体外诱导骨髓间充质干细胞向胆管上皮样细胞分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.01.003

摘要/Abstract

摘要：

背景：肝外胆管和胆囊上皮细胞的分离、纯化相对比较容易，但是胆管上皮细胞在体外易失去增殖能力，难以提供基础研究所需的细胞量，限制了胆管修复等基础研究的进程。虽然骨髓间充质干细胞可以转化为肝细胞，但是尚无体外培养骨髓间充质干细胞分化为胆管上皮细胞的报道。
目的：探讨体外诱导骨髓间充质干细胞分化为胆管上皮细胞的可行性。
方法：采取全骨髓贴壁筛选法体外分离并纯化大鼠骨髓间充质干细胞后，在第3代骨髓间充质干细胞培养基中加入肝细胞生长因子和表皮生长因子，倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞的形态学变化，免疫荧光检测不同时间CK19的表达情况。
结果与结论：在肝细胞生长因子和表皮生长因子的诱导下，骨髓间充质干细胞由梭形逐渐变为多边形、三角形；免疫荧光检查显示诱导第4周细胞膜开始表达CK19，诱导第6周CK19表达率明显提高。结果表明在两种细胞因子联合诱导下骨髓间充质干细胞能够转化为胆管上皮样细胞，从而为骨髓间充质干细胞修复损伤胆管提供了一个新思路。

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 肝细胞生长因子, 表皮生长因子, 胆管上皮细胞, CK19, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Extrahepatic bile duct and gallbladder epithelial cells are easily isolated and purified, but bile duct epithelial cells predispose to lose proliferative capacity under in vitro circumstances. Thus, enough amounts of cells used for basic studies are hardly acquired, which limits the progression of bile duct repair. Bone marrow mesenchymal stem cells can be differentiated into hepatocytes, but there have been no reports regarding in vitro induced differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into bile duct epithelial cells.
OBJECTIVE: To discuss the feasibility of inducing bone marrow mesenchymal stem cells into the bile duct epithelial cells in vitro, and to find suitable seed cells for the repair of bile duct injury.
METHODS: Rat bone marrow mesenchymal stem cells were in vitro isolated and purified by whole bone marrow adherent screening in vitro. Passage 3 bone marrow mesenchymal stem cells were cultured with culture medium containing hepatocyte growth factor and epidermal growth factor. The morphological changes of bone marrow mesenchymal stem cells were observed under the inverted microscope and CK19 expression was detected by immunofluorescence assay at different time periods.
RESULTS AND CONCLUSION: Under the induction by hepatocyte growth factor and epidermal growth factor, bone marrow mesenchymal stem cells gradually appeared from shuttle-shaped to polygonal or triangular. Immunofluorescence examination showed that CK19 expression appeared in the cell membrane in the 4th week of induction and it was significantly increased in the 6th week. These findings suggest that bone marrow mesenchymal stem cells can be induced to differentiate into duct epithelial-like cells under the combined induction of hepatocyte growth factor and epidermal growth factor, which provides a new thought for bile duct repair with bone marrow mesenchymal stem cells.
Key Words: stem cells; bone marrow-derived stem cells; bone marrow mesenchymal stem cells; hepatocyte growth factor; epidermal growth factor; bile duct epithelial cells; CK19; stem cell photographs-containing paper

Key words: stem cells, bone marrow-derived stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, hepatocyte growth factor, epidermal growth factor, bile duct epithelial cells, CK19, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 6

2.1 骨髓间充质干细胞形态及鉴定刚接种的细胞以圆形及椭圆形为主，6-8 h开始贴壁，72 h细胞基本完成贴壁，五六天时部分区域细胞呈集落生长形成细胞丛，10-12 d后贴壁细胞可基本铺满培养瓶底，传代后 12 h绝大部分细胞贴壁，四五天即可铺满瓶底，传至第3代后，细胞为单一的梭形成纤维样，呈放射状或平行排列，形态趋于一致，见图1。第3代呈对数期生长骨髓间充质干细胞经CD44抗体和DAPI染色后，荧光显微镜下见所有骨髓间充质干细胞细胞核均已被标记蓝色荧光，90%以上胞体显示绿色荧光，见图2。

