分离与鉴定人脂肪间充质干细胞来源的外泌体

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1715

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (17): 2651-2658.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1715

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分离与鉴定人脂肪间充质干细胞来源的外泌体

王静¹，蔡霞²，王志国²，徐全臣³，李坤⁴，华骋⁵

¹青岛大学医学部，山东省青岛市 266021；²青岛大学附属医院烧伤整形外科，山东省青岛市 266021；³青岛大学附属医院口腔科，山东省青岛市 266021；⁴青岛市第八人民医院手足外科，山东省青岛市 266021；⁵檀国大学，韩国京畿道安养市

修回日期:2019-02-25 出版日期:2019-06-18 发布日期:2019-06-18
通讯作者: 蔡霞，青岛大学附属医院烧伤整形外科，山东省青岛市 266021；王志国，青岛大学附属医院烧伤整形外科，山东省青岛市 266021
作者简介:王静，女，四川省广汉市人，汉族，硕士，医师。
基金资助:
山东省自然科学基金(XR2017MH083)，项目负责人：王志国；山东省重点研发计划基金(2018GSF118150)，项目负责人：徐全臣

Isolation and identification of exosomes from human adipose-derived mesenchymal stem cells

Wang Jing¹, Cai Xia², Wang Zhiguo², Xu Quanchen³, Li Kun⁴, Hua Cheng⁵

Revised:2019-02-25 Online:2019-06-18 Published:2019-06-18
Contact: Cai Xia, Department of Burn and Plastic Surgery, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266021, Shandong Province, China; Wang Zhiguo, Department of Burn and Plastic Surgery, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266021, Shandong Province, China
About author:Wang Jing, Master, Physician, School of Medicine, Qingdao University, Qingdao 266021, Shandong Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Shandong Province, No. XR2017MH083 (to WZG); the Shandong Provincial Key Research and Development Foundation, No. 2018GSF118150 (to XQC)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
外泌体：外泌体是由多种细胞分泌的，存在于几乎所有体液中的，具有膜结构的囊泡。外泌体外形呈杯状，直径为30-100 nm，密度为1.13-1.19 g/mL。外泌体具有分泌细胞的特性，其储存简单，能在4 ℃条件下保存较长时间。

摘要
背景：脂肪间充质干细胞是重要的种子细胞之一，可通过较简单的方法大量提取，但其储存条件较苛刻，运输不便，临床应用较困难。外泌体可由脂肪间充质干细胞分泌，其结构稳定，不易分解，为脂肪间充质干细胞在临床应用提供了新的可能性。
目的：提取人脂肪间充质干细胞，鉴定脂肪间充质干细胞，诱导脂肪间充质干细胞多向分化，提取脂肪间充质干细胞来源的外泌体，鉴定脂肪间充质干细胞来源的外泌体。
方法：收集青岛大学附属医院医学美容中心的正常成年女性行吸脂术后腹部浅层皮下脂肪组织，用酶消化法分离提取脂肪间充质干细胞进行原代培养，用细胞贴壁法纯化，胰酶消化传代。选取第3代细胞分别行流式细胞学鉴定，成脂肪细胞诱导与鉴定；成骨细胞诱导与鉴定。取第3-6代脂肪间充质干细胞，收集细胞上清液，差速离心法提取外泌体，BCA法测定蛋白浓度，透射电镜观察外泌体形态，粒度仪测外泌体直径分布，免疫磁珠法和流式细胞学鉴定。
结果与结论：①脂肪间充质干细胞形态为长梭形，形似成纤维细胞，排列紧密时呈巢状；②流式细胞学检测显示CD29，CD44，CD90及CD105均为阳性表达，CD34和CD45为阴性表达；③成骨细胞诱导至第9天碱性磷酸酶染色为蓝紫色，诱导至21 d时，茜素红S染色可见细胞外基质内出现红色钙结节；④成脂肪细胞诱导14 d后油红O染色呈橘红色；⑤透射电镜显示外泌体结构为杯状，直径为(81.225±22.226) nm，有膜结构。蛋白浓度约为1.5 g/L，直径分布集中于70-100 nm，外泌体流式细胞学显示CD9，CD29，CD44，CD63，CD90和CD105为阳性表达，CD34和CD45为阴性表达；⑥结果证实，人脂肪间充质干细胞来源的外泌体能通过超速离心法顺利提取，并通过透射电子显微镜、免疫磁珠法和流式细胞学检测相结合的方法成功鉴定。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-8503-3693(王静)

