人骨关节炎软骨细胞的体外分离与培养

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1791

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
骨关节炎：是骨科常见的由多因素导致的慢性关节疾病，其病变特点是关节软骨的退行性变和关节周围继发性骨质增生，多累及负重大、活动多的关节，如膝关节、髋关节、脊柱等部位。好发于50岁以上人群，女性略多于男性，流行病学调查显示：60岁以上人群中约70%、80岁以上人群中约有90%有骨关节炎的放射学表现，其中10%-30%有临床症状。
软骨细胞：是成熟软骨组织内唯一的细胞类型。它在软骨损伤以及重塑过程中起到维持内环境平衡的作用。胶原是细胞外基质的重要组成部分，其中90%-95%成分为Ⅱ型胶原。Ⅱ型胶原质和量的改变是软骨细胞丧失其正常生物特性的直接原因，其变化与骨关节炎有着密切关系。

摘要
背景：大量针对骨关节炎细胞水平的研究仍集中在动物模型关节软骨细胞的体外培养。动物模型引发的退变效应与人骨关节炎的发生并不完全一致。如何利用人骨关节炎软骨组织构建体外细胞模型并研究其特征性蛋白变化趋势，是模拟体内骨关节炎软骨退变过程的关键。
目的：探讨人骨关节炎软骨细胞的体外分离、培养方法，观察原代至第3代人骨关节软骨细胞的形态学特性和相关蛋白表达变化。
方法：取6例因重度骨关节炎行关节置换术患者的废弃软骨组织(获得中国人民解放军总医院医学伦理委员会批准，伦理批号为S2017-23-7)，男2例，女4例；年龄62-72岁，平均(68.3±3.39)岁，采用一步酶消化法(Ⅱ型胶原酶)分离培养人骨关节炎软骨细胞，并进行传代培养，从而构建体外人骨关节炎软骨细胞培养体系。倒置相差显微镜观察各代细胞形态；苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫荧光染色方法进行细胞鉴定。采用Western blot法检测各代软骨细胞于70%融合率时Col2a、Aggrecan与MMP-13的表达。
结果与结论：经过Ⅱ型胶原酶消化后，培养1周左右可见组织块周围爬出散在的细胞，3周左右可传代进行下一步研究；形态学、苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色与Ⅱ型胶原免疫荧光染色证明培养出的细胞为人软骨细胞。第3代软骨细胞Col2a、Aggrecan的相对表达量与原代比较有明显降低(P < 0.01)，且随着培养代数增加表达逐渐降低；MMP-13随着培养代数的增加表达逐渐增强(P < 0.01)。结果表明，Ⅱ型胶原酶一步消化法可成功从标本中分离出骨关节炎软骨细胞并传代培养。体外培养的骨关节炎软骨细胞去分化特性随着传代次数增加而逐渐增强，功能性蛋白表达整体下降。3代以内的软骨细胞符合人骨关节炎时软骨退变的表现，可能是用于实验研究的最佳选择。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-5894-8206(魏钰)

