亚低温下脑缺血大鼠骨髓间充质干细胞迁移和梗死体积的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2012.49.006

中国组织工程研究 ›› 2012, Vol. 16 ›› Issue (49): 9152-9156.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2012.49.006

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亚低温下脑缺血大鼠骨髓间充质干细胞迁移和梗死体积的变化

张其梅¹，彭玉¹，游辉¹，李守华²，严国山³，张昭文¹，杨波¹，兰晶¹，郑铮¹，池英¹

1三峡大学第一临床医学院&宜昌市中心人民医院神经内科，湖北省宜昌市 443003； 2宜昌市夷陵医院神经内科，湖北省宜昌市 443100；3当阳市人民医院神经内科，湖北省当阳市 444100

收稿日期:2012-05-07 修回日期:2012-07-16 出版日期:2012-12-02 发布日期:2012-07-16
通讯作者: 彭玉，硕士，副主任医师，三峡大学第一临床医学院&宜昌市中心人民医院神经内科，湖北省宜昌市 443003 ycpengyu@126.com
作者简介:张其梅★，女，1965年生，湖北省宜昌市人，汉族，1987年华中科技大学同济医学院毕业，硕士，主任医师，主要从事神经病学的研究。 ycpengyu123@126.com
基金资助:
湖北省三峡大学第一临床医学院科研发展项目；宜昌市科技研究与开发项目(A11301-05)。

Migration of bone marrow mesenchymal stem cells and changes in infarct volume in rats with cerebral ischemia under mild hypothermia

Zhang Qi-mei¹, Peng Yu¹, You Hui¹, Li Shou-hua², Yan Guo-shan³, Zhang Zhao-wen¹, Yang Bo¹, Lan Jing¹, Zheng Zheng¹, Chi Ying¹

¹Department of Neurology, the First Clinical Medical College, Yichang Central People’s Hospital, Three Gorges University, Yichang 443003, Hubei Province, China; ²Department of Neurology, Yichang Yiling Hospital, Yichang 443100, Hubei Province, China; ³Department of Neurology, Dangyang People’s Hospital, Dangyang 444100, Hubei Province, China

Received:2012-05-07 Revised:2012-07-16 Online:2012-12-02 Published:2012-07-16
Contact: Peng Yu, Master, Associate chief physician, Department of Neurology, the First Clinical Medical College, Yichang Central People’s Hospital, Three Gorges University, Yichang 443003, Hubei Province, China ycpengu@126.com
About author:Zhang Qi-mei★, Master, Chief physician, Department of Neurology, the First Clinical Medical College, Yichang Central People’s Hospital, Three Gorges University, Yichang 443003, Hubei Province, China Ycpengyu123@126.com
Supported by:
Research and Development Projects of Hubei Science and Technology Bureau*; a grant from the First Clinical Medical College of Three Gorges University, No. A11301-05*

摘要/Abstract

摘要：

背景：关于亚低温运用到神经损伤修复领域的研究已有一些报道，但亚低温对神经干细胞在脑内移植迁移的影响还不太清楚。
目的：观察亚低温对移植入脑缺血大鼠侧脑室的骨髓间充质干细胞迁移及脑梗死体积的影响。
方法：采用Longa法永久性闭塞SD大鼠大脑中动脉制作局灶性脑缺血损伤模型，50只大鼠随机摸球法分为亚低温组、对照组、假手术组。亚低温组于移植前应用亚低温处理大鼠急性脑缺血损伤，对照组于移植前应用常温处理大鼠急性脑缺血损伤；假手术组大鼠麻醉后分离结扎右侧颈内总动脉。亚低温组和对照组在造模后24 h，在脑立体定向下经侧脑室注射移植用5-BrdU标记的骨髓间充质干细胞。经过5，14，21 d后用免疫组织化学方法检测各组大鼠脑组织BrdU阳性细胞数。
结果与结论：骨髓间充质干细胞移植第14天多数标记的骨髓间充质干细胞已经迁移至梗死灶周围，移植后亚低温组各时间点梗死灶周边皮质的BrdU阳性细胞数明显多于对照组(P < 0.05)。与对照组比较，亚低温组在移植前后各个时间点脑梗死体积均显著减小(P < 0.05)。提示移植前宿主亚低温处理可以促进骨髓间充质细胞的定向迁移，且脑梗死体积显著减小。

