC GAT GGA GGG GCC GGA CTC ATC-3’，反义链，5’-TAA AGA CCT CTA TGC CAA CAC AGT-3’；预扩增引物长度为240 bp。RT-PCR产物经1.3%琼脂糖凝胶电泳后进行凝胶成像系统分析处理，以RhoA与β-actin的灰度比值表示相对RhoA mRNA水平。

主要观察指标：①改良神经功能损伤评分系统(mNSS)评价大鼠神经功能恢复情况。②Morris水迷宫试验结果。③CM-Dil标记的脐带间充质干细胞的存活和分布情况。④各组损伤区脑组织RhoA基因的表达量。

统计学分析：用SAS 8.0软件进行统计分析。所得数据以x(_)±s表示，采用重复测量方差分析和t 检验进行统计学检验。P < 0.05表示两组间差异有显著性意义。

讨论

颅脑损伤是脑外科最为常见的急症之一，其来势猛、病情急，致残率和死亡率都较高^[16-18]。近年来随着交通事故的增加使颅脑损伤的发生率亦渐增，颅脑损伤在全身创伤发生率中位居第2位，但致死率和致残率却占第1位。在理论研究和临床实践中，颅脑损伤后的中枢神经再生一直是困扰医学界的重大难题。因而外伤导致对中枢神经的损害使尤为严重得，诸如脊髓损伤所致的瘫痪、脑皮质功能受损或消失等^[19-21]。近几年来，相关研究结果显示：干细胞具有较强的增殖和分化能力(如脐带间充质干细胞可向神经细胞分化已逐渐引起人们的重视)，且在颅脑损伤修复方面发挥了重要的临床应用价值^[22]。在颅脑损伤性损伤后，神经细胞的修复与再生应该是一个与多种因子的调节有关的过程^[23-24]，积极研究其微环境的调控，进而给创伤性脑损伤的治疗提供一个更为符合其神经恢复与再生的微环境。

在颅脑损伤后数小时内即可有神经元批量的死亡，且这种损伤能持续几周甚至几个月，而在这一病理变化作用中，Rho A发挥着重要的作用。Rho A是细胞内传导抑制信号，是参与信号级联放大过程和调控细胞支架动力学的关键物质。研究显示，Rho A激活后通过Rho激酶使微管、微丝等细胞内骨架发生重排而导致神经突起的回缩，这些反应过程与其到LM激酶磷酸化，肌球蛋白轻链磷酸酶的抑制，以及mDia蛋白的激活等下游信号分子的改变有关^[25-26]。激活的Rho A通过作用于肌球蛋白，肌球蛋白收缩引起轴突生长锥的回缩及塌陷而产生抑制神经修复的作用。神经生长锥内Rho A活性的不对称性可引起生长锥转向，其机制可能是当生长锥内一侧的RhoA活性较另一侧高时，丝状伪足在RhoA活性低的一侧受到的抑制较弱，延伸更快，因此生长锥朝向该侧转向^[27]。

人脐带间充质干细胞具有诸多优点：①人脐带间充质干细胞具有来源广泛，无异体排斥，易于保存、采集，分离成功率可达100%。②脐带间充质干细胞扩增迅速、增殖能力强，转染效率高可作为基因治疗的载体。③脐带间充质干细有多向分化潜能，它在体内外可以分化为骨、软骨细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、心肌细胞以及神经元细胞等^[28-29]。④脐带间充质干细胞在适宜的微环境下，有分化为胶质细胞和多种神经元的潜能，且可以分泌大量的神经营养因子，帮助损伤脊髓组织的修复及崩解轴突的连续性重建。⑤脐带时分娩时被遗弃的组织，不存在伦理道德等方面的约束。

脐带间充质干细胞移植治疗神经系统损伤通过以下作用机制来实现：①移植后的脐带间充质干细胞向病变部位的组织渗透融合、替代或补充损伤神经细胞，发挥恢复神经功能的作用^[30]。②移植的脐带间充质干细胞可以经旁分泌或自分泌方式分泌一些细胞因子和营养因子进而改善损伤局部的微环境^[31]，使一些脑实质内的神经干细胞分化为神经元而进行自我修复^[32]。③移植的脐带间充质干细胞还可为创伤性脑损伤宿主轴突再生提供一个连接通道，方便再生的神经轴突顺利通过损伤处，帮助其实现损伤神经的远、近侧残端重新形成神经突触联系的目的。由于单纯干细胞移植对颅脑损伤的修复作用不完全理想，还需要结合生物工程材料、药物、物理等手段进行综合治疗^[33-34]。

根据人脐带间充质干细胞的这些特点，实验通过RNA干预介导的RhoA基因沉默联合脐带间充质干细胞治疗大鼠脑损伤，进一步提高了脐带间充质干细胞移植治疗大鼠颅脑损伤的效果，为脑损伤的治疗提供了新的实验依据。且无论从组织学上还是功能学上疗效都有明显的提高，这为临床治疗颅脑损伤提供新的思路和方法。