关键词: 骨关节炎, 关节置换, 人软骨细胞, 一步酶消化法, Ⅱ型胶原酶, Ⅱ型胶原, 聚集蛋白聚糖, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Numerous studies addressing cells in osteoarthritis still focus on the in vitro culture of articular chondrocytes in animal models. Degeneration in the animal models is not completely consistent with that in human osteoarthritis. How to construct an in vitro cell model using chondrocytes from human osteoarthritis and to study changing trend of its characteristic proteins is the key to simulating the cartilage degeneration in human osteoarthritis in vivo.
OBJECTIVE: To investigate the in vitro isolation and culture of human chondrocytes from osteoarthritis patients, to observe the morphological characteristics of human osteoarthritis chondrocytes from primary to third generation, and to study the changes in biological characteristics of chondrocyte-related proteins in different generation.
METHODS: The study protocol was in line with the ethic requirements of Chinese PLA General Hospital with the approval No. S2017-23-7. Six cases undergoing arthroplasty for severe osteoarthritis (2 males and 4 females, age 62-72 years old with a mean age of (68.3±3.39) years) were enrolled. The chondrocytes from abandoned cartilage tissue in these patients were isolated and cultured by one-step enzymatic digestion (type II collagenase), and then subcultured, so as to construct an in vitro chondrocyte culture system for osteoarthritis. The morphology of cells at different generations was observed by inverted phase contrast microscope. Hematoxylin-eosin staining, toluidine blue staining and type II collagen immunofluorescence staining were used for cell identification. Western blot was used to detect the expressions of Col2a, Aggrecan and matrix metalloproteinase-13 in each generation of chondrocytes at the fusion rate of 70%.
RESULTS AND CONCLUSION: After digestion using type II collagenase, the cells scattered around the tissue mass could be observed at about 1 week of culture, and these cells could be subcultured for further study after about 3 weeks. Morphological observation, hematoxylin-eosin staining, toluidine blue staining and type II collagen immunofluorescence staining proved that human chondrocytes were successfully cultured. The relative expression of Col2a and Aggrecan in chondrocytes at the third generation was significantly decreased as compared with that in primary cells (P < 0.01), and the expression gradually decreased with the subculture times. Matrix metalloproteinase-13 expression gradually increased with the increase of subculture times (P < 0.01). In conclusion, chondrocytes can be successfully isolated from the osteoarthritis specimens by one-step digestion of type II collagenase and then subcultured. The dedifferentiation of osteoarthritis chondrocytes in vitro increases with the increase of subculture times and the expression of functional proteins decreases as a whole. The chondrocytes within three generations present with cartilage degeneration in osteoarthritis and may be the best choice for experimental studies.

Key words: osteoarthritis, joint replacement, human chondrocytes, one-step enzymatic digestion, type II collagenase, type II collagen, aggrecan, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

魏钰，魏民. 人骨关节炎软骨细胞的体外分离与培养[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(25): 4056-4061.

Wei Yu, Wei Min. In vitro isolation and culture of chondrocytes from human osteoarthritis patients[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(25): 4056-4061.

图/表（结果） 2

2.1 软骨细胞形态 倒置相差显微镜观察，培养1周左右可见组织块周围爬出散在的细胞，多为短梭形、三角形，少数为多角形，瓶底可见散在分布的单个细胞；2周左右可见组织块周围多量的细胞成簇生长，为梭形或多角形，见图1A；3周左右瓶底细胞已经连接成片，融合率为70%左右，部分细胞伸出伪足，形态欠规则，似成纤维细胞样。经传代后细胞增殖速度明显加快，24 h内细胞全部贴壁，两端伸出伪足，1周左右可长满瓶底。随着传代次数的增多，细胞形态似逐渐去分化为成纤维细胞，两端伸出数量不等的伪足，细胞形态愈发不规则，且生长速度开始下降，3代后上述特征逐渐表达明显，见图1B-D。

2.2 软骨细胞的不同染色观察结果 苏木精-伊红染色可见第1代软骨细胞基本为三角形或多角形，细胞核呈蓝紫色，卵圆形或圆形，细胞质呈粉红色，随着传代次数的增加，至第3代软骨细胞时形态逐渐变为长梭形。甲苯胺蓝染色可见细胞核为深蓝色，胞浆着色稍浅呈浅蓝色，其内可见少量蓝紫色异染颗粒，传代至第3代时多为长梭形细胞，胞浆染色变浅，形态似成纤维细胞，见图2。

2.3 Ⅱ型胶原的免疫荧光染色观察结果 Ⅱ型胶原免疫荧光显示第1代细胞胞浆及胞膜出现清晰绿色荧光，细胞核区域在不同波段荧光激发下可见DAPI(蓝色)复染，表明培养的细胞表达特征性Ⅱ型胶原，并主要分布于胞浆和细胞膜上，这些都是软骨细胞的特征，见图3。

2.4 Western blot检测软骨细胞Col2a、MMP-13及Aggrecan的蛋白表达 分别对原代和第1-3代人关节炎软骨细胞进行Western blot检测，扫描测定灰度值，并进行分析，见图4。随着软骨细胞培养代数的增加，Col2a与Aggrecan的表达在原代最强(1.029±0.042，0.397±0.025)，之后逐渐下降，至第3代分别为0.463±0.020，0.154±0.147，差异有显著性意义(P < 0.05)，其中Cola2的表达各代差异均有显著性意义(P < 0.01)。MMP-13的蛋白表达量随着培养代数逐渐升高，原代和第1-3代分别为0.387±0.004，0.418±0.027，0.663±0.013，0.790±0.031，差异均有显著性意义(P < 0.01)，见表1。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2018年3至12月在中国人民解放军总医院骨科研究所北京市重点实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验试剂与仪器

