肿瘤坏死因子α可激活NF-κB信号通路抑制牙周膜干细胞成骨分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1793

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
干细胞骨向分化：指具有多向分化潜能的成体干细胞经复杂的生物过程分化为成骨细胞，它是骨形成的主要功能细胞，在骨骼生长、骨量维持过程中起着重要作用，同时对受损骨细胞或者组织具有一定的修复能力。成骨分化这一重要潜能，使得干细胞在组织工程研究与骨组织损伤修复中占据重要地位。
NF-κB信号通路：是间充质干细胞向成骨分化的重要通路，它通过调节成骨分化信号通路及骨基质形成，实现对骨发育和骨改建的调控作用。NF-κB作为核转录因子，通过多个靶基因表达进行调控，参与机体免疫应答、炎症反应等生理过程，并在细胞增殖、转化和凋亡等方面发挥作用。NF-κB作为一个关键的炎症因子在慢性牙周炎的研究中受到广泛关注。

摘要
背景：既往研究大多侧重于炎症因子激活NF-κB信号通路对骨细胞的影响，关于微炎症环境对人牙周膜干细胞成骨分化及NF-κB信号通路的影响研究较少。
目的：探讨肿瘤坏死因子α对人牙周膜干细胞骨向分化及NF-κB信号通路的影响。
方法：通过酶消化结合组织块法体外培养人牙周膜干细胞，免疫组织化学染色鉴定人牙周膜干细胞来源。该研究获得青海大学附属医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。将人牙周膜干细胞分为2组，对照组用单纯成骨诱导液培养，肿瘤坏死因子α组用单纯成骨诱导液+10 μg/L肿瘤坏死因子α培养。在成骨诱导不同时间点，进行茜素红染色定量分析、碱性磷酸酶活性检测，实时定量RT-PCR检测Osterix、Runx2基因表达水平，Western Blot检测NF-κB信号通路关键蛋白表达水平。
结果与结论：①免疫组织化学染色结果显示人牙周膜干细胞抗波形丝蛋白染色表达阳性，抗角蛋白表达阴性；②茜素红染色后肿瘤坏死因子α组形成的矿化结节比对照组数量少、范围小、染色浅；③肿瘤坏死因子α组碱性磷酸酶活性明显低于对照组(P < 0.05)；④肿瘤坏死因子α组Osterix、Runx2基因表达水平均显著低于对照组(P < 0.05)；⑤肿瘤坏死因子α组p-IκBα蛋白表达量显著高于对照组(P < 0.05)，p65、IκBα蛋白表达量显著低于对照组(P < 0.05)；⑥结果表明，肿瘤坏死因子α能够通过激活NF-κB信号通路抑制人牙周膜干细胞成骨分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-1291-3491(张赟)

