5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的转化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2012.49.003

中国组织工程研究 ›› 2012, Vol. 16 ›› Issue (49): 9134-9138.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2012.49.003

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5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的转化

周亚峰，李红霞，程铖，韩莲花，杨向军

苏州大学附属第一医院心内科，江苏省苏州市215006

收稿日期:2012-02-07 修回日期:2012-04-24 出版日期:2012-12-02 发布日期:2012-04-24
作者简介:周亚峰☆，男，1973年生，江苏省泰兴市人，2009年苏州大学毕业，博士，副教授，副主任医师，硕士生导师，主要从事冠心病介入治疗及心脏起搏，心动过速射频消融治疗。zhouyafeng@medmail.com.cn
基金资助:
国家自然科学基金项目(81170174)；国家自然科学基金项目(81070139)；江苏省自然科学基金项目(BK2011304)；江苏省“科教兴卫”医学重点人才项目(RC2011111)。

Mesenchymal stem cells transformed to myogenic cell induced by 5-azacytidine in vitro

Zhou Ya-feng, Li Hong-xia, Cheng Cheng, Han Lian-hua, Yang Xiang-jun

Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China

Received:2012-02-07 Revised:2012-04-24 Online:2012-12-02 Published:2012-04-24
About author:Zhou Ya-feng☆, Doctor, Associate professor, Associate chief physician, Master’s supervisor, Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China zhouyafeng@ medmail.com.cn
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81170174*, 81070139*; the Natural Science Foundation of Jiangsu Province, No. BK2011304*; Jiangsu “Science and Education Promoting Health Engineering” Key Provincial Talents Program, No. RC2011111*

摘要/Abstract

摘要：

背景：利用骨髓间充质干细胞多向分化潜能及其可在体外表达多种外源目的基因的特性，将其作为种子细胞用于未来组织器官的修复和替代已成为当前研究的热点。目前，已从人和几种动物骨髓中分离出间充质干细胞，但对猪骨髓间充质干细胞的研究报道很少。

目的：建立猪骨髓间充质干细胞体外培养及其转化为心肌样细胞的方法，并探讨其生物学特性。 方法：猪的骨髓间充质干细胞分离纯化后，加入5-氮胞苷诱导分化，用抗desmin、MHC、cTnI、Cx-43进行免疫细胞化学染色鉴定。

结果与结论：体外培养的猪骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷诱导后，部分间充质干细胞呈梭形，阳性表达desmin、MHC、cTnI和Cx-43。结果提示猪骨髓间充质干细胞在体外条件下经5-氮胞苷诱导后可分化为心肌样细胞。

关键词: 心肌样细胞, 骨髓间充质干细胞, 5-氮胞苷, 诱导分化, 免疫细胞化学染色, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: With the characteristics of multiple differentiation potential and the in vitro expression of a variety of exogenous genes, bone marrow mesenchymal stem cells are used as the seed cells for the future repairing and replacing of tissues and organs and the research has become the hot spot. To date, bone marrow mesenchymal stem cells have been isolated from human and several kinds of animals, but reports on porcine bone marrow mesenchymal stem cells are rare.
OBJECTIVE: To establish a method for culturing porcine bone marrow mesenchymal stem cells and then transformation into myogenic cells in vitro, and to investigate the underlying biological mechanisms.
METHODS: Porcine bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and purified by centrifugation. After induced with 5-azacytidine, the immunohistochemical staining was performed with desmin, MHC, cTnI and Cx-43.
RESULTS AND CONCLUSION: After induced with 5-azacytidine, some porcine bone marrow mesenchymal stem cells became spindle-like and were positive for desmin, MHC, cTnI and Cx-43 expression. Porcine bone marrow mesenchymal stem cells can be transformed into myogenic cells after in vitro induced with 5-azacytidine.

中图分类号:

R394.2

周亚峰，李红霞，程铖，韩莲花，杨向军. 5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的转化[J]. 中国组织工程研究, 2012, 16(49): 9134-9138.

Zhou Ya-feng, Li Hong-xia, Cheng Cheng, Han Lian-hua, Yang Xiang-jun. Mesenchymal stem cells transformed to myogenic cell induced by 5-azacytidine in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2012, 16(49): 9134-9138.