关键词: 亚低温, 骨髓间充质干细胞, 脑梗死, 脑缺血, 迁移, 定向迁移, 移植, 神经营养因子, 侧脑室, 梗死体积

Abstract:

BACKGROUND: There are a few reports addressing the application of mild hypothermia to the study of repairing the nerve injury, but few reports have addressed the effects of mild hypothermia on the migration of neural stem cells in the brain following transplantation.
OBJECTIVE: To explore the effects of mild hypothermia on the migration of bone marrow mesenchymal stem cells transplanted into the lateral ventricle of rats with cerebral ischemia, as well as the effect on the infarct volume.
METHODS: A focal cerebral ischemic injury model of right middle cerebral artery occlusion was established using modified Longa’s method in Sprague-Dawley rats. Fifty rats were divided into mild hypothermia group, control group and sham-operation group. Local mild hypothermia was applied in the mild hypothermia group before transplantation for the treatment of acute cerebral ischemia. Normal body temperature was maintained in control group before transplantation for the treatment of acute cerebral ischemia. The right carotid artery of rats in the sham-operation group was separated and ligated after anesthesia. At 24 hours following model establishment in the mild hypothermia group and the control group, bone marrow mesenchymal stem cells labeled with 5-BrdU were transplanted into the rat lateral ventricle. The amount of BrdU-positive cells in the brain tissue in each group was measured by immunohistochemistry at 5, 14 and 21 days following injection in each group.
RESULTS AND CONCLUSION: At 14 days after transplantation, a majority of labeled bone marrow mesenchymal stem cells had migrated to the infarct area. At various time points following transplantation, the number of BrdU-positive cells in the cortex around infarction focus was obviously greater in the hypothermia group compared with the control group (P < 0.05). Compared with the control group, the infarct volume in the mild hypothermia group at various time points was reduced significantly (P < 0.05). Results indicate that mild hypothermia before transplantation may promote the direct migration of bone marrow mesenchymal stem cells, and can reduce the infarct volume.

中图分类号:

R394.2

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R394.2

张其梅，彭玉，游辉，李守华，严国山，张昭文，杨波，兰晶，郑铮，池英. 亚低温下脑缺血大鼠骨髓间充质干细胞迁移和梗死体积的变化[J]. 中国组织工程研究, 2012, 16(49): 9152-9156.

Zhang Qi-mei, Peng Yu, You Hui, Li Shou-hua, Yan Guo-shan, Zhang Zhao-wen, Yang Bo, Lan Jing, Zheng Zheng, Chi Ying. Migration of bone marrow mesenchymal stem cells and changes in infarct volume in rats with cerebral ischemia under mild hypothermia [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2012, 16(49): 9152-9156.

图/表（结果） 3

亚低温组各时间点梗死灶周边皮质BrdU阳性细胞数明显多于对照组，见表1。

注：随时间的增加，各组BrdU阳性细胞数逐渐增加；亚低温组各时间点BrdU阳性细胞数均明显多于对照组。与对照组比较，^aP < 0.05 表1 大鼠骨髓间充质干细胞移植后各时间点梗死灶周边皮质BrdU阳性细胞数

Table 1 Number of BrdU-positive cells in the cortex around infarction focus at different time points after rat bone marrow mesenchymal stem cells transplantation

2.5 脑梗死体积检测结果骨髓间充质干细胞移植后各时间点亚低温组脑梗死体积与对照组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

表2 大鼠骨髓间充质干细胞移植后各时间点脑梗死体积 Table 2 Infract volume at different time points after rat bone marrow mesenchymal stem cells transplantation

2.1 实验动物数量分析右侧大脑中动脉缺血模型因麻醉过量死亡2只，移植后感染死亡2只，均给予补足。50只用于实验观察的大鼠均进入结果分析，中途无脱失。

2.2 经原代、传代培养的骨髓间充质干细胞形态原代培养的骨髓间充质干细胞呈圆形，贴壁后大部分细胞呈梭形，细胞集落间相互融合成单层，排列具有一定方向性。成集落样生长，胞体透亮，折光性好；传代1次呈均匀分布，融合成片。体外BrdU标记的细胞免疫组化染色示核为棕色。