关键词: 人牙周膜干细胞, 肿瘤坏死因子α, 成骨分化, NF-κB信号通路, 碱性磷酸酶活性, 成骨基因

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have focused on the effects of inflammatory factors-activated nuclear factor-kappa B signaling pathway on bone cells. Little has been reported on the effects of micro-inflammatory environment on osteogenic differentiation and nuclear factor-kappa B signaling pathways of human periodontal ligament stem cells.
OBJECTIVE: To investigate the effect of tumor necrosis factor-alpha on osteogenic differentiation and nuclear factor-kappa B signaling pathway of periodontal ligament stem cells.
METHODS: Human periodontal ligament stem cells were cultured in vitro by enzymatic digestion combined with tissue explant method, and the cell source was identified by immunohistochemical staining. The study protocol was approved by the Ethics Committee of the Affiliated Hospital of Qinghai University, and informed consent was obtained from each patient prior to the enrollment in the study. The cells were cultured in simple osteogenic induction medium (control group) or osteogenic induction medium containing 10 μg/L tumor necrosis factor-alpha (tumor necrosis factor-alpha group). Alizarin red staining and alkaline phosphatase activity were used to detect the effect of tumor necrosis factor-alpha on osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells. Real-time quantitative RT-PCR was used to detect the effect of tumor necrosis factor-alpha on the expression of osteogenic differentiation genes, Osterix and Runx2. Western blot was used to detect the effect of tumor necrosis factor-alpha on nuclear factor-kappa B signaling pathway.
RESULTS AND CONCLUSION: Immunohistochemical staining showed that human periodontal ligament stem cells were positive for anti-vimentin and negative for anti-keratin. After alizarin red staining, mineralized nodules formed in the tumor necrosis factor-alpha group were fewer in number, smaller in scope and lighter in staining than those in the control group. Alkaline phosphatase activity in the tumor necrosis factor-alpha group was significantly lower than that in the control group (P < 0.05). Real-time quantitative RT-PCR results showed that the expression levels of Osterix and Runx2 mRNA in tumor necrosis factor-alpha group were significantly lower than those in the control group (P < 0.05). Western blot assay showed that, compared with the control group, the expression of p-IκBα protein increased significantly in the tumor necrosis factor-alpha group (P < 0.05), while the expression of p65 and IκBα proteins decreased (P < 0.05). These findings indicate that tumor necrosis factor-alpha can inhibit the osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells by activating the nuclear factor-kappa B signaling pathway.

Key words: human periodontal ligament stem cells, tumor necrosis factor-alpha, osteogenic differentiation, nuclear factor-kappa B signaling pathway, alkaline phosphatase activity, osteogenic gene

中图分类号:

张赟，常群安，李生梅，张源. 肿瘤坏死因子α可激活NF-κB信号通路抑制牙周膜干细胞成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(25): 3993-3997.

Zhang Yun, Chang Qun’an, Li Shengmei, Zhang Yuan.

Tumor necrosis factor-alpha inhibits osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells through activating nuclear factor-kappa B signaling pathway

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图/表（结果） 2

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2018年2至11月在青海大学附属医院完成。

1.3 材料

1.3.1 临床样本 2016年6月至2018年5月在青海大学附属医院口腔科因正畸治疗而拔除的前磨牙34颗，患者年龄15-25岁。患者均无全身系统疾病、慢性感染疾病、家族遗传病及吸烟史，且无牙根尖及牙体疾病。该研究获得青海大学附属医院伦理委员会批准，所有患者均知情同意并签署同意书。

1.3.2 实验试剂与仪器

(1)主要试剂：PBS、胎牛血清、α-MEM培养液(体积分数15%胎牛血清、50 mg/L抗坏血酸、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素/链霉素)(美国HyClone公司)；成骨诱导液(含体积分数5%胎牛血清、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、100 nmol/L地塞米松、50 mg/L维生素C的α-MEM培养液)(美国Gibco公司)；谷氨酰胺、二甲基亚砜、茜素红(美国Sigma公司)；免疫组化染色检测试剂盒、角蛋白抗体、波形蛋白抗体、碱性磷酸酶活性检测试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)；β-actin抗体、抗人核心结合蛋白因子2 (Runx2)抗体、抗人成骨细胞特异性转录因子Osterix抗体、鼠抗人二抗(美国Abcam公司)；p65抗体、IκBα抗体、p-IκBα抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG(美国Santa Cruz公司)；细胞总RNA提取试剂盒(上海信裕生物科技有限公司)；RT-PCR试剂盒(上海恒斐生物科技有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒、显影液、定影液、Western Blot相关试剂(美国 Sigma公司)。