图/表（结果） 2

2.1 骨髓间充质干细胞增殖与分化刚接种的骨髓间充质干细胞悬液中细胞呈圆形，大小不一，不能辨认细胞核；骨髓单个核细胞悬液接种于培养瓶4 h后，可见一些细胞开始黏附与贴壁，由圆球型逐渐变成扁平圆型。24 h后部分细胞开始贴壁，呈椭圆形；更换培养液后，可见散在分布的贴壁细胞，大部分细胞呈梭形，少部分呈多角形。原代培养48 h后，多数已经贴壁，开始铺展开。之后细胞数明显增加，体积增大，排列开始出现方向性，呈旋涡样生长。10 d左右骨髓间充质干细胞扩增至10⁷数量级。12 d左右达到细胞融合，细胞形态比较均一。传代培养后，细胞不再以集落方式生长，而呈分布均匀的纺锤形。

2.2 骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化 5-氮胞苷诱导后，骨髓间充质干细胞增生趋于停滞，部分细胞死亡并从瓶底脱落，而存活细胞的形态渐渐趋于均一，见图1a；10 d后可见细胞形态较前更加细长，呈长梭形；排列具有方向性，多为纵形、放射状或漩涡状排列，且胞浆内细胞器丰富，见图1b。姬姆氏染色可见细胞核呈蓝或蓝紫色，胞浆中含有较多线粒体等细胞器，见图1c。

Figure 1 Morphology of mesenchymal stem cells after inducedwith 5-azacytidine
图1 5-氮胞苷诱导后的骨髓间充质干细胞形态

2.3 心肌样细胞的鉴定通过免疫细胞化学染色显示，经5-氮胞苷诱导后，部分细胞阳性表达Desmin、MHC、cTn I、Cx-43，阳性细胞的胞浆中有棕黄色颗粒，细胞核呈蓝色(蓝色箭头所指)。见图2。根据cTn I染色结果计算，经5-氮胞苷诱导后，(27.2±7.1)%的间充质干细胞阳性表达cTn I。

Figure 2 Immunocytochemical staining of myogenic cells generated from bone marrow mesenchymal stem cells after induced with 5-azacytidine

图2 5-氮胞苷诱导后，骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的免疫细胞化学染色

参考文献

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引言

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：实验于2011年1月至2012年1月在苏州大学附属第一医院心内科实验室完成。

材料：

实验动物：健康梅山猪2头，体质量21-25 kg，均为雄性，由苏州大学动物中心提供。

方法：

猪骨髓间充质干细胞的分离和培养：无菌条件下从猪髂骨抽取骨髓30 mL，加肝素6 000 U抗凝，加入到密度为1.077 g/L的Ficoll-Paque分离液中，1 500 r/min离心 30 min，收集单个核细胞层后，以PBS洗涤2次。用DMEM培养液重新悬浮细胞并计数，按1×10⁵ L^-¹的细胞浓度接种于T75塑料培养瓶中，在37 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度的孵育箱中培养，48 h后更换培养液，弃去未贴壁的细胞，以后每隔3 d或4 d换液1次，倒置显微镜下观察细胞生长情况，接近融合时用0.25%的胰酶室温下消化5-10 min，按1∶3比例传代培养，当这些传1代细胞完全融合时，由此得到骨髓间充质干细胞。

猪骨髓间充质干细胞的诱导分化：传2代的猪骨髓间充质干细胞培养第3天，加入5-氮胞苷至终浓度为10 μmol/L，孵育24 h后，更换EBM-2培养液继续培养。以后每3 d换液1次，倒置相差显微镜下观察细胞形态变化及生长情况。两三周后，Giemsa染色观察细胞的一般形态，流式细胞仪检测细胞周期，并行免疫细胞化学染色鉴定。

Giemsa染色：贴壁生长于玻片的细胞用甲醇固定 10 min后，入Giemsa液染色15 min，蒸馏水清洗，空气干燥，二甲苯透明，树胶封固，光镜下观察。

免疫细胞化学染色鉴定：骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷诱导后，置于6孔培养板中培养，贴壁生长于玻片的细胞用40 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS(0.01 mol/L，pH 7.2)漂洗3次。室温下干燥后，分别加入小鼠抗猪desmin单抗(1∶50稀释)、小鼠抗大鼠MHC(G-4)单抗(1∶50稀释)、小鼠抗人cTn I单抗(1∶40稀释)、兔抗人Cx-43单抗 (1∶50稀释)，4 ℃孵育过夜，PBS冲洗3次后，分别加入两步法羊抗小鼠IgG+HRP和羊抗兔IgG+HRP，37 ℃孵育30 min。冲洗后加入DAB显色2- 5 min，蒸馏水终止反应，苏木精复染，中性树胶封固。胞浆中有棕黄色颗粒的细胞为阳性细胞。各抗体阴性对照采用PBS代替一抗，其余部分操作同上。根据cTn I免疫染色情况，随机选择5个高倍(×200)视野，分别计数每个视野内的细胞总数(N)和阳性细胞数(N₁)，取平均值，以阳性细胞的百分数表示骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的转化率(心肌样细胞的转化率=N₁/N×100%)。