(1)实验试剂：α-MEM培养基(美国Gibco公司，规格 500 mL，货号12571063)；PBS缓冲液(美国Corning公司，规格500 mL，货号21-040-CVR)；Ⅱ型胶原酶(美国Gibco公司，规格1 g，货号17101015)；HBSS缓冲液(美国Gibco公司，规格500 mL，货号17101015)；胎牛血清(美国Gibco公司，规格500 mL，货号10099141)；二甲基亚砜(美国Sigma公司，规格100 mL，货号D2650)；BCA蛋白定量试剂盒(中国联科生物公司，货号A81911125)；PVDF膜(美国Millipore公司，0.45 μm，货号R8HA7852)；蛋白酶抑制剂(美国Roche公司，货号04693116001)；脱脂奶粉(中国Easybio公司，货号BE6250)；GAPDH单克隆抗体(美国Abcam公司，规格100 μL，货号ab8245)；Col2a多克隆抗体(美国Abcam公司，规格100 μg，货号ab34712)；MMP-13多克隆抗体(美国Abcam公司，规格100 μg，货号ab39012)；Aggrecan单克隆抗体(美国Abcam公司，规格1 mL，货号ab3778)。

(2)实验设备：倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；5%CO₂孵育箱(美国Thermo Fisher公司)；VCX 130PB型超声波破碎仪(美国Sonics公司)；EPOCH TAKE 3微量孔板分光光度计(美国BioTek公司)；通用台式冷冻离心机(德国R&D公司)。

1.3.2 实验标本 在中国人民解放军总医院骨科进行全膝关节置换的重度骨关节炎患者的废弃软骨组织，所有患者均为内翻畸形，取材位置位于胫骨平台内侧。标本6例，其中男2例，女4例；年龄62-72岁，平均(68.3±3.39)岁。原发性骨关节炎的诊断标准参照美国风湿病学会膝骨关节炎诊断标准^[6]。该研究已获得解放军总医院医学伦理委员会批准(批准号：S2017-23-7)，并征得患者知情同意，均签署知情同意书。

1.4 实验方法

1.4.1 人骨关节炎软骨组织的取材 于全膝关节置换术中取下废弃的软骨组织标本，立刻低温无菌保存，30 min内转移至实验室超净工作台内。使用11号刀片(带柄)小心刮除关节周围附着的组织，PBS反复冲洗残留的血液和组织液，15号刀片(带柄)逐层削取关节软骨片，注意避开胫骨平台周围骨质增生部分及其表面的纤维软骨，PBS漂洗3次，将组织移入含少量培养基的小瓶内，无菌眼科剪将组织粉碎为1 mm³以下的组织块。

1.4.2 软骨细胞的分离、培养与传代 将组织块移入10 cm培养皿中，分别加入10倍体积含0.2%Ⅱ型胶原酶的α-MEM培养液与2倍体积的HBSS缓冲液，置于37 ℃孵育箱中消化，一般消化4-6 h；然后将含有组织块的液体移入15 mL离心管中，1 200 r/min离心5 min，弃去上清液，加入含体积分数为15%胎牛血清的α-MEM培养液终止消化。所得组织与细胞沉淀经吹打混匀后种入25 cm²培养瓶中，置于37 ℃恒温、体积分数为5%CO₂、饱和湿度培养箱内培养，每48 h更换培养液1次^[7]。

待细胞融合率达80%-90%后传代。传代时先吸干培养瓶内培养液，用PBS轻柔冲洗瓶底3次，加入适量0.25%胰蛋白酶，于37 ℃孵育箱内消化3 min，镜下观察贴壁细胞逐渐变为圆形，加入新的含体积分数为15%胎牛血清的培养液，吹打混匀，1 200 r/min离心5 min，收集细胞，加入适量完全培养液重悬，按1∶2比例传代。

1.4.3 软骨细胞的爬片与固定 收集不同代数关节软骨细胞，使用血球计数板计数，以每孔10⁴细胞种植于6孔细胞培养板中(底部放入20 mm直径盖玻片)，37 ℃恒温、体积分数为5%CO₂、饱和湿度培养箱内培养。待盖玻片上软骨细胞融合率达70%时，吸干孔内培养基，PBS冲洗3次，每次1 min；每孔加入适量40 g/L多聚甲醛固定，并将6孔板置于4 ℃冰箱内长期保存。