(2)主要仪器：恒温CO₂细胞培养箱(宁波江南仪器厂)；倒置相差显微镜(上海缔伦光学仪器有限公司)；高速台式离心机(湖南凯达科学仪器有限公司)；电热恒温水槽(上海书俊仪器设备有限公司)；酶联免疫检测仪(北京诺亚威仪器仪表有限公司)；紫外/可见光分光光度仪(上海光学仪器五厂有限公司)；实时定量RT-PCR仪(赛默飞世尔科技)；细胞培养瓶、各型号细胞培养板、移液枪、一次性滤器移液器枪头(美国Costar公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 人牙周膜干细胞的分离培养 将正畸牙患者的前磨牙拔除后，立即放入含双抗的α-MEM培养液中，4 ℃保存，迅速送至实验室，用含双抗的PBS冲洗3遍，用锐利的刀片刮取牙根中1/3牙周膜，将其修剪为1 mm³大小的组织块，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入3 g/L的Ⅰ型胶原酶于37 ℃消化15 min，加入等体积α-MEM培养液终止消化，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入适量α-MEM培养液，接种到培养皿中，置于培养箱(37 ℃，体积分数5%CO₂)孵育3-7 d，当细胞从组织块边缘爬出且细胞生长量为80%-90%时，加入0.25%胰蛋白酶消化传代。当第1代细胞生长量达80%时，采用有限稀释法克隆分离培养，取3-5代人牙周膜干细胞用于实验。

1.4.2 免疫组织化学染色鉴定人牙周膜干细胞 将第3代人牙周膜干细胞制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁷ L^-1，将其接种至6孔板内的无菌盖玻片上，2 mL/孔；待细胞融合80%-90%后，PBS冲洗3次；40 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS冲洗3次；体积分数为3%H₂O₂ 37 ℃孵育15 min，PBS冲洗3次；封闭液37 ℃水浴封闭25 min；滴加一抗(波形蛋白抗体、角蛋白抗体)37 ℃孵育1 h，PBS冲洗3次；滴加山羊抗小鼠二抗37 ℃孵育1 h，PBS冲洗3次；DAB显色五六分钟，苏木精复染2 min后脱水封固，在显微镜下观察。

1.4.3 实验分组 实验分为2组：①对照组：单纯成骨诱导液培养；②肿瘤坏死因子α组：单纯成骨诱导液+10 μg/L肿瘤坏死因子α^[13]。取第3代对数生长期人牙周膜干细胞，调整细胞浓度为5×10⁷ L^-1，接种于12孔板，当细胞汇合达到75%-80%时加入不同刺激条件的成骨诱导液，诱导液每2 d更换1次。在不同时间点弃掉原培养液，用新鲜培养液37 ℃孵育1 h，收获细胞，进行茜素红染色定量分析、碱性磷酸酶活性检测、实时定量RT-PCR检测Runx2和Osterix的表达，Western Blot检测NF-κB信号通路关键蛋白表达水平。

1.4.4 茜红素染色定量 成骨诱导21 d进行茜素红染色。实验步骤如下：取出玻片，PBS冲洗3次；40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗3次；加入1%茜素红染色20 min，PBS冲洗3次；显微镜下观察拍照；拍照后，吸弃PBS，加入1 mL十六烷基吡啶，37 ℃孵育15 min，酶联免疫检测仪在波长540 nm处检测吸光度值。

1.4.5 碱性磷酸酶活性检测 成骨诱导3，5，7 d后，弃上清液，PBS冲洗3次；每孔加入100 μL 0.2%Triton X-100 37 ℃孵育1 h，显微镜下观察到细胞破碎；收集裂解物，1 500 r/min离心5 min，加入碱性磷酸酶底物，室温放置45 min，加入显色液，用酶联免疫检测仪在波长520 nm处检测吸光度值。

1.4.6 实时定量RT-PCR检测Runx2和Osterix的mRNA表达 成骨诱导7 d后收集各组细胞，按照TRIzol Reagent说明书操作步骤采用酚-氯仿提取法提取细胞总RNA，然后按照RT-PCR试剂盒说明书操作步骤反转录得到cDNA，然后进行实时定量PCR，检测Osterix、Runx2基因的表达，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，见表1。