主要观察指标：①骨髓间充质干细胞增殖与分化的形态特征。②抗desmin、MHC、cTnI、Cx-43免疫细胞化学染色鉴定。③骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的转化率。

讨论

骨髓来源间充质干细胞是一种存在于骨髓的多向分化潜能的干细胞，间充质干细胞具有典型的多向分化潜能，在特定的微环境下，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌小管、肌腱、肝细胞、神经细胞、胶质细胞和心肌细胞等[6-7]。

本实验的骨髓间充质干细胞培养体系参照Lindolfo等[4]的方法略加改进，通过密度梯度离心得到骨髓单个核细胞，根据间充质干细胞的黏附特性，通过反复换液去除包括血细胞在内的不贴壁细胞，留在培养板上的成纤维样细胞呈集落状生长，与文献报道的人和大鼠的分离方法相似[5-6]。这些细胞有自我更新和快速复制能力，体外扩增4周后，可从30 mL骨髓中获得107数量级的纯度较高的间充质干细胞。

体外培养的骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷诱导后细胞形态较前更加细长，排列具有方向性，且胞浆中含有较多线粒体等细胞器；免疫细胞化学染色显示，部分细胞阳性表达Desmin、MHC、cTn I、Cx-43。

Desmin是新生/成熟平滑肌、心肌、骨骼肌细胞中肌丝的主要构成成分之一，在维持肌纤维形态、细胞核与细胞膜的连接、以及在肌小节间的信号传递等方面起到了重要作用，成纤维细胞中没有desmin表达[8-12]。

肌球蛋白，又称肌凝蛋白，是一种高度保守的蛋白，由轻、重两链形成，是构成粗肌丝的主要成分，其构成的横桥(cross-bridge)具有ATP酶的作用，与细肌丝上的肌动蛋白(actin，又称肌纤蛋白)可逆结合后引起肌丝滑行，所以肌球蛋白和肌动蛋白合称为收缩蛋白。Desmin和MHC染色阳性表明骨髓间充质干细胞已向肌细胞转化[13-16]。

细肌丝中除了肌动蛋白外，另外有两种蛋白可影响和调控收缩蛋白间的相互作用，故称为调节蛋白。一种为原肌凝蛋白，另一种为肌钙蛋白，后者含有C、T、I三个亚单位，分别对Ca2+、原肌凝蛋白、肌动蛋白具有高亲和力[17-18]。亚单位I的作用是在亚单位C与Ca2+结合时，把信息传递给原肌凝蛋白，引起后者的分子构象发生改变，解除它对肌动蛋白和横桥相互连接的障碍；肌钙蛋白存在于骨骼肌、心肌细胞中，平滑肌细胞中不含肌钙蛋白。但骨骼肌细胞为多核，核位于细胞边缘，而心肌细胞为单核，位于细胞中央。因此，根据细胞的形态结构(Giemsa染色可见梭形细胞中的单个核，位于细胞中央，呈蓝紫色的椭圆形)、cTn I阳性染色综合判断，经5-氮胞苷诱导后，骨髓间充质干细胞已向心肌细胞转化[19-21]。

5-氮胞苷是一种胞苷类药物，能与控制向心肌分化的特异基因MyoD(myogenic determination gene)上阻遏蛋白结合，引起DNA中某些胞嘧啶去甲基化，发生构型改变，调控肌动蛋白(actin)基因，启动干细胞向心肌分化[9]。有研究表明，鼠的胚胎细胞与5-氮胞苷作用后能向中胚层细胞转化[2]，其机制可能与激活肌源性基因MyoD1(myf3)有关。

值得一提的是，心肌细胞之间通过特定的缝隙连接偶联在一起，在电反应中形成整体。这些缝隙连接是Cx-43的六聚物，也是心肌细胞的特征之一。Cx-43免疫细胞化学染色阳性表明，诱导的间充质干细胞之间已经具有了连接物质，这对细胞间的信号传导和心功能的维持非常重要[22-24]。

但是，实验对骨髓间充质干细胞的诱导分化是在体外进行的，缺乏体内细胞发育所需的微环境，故得到的细胞形态比较幼稚；也不能确定这种细胞是否有心室肌细胞特有的动作电位[10,25-28]。因此，只能把这种诱导的细胞暂称为心肌样细胞。

另外，经5-氮胞苷诱导后，仅有(27.2±7.1)%的骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞，结果尚不能令人满意。其原因主要是分离的骨髓间充质干细胞存在一定程度的异质性；也可能还存在其他机制，如有的学者提出通常分离出的间充质干细胞包含更原始的MAPC (multipotent adult progenitor cell)，在通常培养条件下其多向分化能力迅速丧失。因此，如何在分离过程中进一步纯化间充质干细胞，以及在体外扩增时保持其分化潜能，还有待于进一步研究。

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