关键词: 脂肪间充质干细胞, 外泌体, 成脂诱导, 成骨诱导, 细胞鉴定, 免疫磁珠法, 流式细胞学检测

Abstract:

BACKGROUND: Adipose-derived mesenchymal stem cells as one of the important seed cells can be extracted in large quantities by simple methods. However, clinical application of the cells is limited by rigorous storage conditions and inconvenient transportation. Exosomes can be secreted by adipose-derived mesenchymal stem cells, whose structure is stable and difficult to decompose, providing new possibilities for clinical application of adipose-derived mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To isolate and identify human adipose-derived mesenchymal stem cells and induce multidirectional differentiation of the cells as well as to isolate and identify the exosomes from adipose-derived mesenchymal stem cells.
METHODS: Adipose-derived mesenchymal stem cells were isolated from superficial abdominal subcutaneous adipose tissue of normal adult women after liposuction. The cells were purified by cell adherence method. The cells were digested and passaged by trypsin. The third generation cells were identified by flow cytometry, followed by adipocyte induction and identification as well as osteoblast induction and identification. Adipose-derived mesenchymal stem cells of the 3^rd to 6^th generations were collected. The exosomes were extracted from cell supernatant by differential centrifugation. The protein concentration was measured by BCA. The morphology of the exosomes was observed by transmission electron microscopy. The diameter distribution of the exosomes was measured by particle size analyzer. The exosomes were identified by immunomagnetic beads and flow cytometry.
RESULTS AND CONCLUSION: Adipose-derived mesenchymal stem cells were long spindle-shaped, fibroblasts-like, when arranged tightly. Flow cytometry showed that adipose-derived mesenchymal stem cells were positive for CD29, CD44, CD90 and CD105, but negative for CD34 and CD45. Alkaline phosphatase staining was blue-purple on the 9^thday after induction of osteoblasts. Alizarin red S staining showed red calcium nodules in the extracellular matrix on the 21^st day after induction. Oil red O staining was orange on the 14^th day after induction of adipocytes. Under the transmission electron microscope the exosome was cup-shaped with a diameter of (81.225±22.226) nm and had a membrane structure. The protein concentration was about 1.5 g/L and the diameter distribution ws concentrated in 70-100 nm. Flow cytometry showed that the exosomes were positive for CD9, CD29, CD44, CD63, CD90 and CD105, but negative for CD34 and CD45. To conclude, the exosomes derived from adipose-derived mesenchymal stem cells can be successfully extracted by ultracentrifugation and identified by transmission electron microscopy, immunomagnetic beads and flow cytometry.

Key words: adipose-derived mesenchymal stem cells, exosomes, adipogenic induction, osteogenic induction, cell identification, immunomagnetic beads, flow cytometry

中图分类号:

R459.9
R364

王静, 蔡霞, 王志国, 徐全臣, 李坤, 华骋.

分离与鉴定人脂肪间充质干细胞来源的外泌体

[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(17): 2651-2658.

Wang Jing, Cai Xia, Wang Zhiguo, Xu Quanchen, Li Kun, Hua Cheng. Isolation and identification of exosomes from human adipose-derived mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(17): 2651-2658.

图/表（结果） 2

参考文献

[1] Williams KJ, Picou AA, Kish SL, et al. Isolation and characterization of porcine adipose tissue-derived adult stem cells. Cells Tissues Organs. 2008;(3):251.

[2] Liao HT, Chen CT. Osteogenic potential: comparison between bone marrow and adipose-derived mesenchymal stem cells. World J Stem Cells. 2014;6(3):288.

[3] De Ugarte DA, Ashjian PH, Elbarbary A, et al. Future of fat as raw material for tissue regeneration. Ann Plas Surg. 2003; 50(2):215-219.

[4] Zhang J, Li S, Li L, et al. Exosome and exosomal microrna: trafficking, sorting, and function. Genom Proteom Bioinf. 2015;13(1):17

[5] van der Pol E, Boing AN, Harrison P, et al. Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacol Rev. 2012;64(3):676.

[6] Richard JS, Hina K, Suresh M. ExoCarta as a resource for exosomal research. J Extracell Vesicles. 2012. doi: 10.3402/jev.v1i0.18374.

[7] Zuk PA, Zhu M, Ashjian P. human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell. 2002;13(12): 4279-4295.

[8] De Ugarte DA, Alfonso Z, Zuk PA, et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow. Immunol Lett. 2003;89(2-3):267.

[9] Bunnell BA, Flaat M, Gagliardi C, et al. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 2008; 45(2):115.