2.3 组织切片BrdU染色分析各组切片的免疫组化染色结果良好。BrdU阳性反应物呈棕褐色、颗粒状或弥漫性分布，位于细胞核内。

2.4 各时间点梗死灶周边皮质BrdU阳性细胞数骨髓间充质干细胞移植后5 d，两组大鼠脑组织梗死灶周围的BrdU阳性细胞逐渐增多，至移植14 d达高峰，见图1。在移植21 d后，BrdU染色阳性细胞均可见在缺血侧脑组织内存活，并且聚集于缺血梗死区域，梗死皮质下可见带状排列的染色阳性细胞，假手术组未见BrdU染色阳性细胞，见图2。

注：细胞移植后5 d脑组织梗死灶周围的BrdU阳性细胞(箭头)逐渐增多，14 d达高峰
Figure 1 BrdU-positive cells could be seen in the mild hypothermia group after bone marrow mesenchymal stem cells transplantation (×400)
图1 亚低温组大鼠骨髓间充质干细胞移植5，14 d后BrdU染色可见阳性细胞(×400)
Figure 2 Observation of the BrdU-positive cells in the mild hypothermia group at 21 d after bone marrow mesenchymal stem cells transplantation; BrdU-positive cells were not detected in rat cerebral ischemia and infarction area of the sham-operation group (×400)
图2 亚低温组大鼠骨髓间充质干细胞移植21 d后Brdu染色
阳性细胞观察，假手术组大鼠脑缺血梗死区域未见BrdU染色阳性细胞(×400)

参考文献

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2011年8至10月在武汉大学人民医院神经科实验室完成。

材料：

实验动物：健康SD大鼠54只，2月龄，体质量(180±20) g，雄性，由武汉大学动物实验中心提供，许可证号SCXK(鄂) 2008-0004，SPF级，随机摸球法选取50只大鼠分为亚低温组(n=20)，对照组(n=20)和假手术组(n=10)。实验过程中对动物处置符合科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》的相关要求^[12]。

骨髓间充质干细胞的分离、培养：取4只SD大鼠麻醉后脱颈处死，立即切开皮肤及皮下组织，碘伏消毒后，无菌条件下取大鼠后腿股骨的骨髓细胞，采用贴壁法进行分离培养^[13]，待细胞增殖达80%-90%融合结束原代培养，按1∶3比例进行传代至第5代，每代用倒置相差显微镜观察细胞形态^[14-15]。

体外BrdU标记骨髓间充质干细胞：移植前 2 d，取约80%融合的第3代骨髓间充质干细胞,弃除培养基，加入含10 g/L BrdU的培养基，置培养箱中孵育48 h弃去培养基，细胞浓度为5×10⁶ L^-¹备用。

大鼠局灶性脑缺血模型的建立和亚低温处理：采用Longa法栓塞大鼠右侧大脑中动脉制作大鼠局灶性脑缺血损伤模型^[16]。待大鼠苏醒后依据longa 5分制标准筛选出2分或3分的脑缺血模型进入移植实验。0分：无神经功能缺损症状，活动正常；1分：不能伸展对侧前爪；2分：爬行时出现向左转圈；3分：行走时身体向偏瘫侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。亚低温组脑缺血后立即将大鼠置于温控环境中诱导亚低温，时间约为30 min，并使大鼠肛温稳定控制在(34±1) ℃，持续至移植后14 d逐渐复温至正常体温。对照组和假手术组于移植前应用常温处理大鼠急性脑缺血损伤。

细胞移植实验：模型鼠经亚低温处理24 h后，与对照组大鼠一同麻醉、固定，局部消毒后切开头顶皮肤，用脑立体定位仪固定大鼠头部，参照大鼠脑定向图谱^[17]，用牙科钻在颅顶钻一直径约1.0 mm的圆孔，用微量注射针头经此圆孔垂直刺入左侧侧脑室，缓慢推注20 μL (5×10⁶)骨髓间充质干细胞细胞悬液，留针10 min后缓慢拔针防止细胞外溢。动物清醒后送笼喂养观察。

脑组织切片的制备：移植5，14，21 d后各组大鼠麻醉致死后，40 g/L多聚甲醛进行心脏灌流，取脑，放于40 g/L的多聚甲醛溶液中固定24 h。常规脱水、透明、石蜡包埋。选择含梗死灶中心部位脑组织连续冠状切片。