图1 第3代骨髓间充质干细胞为单一的梭形成纤维细胞样细胞，呈放射状或平行排列，形态趋于一致(倒置显微镜，×100)

Figure 1 Passage 3 bone marrow mesenchymal stem cells are uniform shuttle-shaped fibroblast-like cells arranged in a radiation-like or parallel manner (inverted microscope, ×100)

图2 第3代骨髓间充质干细胞CD44表达阳性，荧光显微镜下，细胞膜显示绿色荧光，细胞核显示蓝色荧光(免疫组织化学染色，×200)

Figure 2 Positive expression of CD44 on passage 3 bone marrow mesenchymal stem cells. Through fluorescence microscopy, cell membrane exhibits green fluorescence and cell nucleus exhibits blue fluorescence (immunohistochemical staining, ×200)

2.2 诱导细胞形态及第3代骨髓间充质干细胞的鉴定接种后细胞呈典型的细长梭形，经诱导分化4周后骨髓间充质干细胞逐渐变为短梭形、三角形、类圆形细胞，仍以梭形细胞为主，细胞核所占体积逐渐增大，见图3。

图3 骨髓间充质干细胞诱导4周后，细胞形态由长梭形变为短梭形、三角形或类圆形，但仍以梭形细胞为主(倒置显微镜，×100)

Figure 3 After 4 wk induction, bone marrow mesenchymal stem cells appeared from long shuttle-shaped to short shuttle-shaped, triangular or round (inverted microscope,×100)

诱导第6周，细胞形态无明显变化，但是细胞明显增多，部分聚集成团，形态类似胆管上皮细胞，见图4。

图4 骨髓间充质干细胞诱导6周后，细胞数目明显增多，出现细胞群落，群落内细胞出现拉丝、拉网现象(倒置显微镜，×100)

Figure 4 After 6 wk induction, bone marrow mesenchymal stem cells increased in quantity, and cell masses formed (inverted microscope,×100)

诱导的第4周，CK19抗体和DAPI染色后，荧光显微镜下见所有骨髓间充质干细胞细胞核显示蓝色荧光，个别细胞膜显示绿色荧光，见图5。

图5 骨髓间充质干细胞诱导4周后CK19表达阴性，荧光显微镜下，细胞核显示蓝色荧光，极个别细胞膜显示绿色荧光(免疫组织化学染色，×100)

Figure 5 Negative expression of CK19 on bone marrow mesenchymal stem cells after 4 wk induction. Through the fluorescence microscopy, cell nucleus exhibited blue fluorescence and individual cell membrane exhibited green fluorescence (immunohistochemical staining, ×100)

诱导培养的第6周，经CK19抗体和DAPI染色后，荧光显微镜下见所有细胞核均已被标记蓝色荧光，细胞膜显示绿色荧光，蓝色的细胞核位于绿色细胞膜的中间，见图6。

图6 骨髓间充质干细胞诱导6周后CK19表达阳性，荧光显微镜下，细胞核显示蓝色荧光，细胞膜显示绿色荧光(免疫组织化学染色，×400)

Figure 6 Positive expression of CK19 on bone marrow mesenchymal stem cells after 6 wk induction. Through the fluorescence microscopy, cell nucleus exhibited blue fluore scence and cell membrane exhibited green fluorescence (immunohistochemical staining, ×400)

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引言

材料方法

设计：体外细胞培养、诱导和观察。

时间及地点：实验于2011年6月至2012年2月在大连大学附属中山医院中心实验室完成。

材料：

实验动物：健康清洁级SD大鼠8只，雌雄各半，三四周龄，由大连医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(辽)2008-0002，实验期间动物在标准房内饲养，自由饮食，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。