[10] Arrigoni E, Lopa S, de Girolamo L, et al. Isolation, characterization and osteogenic differentiation of adipose-derived stem cells: from small to large animal models. Cell Tissue Res. 2009;338(3):401

[11] Palumbo P, Lombardi F, Siragusa G, et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): an overview. Int J Mol Sci. 2018;19(7):1897.

[12] Bliley JM, Argenta A, Satish L, et al. Administration of adipose-derived stem cells enhances vascularity, induces collagen deposition, and dermal adipogenesis in burn wounds. Burns. 2016;42(6):1212.

[13] Liew L, Ong H, Dilley R. Isolation and culture of adipose-derived stromal cells from subcutaneous fat. Methods Mol Biol. 2017;1627:193.

[14] Riis S. Critical steps in the isolation and expansion of adipose-derived stem cells for translational therapy. Expert Rev Mol Med. 2015;17:e11.

[15] Jaiswal N, Haynesworth SE, Caplan AI, et al. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 1997; 64(2): 295.

[16] Baglioni S, Francalanci M, Squecco R, et al. Characterization of human adult stem-cell populations isolated from visceral and subcutaneous adipose tissue. FASEB J. 2009;23(10): 3494.

[17] Farshid G, Kristen EL, Hani AA, et al. Clonal analysis of the differentiation potential of human adipose-derived adult stem cells. J Cell Physiol. 2006;206(1):229-237.

[18] Jason W, Robert S, Mason MD, et al. Cancer exosomes trigger fibroblast to myofibroblast differentiation. Cancer Res. 2010;70(23):9621

[19] 方硕.干细胞来源的外泌体对成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的调控作用及其机制研究[D].上海:第二军医大学,2016.

[20] 王伟伟.HiPSC-MSCs来源Exosome促进部分肝切除后肝再生修复作用的研究[D].苏州:苏州大学,2016.

[21] 王娟.脂肪干细胞来源的外来体促进皮肤创伤愈合的研究[D].武汉:华中科技大学,2016.

[22] Ruenn Chai L, Fatih A, Soon Sim T, et al. Derivation and characterization of human fetal MSCs: an alternative cell source for large-scale production of cardioprotective microparticles. J Mol Cell Cardiol. 2010,48(6):1215-1224.

[23] Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 2001;7(2):211-218.

[24] Toyserkani NM, Christensen ML, Sheikh SP, et al. Adipose-derived stem cells: new treatment for wound healing? Ann Plas Surg. 2015;75(1):117-123.

[25] John KF, Isabella W, Zeni A, et al. Fat tissue: an underappreciated source of stem cells for biotechnology. Trends Biotechnol. 2006;24(4):150-154.

[26] Zhu Y, Liu T, Song K, et al. Adipose-derived stem cell: a better stem cell than BMSC. Cell Biochem Funct. 2008;26(6):664.

[27] Yoshimura K, Shigeura T, Matsumoto D, et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. J Cell Physiol. 2006;208(1):64.

[28] McIntosh K, Zvonic S, Garrett S, et al. The immunogenicity of human adipose-derived cells: temporal changes in vitro. Stem Cells. 2006;24(5):1246-1253.

[29] Aust L, Devlin B, Foster SJ, et al. Yield of human adipose- derived adult stem cells from liposuction aspirates. Cytotherapy. 2004;6(1):7.

[30] Di Taranto G, Cicione C, Visconti G, et al. Qualitative and quantitative differences of adipose-derived stromal cells from superficial and deep subcutaneous lipoaspirates: a matter of fat. Cytotherapy. 2015;(8):1076

[31] 毛曦媛,程辰,李华,等.不同部位脂肪组织来源干细胞的特性[J].中华整形外科杂志,2015,31(3):234.

[32] Mitchell JB, McIntosh K, Zvonic S, et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem cells (Dayton, Ohio). 2006;24(2):376-385.

[33] 吴尉,梁芳,宋小琴,等.人脂肪干细胞的提取和鉴定[J].中国组织工程研究,2015,19(28):4498.

[34] Lee RH, Kim B, Choi I, et al. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. Cell Physiol Biochem. 2004; 14(4-6):311-324.

[35] 田霖,孙筱放,刘海波,等.人脂肪干细胞的分离培养与生物学特性[J].中国组织工程研究,2012,16(32):5946

[36] Matthias S, Christoph P, Florian H, et al. Human mesenchymal stem cells at the single-cell level: simultaneous seven-colour immunofluorescence. J Anat. 2007;210(5):592-599.

[37] Katia M, Ivana F, Deborah R, et al. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. J Cell Biochem. 2006;97(4):744-754.