1.4.7 Western Blot检测p-IκBα、IκBα、p65的蛋白表达 成骨诱导7 d收集各组细胞，加入细胞裂解液裂解细胞，离心，取上清液采用BCA法测定蛋白浓度，加入上样缓冲液煮沸后放于冰箱保存。按试剂盒说明书进行灌胶、电泳、转膜；取出PVDF膜，置于5%脱脂奶粉中37 ℃封闭1 h，PBS摇洗3次，加入一抗(p65 抗体、IκBα抗体、p-IκBα抗体)4 ℃摇床过夜，次日室温孵育1 h，PBS摇洗3次，加入二抗(辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG)室温孵育2 h，PBS摇洗3次，避光配制ECL发光剂，均匀滴在PVDF膜上，化学发光凝胶成像系统进行曝光成像。

1.5 主要观察指标 ①牙周膜干细胞的形态及免疫组化鉴定结果；②成骨诱导21 d后茜素红染色定量结果；③成骨诱导3，5，7 d后碱性磷酸酶活性变化；④成骨诱导7 d后NF-κB信号通路及成骨分化相关标记物的表达。

1.6 统计学分析 采用SPSS 21.0软件进行t 检验统计分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

牙周炎通常是由细菌感染牙周组织引起的慢性疾病，其发病率在成人中超过80%^[14-17]。人体口腔中生存着多达百种的细菌，这些细菌释放大量细菌毒素，使得牙周炎进一步发展，而细菌入侵牙周组织触发的炎症免疫应答加重了对牙周组织的破坏，进而致使牙齿松动脱落^[18-23]。

肿瘤坏死因子α在机体免疫防护过程中发挥重要的生物学作用，与牙周炎的发生发展密切相关^[24-30]。有文献报道，牙周炎患者龈沟液、牙龈组织中肿瘤坏死因子α含量高于正常水平。肿瘤坏死因子α与牙周炎的发病机制密切相关，可激活成骨细胞中的多条信号通路，如NF-κB、p38MAPK、JNK、Smurfl等信号通路，并抑制Runx2的表达^[31-35]。NF-κB是一种核转录因子，不仅参与细胞增殖与凋亡等生理过程，还参与了炎症、免疫反应相关的基因转录过程。NF-κB信号通路分为经典通路与非经典通路，经典通路由肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素1β等炎症因子活化^[36-38]，非经典通路则主要是由BAFF、CD40L、LT-βR等肿瘤坏死因子受体家族亚类活化^[39]。

为研究微炎症环境对人牙周膜干细胞生物学特性及机制的影响，实验用肿瘤坏死因子α刺激人牙周膜干细胞，检测茜素红定量表达、碱性磷酸酶活性、成骨相关基因表达水平显著降低。在成骨分化过程中，碱性磷酸酶活性与细胞骨向分化程度关系密切，碱性磷酸酶活性降低说明人牙周膜干细胞成骨分化程度降低，分泌矿化基质的能力降低。Osterix、Runx2的表达高低标志着成骨分化能力的高低，Osterix、Runx2基因表达水平降低，表明肿瘤坏死因子α对人牙周膜干细胞成骨分化有抑制作用。张静等^[40]研究发现，肿瘤坏死因子α作用牙周膜干细胞后，细胞碱性磷酸酶活性降低，成骨基因表达降低，与此研究结果相似，证实肿瘤坏死因子α对人牙周膜干细胞成骨分化有抑制作用。

人牙周膜干细胞经肿瘤坏死因子α刺激后，p-IκBα蛋白表达量明显升高，p65、IκBα蛋白表达量降低，说明肿瘤坏死因子α使得人牙周膜干细胞中IκBα过度磷酸化，增强了NF-κB活性，表明NF-κB信号通路很可能参与了肿瘤坏死因子α抑制人牙周膜干细胞成骨分化的过程。金小福等^[41]研究有类似结果，肿瘤坏死因子α能活化NF-κB信号通路。

综上所述，肿瘤坏死因子α能够抑制人牙周膜干细胞成骨分化，激活NF-κB信号通路，抑制Osterix、Runx2基因表达，说明微炎环境下人牙周膜干细胞功能受损与NF-κB信号通路活化有关，这为临床治疗牙周炎提供了新方向。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程