1.5 主要观察指标

1.5.1 软骨细胞的形态、生长情况 软骨细胞原代及传代培养的各个时期，使用倒置相差显微镜观察骨关节炎软骨细胞的形态、生长特性与生长情况，并拍照保存。

1.5.2 软骨细胞的苏木精-伊红染色 取生长良好的各代软骨细胞使用爬片技术，待细胞融合率达70%时，取出盖玻片，PBS清洗3次，40 g/L多聚甲醛固定20 min，三蒸水冲洗3次，苏木精滴染2 min，自来水反蓝2 min，之后使用体积分数为80%乙醇急洗，伊红滴染30 s，中性树胶封固，置于正置显微镜下观察拍照并记录。

1.5.3 软骨细胞的甲苯胺蓝染色 取生长良好的各代软骨细胞使用爬片技术，待细胞融合率达70%时，取出盖玻片，PBS清洗3次，40 g/L多聚甲醛固定并置于4 ℃冰箱过夜。取出盖玻片，三蒸水冲洗3次，置于染色架上，1%甲苯胺蓝染色30 min，三蒸水洗去多余的染液，体积分数为100%无水乙醇脱水，中性树胶封固，置于正置显微镜下观察拍照并记录。

1.5.4 Ⅱ型胶原的免疫荧光染色 取生长状态良好的原代软骨细胞，经0.25%胰蛋白酶消化后，以2×10⁵个接种于预置20 mm盖玻片的6孔板中培养。培养2 d后取出盖玻片，PBS清洗3次，以体积分数为10%山羊血清孵育1 h，PBS清洗干净，加入兔抗Ⅱ型胶原单克隆抗体(1∶150)，4 ℃孵育过夜，使用PBS彻底清洗后，加入带异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗兔多克隆抗体(1∶100)，避光条件下室温孵育1 h，DAPI染色标记细胞核，PBS漂洗30 min，中性树胶封固，荧光显微镜下观察并拍照记录。

1.5.5 Western blot检测软骨细胞Col2a、MMP-13及Aggrecan的蛋白表达 分别取原代和第1-3代软骨细胞，待其融合率达70%左右时，收集细胞并检测Col2a、Aggrecan、MMP-13的蛋白表达量。步骤如下：将培养液吸出，4 ℃预冷PBS漂洗2遍，加入200 μL预冷RIPA蛋白抽提试剂(50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.1% SDS)，加入蛋白酶抑制剂Protease inhibitor cocktail (Roche)，冰上孵育20 min，超声处理3 min，13 000 r/min(4 ℃)离心20 min，取上清，BCA法测定总蛋白的浓度，95 ℃变性5 min；每组蛋白上样量为15 μg/孔，15%SDS-PAGE电泳分离，之后将目的蛋白转移至PVDF膜上，转膜时间90 min；将膜完全浸没于5%BSA-TBST中，水平摇床孵育1 h(RT)；5%BSA-TBST稀释一抗，4 ℃水平摇床孵育过夜；次日，使用TBST洗膜3次，每次10 min；5%BSA-TBST稀释二抗，山羊抗兔、山羊抗鼠IgG(H+L)HRP(1∶10 000)室温孵育40 min；TBST洗膜3次，每次10 min；ECL滴加到膜的蛋白面，反应3 min；胶片曝光10 s-5 min(曝光时间随不同光强度而调整)，显影2 min，定影。Image-Pro Plus 6.0软件扫描测定灰度值。

1.6 统计学分析 采用SPSS 24.0软件(IBM)处理数据，年龄、灰度值及蛋白质相对表达量等定量资料的实验数据以x(_)±s表示，软骨细胞中Col2a、Aggrecan、MMP-13的相对表达量采用单因素ANOVA分析，以α=0.05为显著检验水准，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