[38] Wankhade UD, Shen M, Kolhe R, et al. Advances in adipose-derived stem cells isolation, characterization, and application in regenerative tissue engineering. Stem Cells Int. 2016;2016:3206807.

[39] Vishnubalaji, R., Al-Nbaheen, et al. Comparative investigation of the differentiation capability of bone-marrow- and adipose-derived mesenchymal stem cells by qualitative and quantitative analysis. Cell Tissue Res. 2012;(2):419.

[40] Guilak F, Awad HA, Fermor B, et al. Adipose-derived adult stem cells for cartilage tissue engineering. Biorheology. 2004; (3/4):389.

[41] Scott DM, Kent GN, Cohn DV. Collagen synthesis in cultured osteoblast-like cells. Arch Biochem Biophys. 1980;201(2): 384-391.

[42] Reger RL, Tucker AH, Wolfe MR.Differentiation and characterization of human MSCs. Methods Mol Biol. 2008; 449:93.

[43] Gimble J, Guilak F. Adipose-derived adult stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential. Cytotherapy. 2003;5(5):362-369.

[44] 李洪超,金银鹏,王皙,等.人脂肪干细胞及其外泌体的分离与鉴定[J].中国组织工程研究,2018,22(13):2033-2038.

[45] Johnstone RM, Adam M, Hammond JR, et al. Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes). J Biol Chem. 1987;262(19):9412.

[46] Harding C, Heuser J, Stahl P. Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes. J Cell Biol. 1983;97(2):329.

[47] Pan BT, Teng K, Wu C, et al. Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes. J Cell Biol. 1985;101(3):942.

[48] Huang X, Yuan T, Tschannen M, et al. Characterization of human plasma-derived exosomal RNAs by deep sequencing. Bmc Genomics. 2013;14(1):319.

[49] Huang C, Fisher KP, Hammer SS, et al. Plasma exosomes contribute to microvascular damage in diabetic retinopathy (DR) by activating classical complement pathway. Diabetes. 2018;67(8):1639-1649.

[50] Qin W, Tsukasaki Y, Dasgupta S, et al. Exosomes in human breast milk promote EMT. Clin Cancer Res. 2016;22(17): 4517.

[51] Lukasik A, Brzozowska I, Zielenkiewicz U, et al. Detection of plant miRNAs abundance in human breast milk. Int J Mol Sci. 2017;19(1):E37.

[52] Street JM, Koritzinsky EH, Glispie DM, et al. Urine Exosome Isolation and Characterization. Methods Mol Biol. 2017; 1641:413-423.

[53] Gheinani AH, Vogeli M, Baumgartner U, et al. Improved isolation strategies to increase the yield and purity of human urinary exosomes for biomarker discovery. Sci Rep. 2018; 8(1):3945.

[54] Nonaka T, Wong DTW. Saliva-exosomics in cancer: molecular characterization of cancer-derived exosomes in saliva. Enzymes. 2017;42:125.

[55] Sun Y, Huo C, Qiao Z, et al. Comparative proteomic analysis of exosomes and microvesicles in human saliva for lung cancer. J Proteome Res. 2018;17(3):1101.

[56] Raposo G, Stoorvogel W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 2013;200(4):373.

[57] Boon RA, Vickers KC. Intercellular transport of MicroRNAs. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2013;33(2):186.

[58] A Aryani BD. Exosomes as a nanodelivery system: a key to the future of neuromedicine? Mol Neurobiol. 2016;53(2): 818-834.

[59] Otani K, Mai Y, Kodama T, et al. Plasma exosomes regulate systemic blood pressure in rats. Biochem Biophys Res Commun. 2018;503(2):776-783.

[60] Cocucci E, Meldolesi J. Ectosomes and exosomes: shedding the confusion between extracellular vesicles. Trends Cell Biol. 2015;25(6):364.

[61] Anders WM, Gunnar R.Role of exosomes in myocardial remodeling. Circ Res. 2014;114(2):315.

[62] Hu L, Wang J, Zhou X, et al. Exosomes derived from human adipose mensenchymal stem cells accelerates cutaneous wound healing via optimizing the characteristics of fibroblasts. Sci Rep. 2016;6:32993.

[63] 郭子宽,张涤平,陈贤光,等.一种人脐带间充质干细胞源外泌体及其获取方法和应用[P].CN201710262727.0, 2017-04-20.

[64] 纪成,费书琴,陈鸣,等.间充质干细胞来源外泌体在肾脏疾病中的研究进展[J].第二军医大学学报,2018,39(7):722-725.

[65] Januszyk K, Lima CD. The eukaryotic RNA exosome. Curr Opin Struc Biol. 2014;24(1):132.