方法：

骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定：大鼠颈椎脱臼处死，碘伏浸泡3 min，体积分数为75%乙醇脱碘，无菌生理盐水流水冲洗，完整脱去双下肢皮肤，取出下肢，生理盐水冲洗，使用纱布剥离出股骨和胫骨，剪除干骺端，5 mL注射器吸取PBS反复冲洗骨髓腔于培养皿内，吹打混匀后冲洗液经800 r/min离心5 min，弃上清。高倍镜下调整细胞浓度，细胞铺满视野80%-90%为宜， 4 mL/瓶，接种于25 mL的培养瓶中，于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养。3 d后更换培养基，去除未贴壁细胞，以后每隔3 d换液1次，细胞铺满90%培养皿时，含0.02%EDTA的2.5 g/L胰蛋白酶消化，倒置显微镜下控制消化时间，培养液重悬细胞，按1∶2比例传代。取生长良好的第3代细胞消化，以1×10⁸ L^-¹接种于预先放置洁净、灭菌的盖玻片24孔板中，继续培养四五天，细胞铺满盖玻片表面90%后，以新鲜配置的40 g/L多聚甲醛在室温下固定30 min，0.2%的TritonX-100通透细胞，37 ℃静止30 min，滴加体积分数为10%山羊血清37 ℃封闭30 min(不冲洗，仅吸干液体即可)，分别在不同细胞爬片上滴加一抗-兔抗大鼠CD44、CD34(稀释浓度1∶100)放入湿盒子中4 ℃过夜(16-18 h)，避光下滴加FITC标记的二抗-山羊抗兔IgG(稀释浓度1∶50)， 37 ℃孵育2 h，将50 mg/L无菌的DAPI储存液加入盖玻片上，置37 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度的孵育箱内孵育2 h后，中性树胶封固，于荧光显微镜下观察并拍照。

骨髓间充质干细胞向胆管上皮细胞的诱导培养和检测：取生长良好的第3代细胞消化、离心后，培养基重悬，调整细胞浓度为(1.0-2.0)×10⁸ L^-¹。400 μL/孔接种于预先放置洁净、灭菌的盖玻片的24孔板中，置于体积分数为5% CO₂、饱和湿度、37 ℃培养箱中培养。24 h后换液，除去死亡细胞，每孔加入400 μL含10 mg/L肝细胞生长因子、10 mg/L表皮细胞生长因子的DMEM/F12 (1∶1)诱导培养基，每隔3 d换液1次，每天于倒置显微镜下观察细胞形态学变化。按照骨髓间充质干细胞的检测方法，在培养的4，6周取盖玻片行免疫荧光检测CK19的表达情况。

主要观察指标：①倒置显微镜下骨髓间充质干细胞原代和传代培养过程中细胞形态学变化。②免疫组化检测第3代骨髓间充质干细胞CD34、CD44表达情况。③倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞在细胞生长因子诱导下细胞形态学变化。④免疫组化检测经细胞生长因子诱导的骨髓间充质干细胞CK19的表达。

讨论

骨髓间充质干细胞是来源于中胚层、存在于骨髓基质内的非造血细胞来源的细胞亚群，经体外扩增和诱导后可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞、角质形成细胞、神经细胞与支持造血干细胞的基质细胞，显示出多分化的潜能^[2-4]。其来源广泛，具有低免疫原性，是组织工程首选种子细胞^[5-6]。国内外大量的研究表明体外培养的骨髓间充质干细胞可以成功诱导分化为肝细胞^[7]，注射到体内的骨髓间充质干细胞能转化为肝细胞并能促进肝功能的恢复^[8]，相关的动物实验发现骨髓间充质干细胞植入急性肝损伤大鼠的第7天，在汇管区形成小的胆管，且新生的小胆管亦明显多于对照组，并向肝实质内迁^[9]，体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的第3周可以检测出CK19的表达^[10]，但是体外定向诱导骨髓间充质干细胞分化为胆管上皮细胞的研究目前还少有报道。本实验将诱导时间由以往的3周延长至6周，观察到在肝细胞生长因子和表皮生长因子的双重诱导下，骨髓间充质干细胞在诱导的第6周均能表达CK19。