TTC染色：将取材的新鲜脑组织置于4 ℃生理盐水中5 min，然后置于-20 ℃冰箱20 min。取出后从额极开始，从前往后作冠状位连续切片，每片厚度2 mm。将脑片置于1%TTC溶液中(0.2 g TTC加0.01 mol/LPBS 20 mL)，室温闭光保存30 min，取出，数码相机拍照。将照片输入Leica Qwin图像分析系统计算梗死体积。

免疫组织化学染色：组织石蜡切片经常规脱蜡水化后，采用免疫组织化学染色法分别进行染色。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞。每张免疫组化染色的切片随机选取含梗死灶中心区域的5个不重复高倍视野(放大400倍)，分别计算阳性细胞数。

主要观察指标：BrdU阳性细胞免疫组化染色结果和梗死体积。

统计学分析：全部资料采用SPSS 10.0统计软件包进行统计分析，各组数据均以x(_)±s记录。比较相同时间点各组间Brdu阳性细胞数，两组间比较采用q检验。以P < 0.01为差异有显著性意义。

讨论

许多研究表明骨髓间充质干细胞经过脑室、静脉、动脉等途径移植后均能向缺血损伤中心区域定向迁移、聚集，并分化为神经细胞。骨髓间充质干细胞还能分泌分泌各种炎性因子如白细胞介素1、碱性成纤维生长因子、神经营养因子、血管内皮生长因子等表达从而使受损组织得以新生，神经功能得到改善[18-19]。骨髓间充质干细胞定向迁移的机制主要损伤的组织环境及分泌因素等有关[20-21]。因脑梗死恢复期瘢痕组织的形成也有可能会影响移植物的生长等问题，目前多倾向于急性期移植[22]。但脑缺血急性期，兴奋性氨基酸的毒性作用，Ca2+超载及炎症反应会威胁到进入缺血区新生细胞的存活[23]。研究证实亚低温有确切的脑保护作用，它不但能降低脑部代谢，还能抑制氧自由基、钙超载形成，减轻缺血再灌注后炎症反应，上调抑凋亡基因及下调促凋亡基因来发挥其抗缺血半暗带的损伤神经细胞凋亡作用，并能促进神经营养因子释放[24]。因此亚低温可能通过改变脑缺血损伤后的微环境影响骨髓间充质干细胞的定向迁移。
因经动静脉途径移植需通过肺循环，移植物会有部分损失，本实验用BrdU标记来“跟踪”体外分离、纯化培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，利用立体定向装置，将标记的骨髓间充质干细胞经颅内直接移植到模型大鼠健侧侧脑室，通过观察迁移到梗死灶周的细胞数目及脑梗死体积的变化，来探讨亚低温在骨髓间充质干细胞移植治疗中的意义。实验结果发现在移植14 d左右，亚低温组及常温对照组免疫组化结果可以看到经脑脊液循环迁移到皮质、皮质下脑损伤区呈散在分布的BrdU(+)细胞。在移植21 d后，BrdU染色阳性细胞均可见在脑组织内存活，并且聚集于缺血梗死区域，梗死皮质下可见带状排列的染色阳性细胞。表明移植的骨髓间充质干细胞部分存活，并向病灶周围发生了迁移，与部分学者所报道的结果一致。结果还提示，亚低温组各时间点缺血侧梗死灶周边皮质的BrdU阳性细胞数均明显多于对照组(P < 0.01)。表明采用亚低温改变骨髓间充质干细胞移植宿主的环境，会增加骨髓间充质干细胞迁移的数量。同时实验结果显示与对照组相比，亚低温组在移植后5，14，21 d各时间点脑梗死体积比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。这表明在移植前及移植过程中脑缺血组织进行行亚低温处理后可明显减少脑梗死体积。亚低温对骨髓间充质干细胞移植增加细胞迁移数量并明显减少梗死体积的机制还不清楚，可能主要与以下因素有关：①亚低温可明显减少脑缺血急性期乳酸代谢产物堆积、钙超载、减少兴奋性氨基酸、自由基等内源性毒性产物的产生等，改善了干细胞移植的内环境，有利于移植物的存活和生长。②亚低温可增加细胞因子如脑源性神经营养因子、神经生长因子、血管内皮生长移植等的浓度，有利于血管新生，改善缺血半暗带区血液循环，有利于骨髓间充质干细胞存活、增殖和迁移。③亚低温可降低代谢，减少细胞调亡，但其具体的作用机制，还需做更具体、深入的研究。

亚低温下脑缺血大鼠骨髓间充质干细胞迁移和梗死体积的变化

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