[66] Gould SJ, Raposo G. As we wait: coping with an imperfect nomenclature for extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 2013. doi: 10.3402/jev.v2i0.20389.

[67] Crescitelli R, Lässer C, Szabó TG, et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. J Extracell Vesicles. 2013. doi: 10.3402/jev.v2i0.20677.

[68] van der Pol E, Hoekstra AG, Sturk A, et al. Optical and non-optical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes. J Thromb Haemost. 2010; 8(12):2596.

[69] 黄春煌,马媛媛,任林,等.脂肪间充质干细胞条件培养基及其外泌体促成骨作用的体外研究[J].中华口腔医学研究杂志(电子版), 2018,12(2):101.

[70] Raposo G, Nijman HW, Stoorvogel W, et al. Blymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. J Exp Med. 1996;183(3): 1161-1172.

[71] Caby MP, Lankar D, Vincendeau-Scherrer C, et al. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol. 2005;17(7):879-887.

[72] 肖漓,黄海燕,毕丽丽,等.HLA-G在肾移植受者外周血外泌体中表达的初步研究[J].中华器官移植杂志,2015,36(9):515.

[73] 杨向荣,丁娟,徐正阳,等.人脐带间充质干细胞来源外泌体的生物学特性研究[J].华中科技大学学报(医学版),2016,45(2):154

[74] 李玉静,刁振宇,胡娅莉.胎盘外泌体的生物学功能及分离纯化的研究进展[J].中华围产医学杂志,2015,18(6):446.

引言

材料方法

1.1 设计 细胞学实验。

1.2 时间及地点 于2017年11月至2018年12月在青岛大学附属医院中心实验室完成。

1.3 材料

人脂肪组织：实验所用脂肪组织取自青岛大学附属医院医学美容中心5位行吸脂术的患者，女性，年龄18-45岁，无基础疾病，无烟酒不良嗜好，无传染病，无影响脂肪代谢药物服用史。

1.4 实验方法

1.4.1 人脂肪间充质干细胞的培养及鉴定 取吸脂术后脂肪25 mL，用含青霉素-链霉素双抗的PBS冲洗3遍，去除肉眼可见的筋膜及红细胞后，加入等体积0.075%Ⅰ型胶原酶^[7-11]，在37 ℃、150 r/min的条件下消化30-45 min，加入等体积含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，15 000 r/min离心10 min^[12]，去除上层油脂及中层清液，用5 mL红细胞裂解液重悬，室温静置5 min，1 000 r/min离心5 min^[13-14]，去除上清液，用含体积分数15%胎牛血清的低糖DMEM培养基重悬，70 μm细胞筛网过滤后，移入培养皿行原代培养，每隔两三天换液，细胞浓度融合生长至80%-90%时，用体积分数0.25%胰蛋白酶消化后按1∶2传代培养。

取第3代细胞，使用PBS冲洗3次后，体积分数0.25%胰蛋白酶消化后，用700 μL的PBS配置成细胞浓度为1×10⁶ L^-1的细胞悬液，分别向7支1 mL离心管内加入100 μL细胞悬液，依次加入PE-anti-human CD29，FITC-anti-human CD34，488-anti-human CD44，PE-anti-human CD45，PE-anti-human CD90，488-anti-human CD105和PBS各5 μL，室温避光孵化30 min，1 000 r/min离心5 min，去除上清液，200 μL的PBS重悬，1000 r/min离心5 min，去除上清液，洗涤3次后，200 μL的PBS重悬，等待上机检测。数据用FlowJo Software 7.6.1软件分析。

1.4.2 成骨细胞诱导 取第3代细胞，细胞融合生长至80%-90%时，更换成骨细胞诱导培养基，以仅用完全培养基培养的细胞为空白对照，分别于第0，1，4，7，14，21天观察细胞形态。诱导至第9天行碱性磷酸酶染色^[15]，诱导至第21天行茜素红S染色^[16]，显微镜观察并记录。

1.4.3 成脂肪细胞诱导 取第3代细胞，细胞融合生长至80%-90%时，更换成脂肪细胞诱导培养基，每隔3 d换液，以仅用完全培养基培养的细胞为空白对照，分别于第0，1，4，7，14天观察细胞形态。诱导至第14天油红O染色^[17]，显微镜观察并记录。

1.4.4 外泌体的收集 取3-6代细胞，细胞融合生长至80-90%时，换无血清培养基培养24-48 h，收集细胞上清液。收集的细胞上清液保存于-80 ℃冰箱等待超速离心。