骨髓间充质干细胞的分离和培养：骨髓间充质干细胞的分离方法主要有全骨髓培养法和密度梯度离心法^[11-12]，全骨髓培养法是一种快速、可靠、简便稳定的技术方法，在实际应用中优于密度梯度离心法^[13]。根据造血干细胞悬浮生长而骨髓间充质干细胞贴壁生长的特性^[14]，采用全骨髓贴壁法成功分离出骨髓间充质干细胞，通过多次换液及传代培养，逐渐去除悬浮的血细胞和造血干细胞，第3代骨髓间充质干细胞为单一的梭形成纤维样细胞，呈放射状或平行排列，几乎无杂质细胞存在。对于骨髓间充质干细胞的检测，目前尚没有公认的特异性抗原表型，其表面分子兼有间质、内皮、上皮和肌肉细胞的特征^[15]，从大多数实验结果来看，SH2，SH3，CD29，CD44，CD71，CD90，CD106，CD120a，CD124等呈阳性，但CD14，CD34和CD45造血谱系标记则呈阴性^[16-19]，目前多采用排除法来间接鉴定骨髓间充质干细胞。根据国际间充质及组织干细胞委员会于2006年对人来源骨髓间充质干细胞实验研究提出3条最低鉴定标准^[20]。本实验培养的骨髓间充质干细胞在标准培养条件下，具有对塑料器皿的贴附特性；免疫组化显示骨髓间充质干细胞表面CD44阳性表达，CD34呈阴性表达；因实验时间紧迫，未诱导转化为成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞，但是可以诱导分化为胆管上皮细胞，从而证实本研究分离培养的大鼠骨髓细胞为骨髓间充质干细胞。

骨髓间充质干细胞诱导转化胆管样上皮细胞：肝细胞生长因子、表皮生长因子是细胞培养中常用的添加剂，其中表皮生长因子是效果比较肯定的一类生长因子，它能诱导骨髓间充质干细胞定向分化为肝细胞^[21-22]，并能促进肝细胞和胆管上皮细胞的增殖^[23-24]。表皮生长因子能刺激细胞增殖、分化和迁移，在伤口愈合和器官发生中扮演着重要角色，在体外胆管上皮细胞的培养中发现，表皮生长因子促进胆管上皮细胞的增殖，形成大小不等的“细胞岛”，细胞间连接紧密，呈“铺路石”状贴壁生长，使胆管上皮细胞体外存活时间由12 d延长至21 d^[25-26]。本研究中表皮生长因子和肝细胞生长因子联合诱导培养4周时，相差显微镜下见骨髓间充质干细胞细胞核逐渐变大，细胞质减少，形态由长梭形逐渐变为短梭形、三角形、类圆形细胞，随着诱导时间的延长，类圆形细胞逐渐增多，在诱导的第6周可见大量的细胞团，类似体外培养的胆管上皮细胞形成的“细胞岛”。

胆管上皮细胞的鉴定：CK属于中间纤维蛋白家族，是细胞骨架的构成部分，CK有20种不同的类型，其中CK19属酸性(Ⅰ型)细胞角蛋白，在肝脏中CK19只在胆管肿瘤细胞、胆管上皮细胞及其祖细胞中表达，在肝细胞、肝干细胞及肝肿瘤细胞中并不表达，因此CK19是目前公认的胆管上皮细胞的特征性标记物，可以应用于肝细胞及胆管上皮细胞的鉴别^[27-28]。在本实验中，诱导的第4周免疫荧光检测显示CK19仅有微量表达，在诱导的第6周几乎所有细胞表面均有大量的CK19表达，而CK19在传代培养的骨髓间充质干细胞中始终未表达，说明该细胞具有胆管上皮细胞的特征性标志。

总之，肝细胞生长因子联合表皮生长因子可以诱导体外培养的骨髓间充质干细胞分化为类胆管上皮细胞，并能促进类胆管上皮细胞的增殖，该细胞具有骨髓间充质干细胞和胆管上皮细胞的双重功能，可以作为组织功能胆管复合体的种子细胞，用于损伤胆管的修复。体外培养的骨髓间充质干细胞或诱导分化的胆管上皮细胞贴附于胆管支架上构建出组织工程胆管植入到狭窄部位后，能否在胆汁中生长或分化为具全部功能的胆管上皮细胞仍需进一步实验去验证。