软骨可分为透明软骨、弹性软骨和纤维软骨等3种。正常的关节软骨是透明软骨的一种，因关节软骨内无神经及血管分布，且软骨细胞的有丝分裂活动极低，其损伤后自身修复能力很差^[8]。骨关节炎的发生亦往往伴随着软骨磨损及软骨细胞退变^[1]。体外培养软骨细胞是研究软骨细胞生物学特性及骨关节炎发病机制的重要手段^[9]。由于种属不同，动物来源的关节软骨细胞其生物学特征与人关节软骨细胞存在一定差异^[10]，而采用手术、生物化学法等单因素作用造模的骨关节炎模型亦不能完全模拟出人骨关节炎发病过程中的多因素影响^[11]。因此，从临床上废弃的软骨组织中分离、培养的骨关节炎软骨细胞与人体的生理状态、生物学特征更相符合，对骨关节炎的防治可能更具有指导意义。

自1967年通过胰蛋白酶与胶原酶联合消化法将软骨细胞从软骨基质中分离，并成功体外培养之后^[12]，酶消化法进行了不同的改进，目前常用的有Green法^[13]、Klagabrun法等^[14]。国内亦有不少学者对此进行研究，多数实验仍是采用两步酶消化法(胰蛋白酶+Ⅱ型胶原酶)分离人关节软骨细胞，并进行传代培养^[15]。但关节炎软骨细胞与正常软骨细胞或动物软骨细胞相比，其来源多为中老年人，且组织受损较为严重，分裂增殖能力较弱，作者多次尝试使用传统的两步酶消化法，软骨细胞的收获量均不理想，从软骨组织块中消化出的单个关节炎软骨细胞难以贴壁生长，亦无法进行传代及后续研究。由于软骨细胞是软骨组织中唯一的细胞成分，因此该实验采用一步酶消化法，Ⅱ型胶原酶能特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，使用Ⅱ型胶原酶消化软骨组织块周围的胶原纤维网络，有利于软骨细胞从组织块中向四周爬出。对第1-3代培养的细胞进行Ⅱ型胶原免疫荧光染色及甲苯胺蓝染色鉴定可以证明所培养细胞确实为软骨细胞，表明直接使用Ⅱ型胶原酶消化获取骨关节炎软骨组织中软骨细胞是确实可行的。

在软骨细胞的体外培养过程中，由于细胞外环境与体内内环境之间存在差异，当其长期单层培养或经过反复传代后生物性状逐渐不稳，细胞的形态、分化与增殖都将发生一系列变化^[16]。有学者研究显示，正常人软骨细胞在培养5代以内生长良好，5代后开始出现去分化现象；骨关节炎软骨细胞增殖较慢，其生物学特征退变更早^[17]，在镜下细胞形态接近成纤维细胞，增殖速度较正常软骨细胞明显减慢，Ⅱ型胶原免疫组化染色与甲苯胺蓝染色均较弱，随着传代次数的增加，至第4-6代时已基本不表达阳性^[18]，而苏木精-伊红染色和甲苯胺蓝染色发现在第3代就已经出现较为明显的去分化现象。另外，Col2a与Aggrecan的蛋白表达随着传代次数的增加逐渐减弱，传至第3代时Western blot表达结果仅能达到原代的30%-40%，这也与既往的一些研究结果相一致^[19]。Col2a与Aggrecan是构成软骨基质的主要成分^[20]，大量研究证实，MMP-13可以优先并强力地降解Ⅱ型胶原^[21]，除此之外，其对蛋白多糖、骨粘连蛋白也具有降解作用^[22]。MMP-13多表达在骨关节炎患者的关节软骨组织中，而在正常人软骨中表达极低^[23-24]。

在此次研究中，随着传代次数的增加，MMP-13的表达逐渐上调，软骨细胞的异化作用加强，提示其在骨关节炎晚期基质降解中发挥着重要的作用^[25]。与正常软骨细胞相比，随着传代次数的增加，骨关节炎软骨细胞的功能性蛋白如Col2a、Aggrecan等表达整体上呈现下降趋势，细胞会更快地走向衰老和去分化。

综上所述，实验采用的Ⅱ型胶原酶一步消化法可成功从标本分离出骨关节炎软骨细胞并传代培养，但随着传代次数的增加，其去分化特性逐渐增强，功能性蛋白表达整体下降。这一生物学特性提示3代以内的软骨细胞符合人骨关节炎时软骨退变的表现，是用于实验研究的最佳选择，也对于未来研究骨关节炎疾病的发病机制和临床干预具有重大意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程