1.4.5 外泌体的提取 将收集的上清液，300×g离心10 min，去除死细胞和大的细胞碎片，2 000×g离心10 min^[18]，去除死细胞和细胞碎片，10 000×g /min离心30 min去除细胞碎片较大的囊泡，0.22 μm针头滤器过滤^[19]，去除微泡及可能存在的凋亡小体。用20 mL空针将上清液转移至超速离心管中，10⁶×g离心70 min，去除上清液，收集沉淀，得到粗提取的外泌体，10⁶×g离心70 min，去除上清液，用100 μL PBS溶解沉淀，得到较纯的外泌体。一共超速离心750 mL上清液，以上操作均在4 ℃，无菌条件下进行。

1.4.6 外泌体浓度测定及形态学观察 取5 μL外泌体溶液，用BCA法测外泌体的蛋白浓度^[18]；取1滴外泌体滴于铜网上，体积分数1%磷钨酸负染^[20]，室温干燥后，用透射电子显微镜观察外泌体外形及检测外泌体直径^[21]；取20 μL外泌体溶液，用PBS稀释至200 μL，用粒度仪检测直径分布。

1.4.7 外泌体的流式细胞学检测 旋涡30 s重悬CD81标记的磁珠，取40 μL磁珠到1 mL离心管中，加入400 μL PBS清洗磁珠，混合均匀，将离心管放在磁力架上1 min，弃去上清液；用60 μL的PBS重悬磁珠，加入40 μL外泌体溶液(一共100 μL)，在2-8 ℃条件下孵育过夜(18-22 h)；第2天，将离心管离心3-5 s，收集管底沉淀；加入300 μL PBS清洗磁珠结合的外泌体，混合均匀，将离心管放在磁力架上1 min，弃去上清液；重复清洗磁珠结合的外泌体1次，800 μL PBS重悬；分别向8支1 mL离心管加入100 μL悬液，依次加入PE-anti-human CD9，PE-anti-human CD29，FITC-anti-human CD34，488-anti-human CD44，PE-anti-human CD45，PE-anti-human CD63，PE-anti-human CD90，488-anti-human CD105和PBS各10 μL，室温避光孵化40 min后，将离心管放在磁力架上1 min，弃去上清液；加入400 μL PBS清洗磁珠结合的外泌体2次，用100 μL PBS重悬，等待上机检测。数据用FlowJo Software 7.6.1软件分析。

1.5 主要观察指标 人脂肪间充质干细胞的形态、表面标志物、多向分化的能力、电子显微镜下外泌体的形态和直径、外泌体的直径分布、外泌体特异性标志物。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

人间充质干细胞的特征在于其黏附性生长^[22]，自有研究从吸脂后脂肪组织内成功分离出脂肪组织提取细胞，并证明其具有间充质干细胞的特性后^[7^，^23]，因脂肪间充质干细胞相较于其他间充质干细胞具有来源广泛、取材简易、创伤较小等优点逐渐成为干细胞研究的重点。人体内含有丰富的脂肪组织，可以为干细胞研究提供充足的实验原料。脂肪组织能提供的干细胞数量也比其他组织更高，1 g脂肪组织能提供的干细胞数量是1 g骨能提供的大约500倍^[24-25]。另有报道证明脂肪间充质干细胞具有较强的自我增殖能力，每隔14 d传代，传至第25代仍保持较强的增殖能力，维持其表型，且具有较强的多分化潜能^[26]。因此实验选择人脂肪间充质干细胞为实验对象。

多种方法均可获得脂肪组织，其中吸脂术能获取大量的脂肪组织^[27]，McIntosh等^[28]表明每毫升吸脂术后的组织中可在单次传代中产生2.5×10⁵个有核细胞，有研究亦证实每毫升吸脂术后组织中经扩增培养后平均能获得大量脂肪间充质干细胞^[29]。不同部位、不同层次的脂肪组织所含脂肪间充质干细胞量不同，更多的脂肪间充质干细胞存在于皮下脂肪中^[30]。不同脂肪组织分离出的脂肪间充质干细胞活性也存在差异^[31]，据报道及预实验结果，实验选用腹部浅层皮下吸脂术后脂肪。脂肪间充质干细胞的分离提取方法多种多样，常见的有酶消化法和组织块贴壁法^[32]。成熟的脂肪细胞含有大量的胶原酶^[33]，使用Ⅰ型胶原酶消化脂肪组织易于分离成熟的脂肪细胞与脂肪间充质干细胞，可获取较大量的脂肪间充质干细胞。

使用酶消化法提取的细胞为许多细胞类型的群体，包括血细胞、前脂肪细胞、成纤维细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞、滞留的单核细胞/巨噬细胞、淋巴细胞和脂肪间充质干细胞等^[11]，需对脂肪间充质干细胞进行鉴定。据目前研究表明脂肪间充质干细胞无单一特定的表面标志物，其与骨髓间充质干细胞表面标志物相似^[34]，需通过对多种相对特异的表面标志物进行检测来对其进行鉴定。常用的检测方法为流式细胞技术和免疫组织化学技术。CD29存在于红细胞外几乎所有细胞及组织内^[35]，其阳性高表达可排除红细胞污染。CD44在人间充质干细胞群体的几乎所有细胞中均有表达^[36]；CD90在各代间充质干细胞中均高表达^[37]；CD105与CD44相似，也几乎表达于所有人间充质干细胞内^[36]，此3者均高表达可认定为间充质干细胞。CD45为造血系统源细胞细胞表面标志物^[25^，^38]，其阴性高表达表达，可排除造血干细胞污染。实验使用流式细胞仪检测结果显示CD29，CD44，CD90及CD105均为阳性表达，CD34，CD45为阴性表达。与以往研究报道相符^[8^，^34]，可以在很大程度上认为脂肪间充干细胞。

由于缺乏明确分子、CD和基因标记物来识别成体干细胞^[39]，脂肪间充质干细胞具有多向分化的潜力，可在体外经诱导后分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞及神经样细胞等^[40]，因此可诱导多向分化来鉴定脂肪间充质干细胞。在体外诱导成骨细胞分化中，碱性磷酸酶是早期分化为未成熟成骨细胞的特征，诱导后4 d开始出现，12 d达到峰值^[15]，随后开始下降，经碱性磷酸酶染色后可呈蓝紫色；成熟成骨细胞细胞外基质分泌丰富的Ⅰ型胶原，在细胞分化的后期钙化^[41]，诱导后21 d茜素红S染色阳性^[42]。实验结果为成骨诱导至9 d碱性磷酸酶染色为蓝紫色，诱导至21 d茜素红S染色可见细胞外基质内出现红色钙结节，可认为成骨细胞诱导成功。在体外诱导成脂肪细胞分化中，诱导7-10 d后，细胞内充满含有中性脂质的空泡^[43]，能被油红O检测。实验结果为成脂诱导至14 d时出现大量透光性良好的大小不等的空泡，油红O染色为橘红色^[44]，可认为成脂肪细胞诱导成功。经实验结果表明所鉴定细胞具有多向分化的潜能。结合流式细胞学鉴定结果可认为实验所培养细胞为脂肪间充质干细胞。

外泌体首次被提出是在1980年，在网织红细胞成熟过程中被分离出来的^[45-47]，随后外泌体逐渐从其他细胞中被分离出来，在血清^[48-49]、母乳^[50-51]、尿液^[52-53]、唾液等体液中也能分离出外泌体^[54-55]，外泌体几乎存在于所有体液中。大多数细胞均能释放外泌体，如B细胞、T细胞、上皮细胞、内皮细胞、间充质干细胞及少突胶质细胞等^[56-58]。外泌体是最小的细胞外囊泡^[59]，呈杯状，直径30-100 nm^[5]，具有膜结构，密度1.13-1.19 g/mL^[6]。形成外泌体的常规途径是从质膜向内萌发进入多囊泡体，在这些多囊泡体中，外泌体可以通过向内出芽形成，随后可以通过多囊泡体与质膜的融合而释放出来，这些小泡还携带标记物，如CD63和CD81^[58^，^60]。外泌体是细胞间通讯的基本媒介，因为多种miRNAs、蛋白质、细胞因子都存在于外泌体中^[61-63]，因此外泌体可以通过运输受体与配体或者相关的遗传物质^[5]，在长距离或短距离的细胞信号和物质传递中均起重要作用^[64]。干细胞来源的外泌体还具有稳定性高、无免疫排斥、归巢效应、剂量和浓度易于控制等优点^[62^，^65]。

获得外泌体的方法有很多，其中差速离心法是收集外泌体的基础^[66]，能获取较大量的外泌体，与外泌体提取和相比，差速离心法也可避免使用透射电子显微镜观察时PEG的影响。细胞上清液内存在多种物质，包括死细胞、细胞碎片、微泡、外泌体、凋亡小体等，其中死细胞和较大的细胞碎片可通过低速离心分离，较小的细胞碎片和较大的囊泡可以通过中速离心分离，微泡可以通过(10 000-20 000)×g离心力分离^[67]，凋亡小体直径在1-5 μm^[5]，可通过0.22 μm的滤器将其分离，外泌体直径较小，可通过(100 000-200 000)×g分离，因此实验选择差速离心法和0.22 μm滤器分离提取外泌体。

细胞来源的囊泡外形均呈杯状，杯状形态是区别细胞是区分细胞来源囊泡和大小相似的颗粒有用的特征^[5]，区分微泡、凋亡小体和外泌体主要在于直径大小，外泌体直径30-100 nm，透射电子显微镜是鉴定外泌体的金标准，是惟一可以同时测定囊泡大小和观察囊泡形态的方法^[68]。粒度仪可以检测悬浮颗粒的直径分布^[69]。实验透射电子显微镜鉴定的颗粒形态呈杯状，有膜结构，直径(81.225±22.226) nm，结合粒度仪测定的颗粒直径范围集中于70-100 nm可以初步认为实验使用差速离心法提取的为外泌体。

外泌体具有膜结构，其膜与质膜不同^[70]，外泌体膜具有较多的脂筏和蛋白质^[4-5]，有其特定的表面标志物，如膜结合蛋白CD9，CD63，CD81及MHCⅠ类分子等^[58^，^71]，可以用流式细胞学和Western blot法鉴定^[67^，^72-73]，实验选择使用流式细胞学鉴定。外泌体的直径很小，一般的流式细胞仪无法检测，根据外泌体膜具有特定的表面标志物，实验选择使用免疫磁珠法和流式细胞学相结合的方法鉴定外泌体^[74]，CD81是外泌体膜的特定标志物，所以实验选择CD81标记的磁珠富集外泌体，增加外泌体的直径，让流式细胞仪容易检测。外泌体具有分泌细胞的特性，可以通过检测特定的表面蛋白来反映其组织或细胞的来源^[4]，实验流式细胞学鉴定结果显示CD9，CD29，CD44，CD63，CD90及CD105均为阳性表达，CD34及CD45为阴性表达，进一步证明实验提取出的颗粒为外泌体，其来源为脂肪间充质干细胞。

综上所述，脂肪组织的来源广泛，可以通过较为简便的方法获取较大量纯度较高的脂肪间充质干细胞。脂肪间充质干细胞遗传信息稳定，具有自我更新和多向分化能力，可多次传代，是间充质干细胞研究领域的重要成员。但是其储存条件及免疫原性限制了其在临床上的应用。外泌体几乎存在于所有体液，几乎所有细胞均能释放外泌体^[74]，是细胞形成腔内小体后由多囊泡体胞吐作用释放到细胞外的胞外囊泡^[60]，具有分泌细胞的特性。外泌体具有膜结构是相对稳定的结构，其浓度不受降解过程的影响^[58]。外泌体的特性为脂肪间充质干细胞应用于临床提供了新的途径。实验顺利分离并鉴定了脂肪间充质细胞来源的外泌体，为后续脂肪间充质干细胞来源的外泌体的研究及其在临床上的应用提供了实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

分离与鉴定人脂肪间充质干细胞来源的外泌体

Isolation and identification of exosomes from human adipose-derived mesenchymal stem cells

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[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	赵敏, 冯柳祥, 陈垚, 顾霞, 王平义, 李一梅, 李文华. 低氧环境下外泌体可作为疾病的标志物[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1104-1108.
[3]	樊全宝, 罗惠娜, 王丙云, 陈胜锋, 崔连旭, 江文康, 赵明明, 王静静, 罗冬章, 陈志胜, 白银山, 刘璨颖, 张晖. 低氧培养犬脂肪间充质干细胞的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1002-1007.
[4]	衣志爽, 王植海, 李明, 周清安, 杨保胜 . 人脐带间充质干细胞来源外泌体抑制髓母细胞瘤Daoy细胞增殖并促其凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(31): 4945-4949.
[5]	凌华军, 王其友, 林伟文, 罗鹏刚. 骨髓间充质干细胞来源外泌体保护软骨细胞延缓骨关节炎的发生发展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(31): 4964-4969.
[6]	陈子扬, 蒲锐, 邓爽, 袁凌燕. 外泌体对运动介导胰岛素抵抗类疾病的调控作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 4089-4094.
[7]	陈扬, 黄邓高, 高元慧, 王顺兰, 曹卉, 郑琳麟, 何浩伟, 罗思琴, 肖敬川, 张应爱, 张淑芳. 低强度脉冲场超声促进人脂肪间充质干细胞的增殖和黏附[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3949-3955.
[8]	于丹, 许光兰, 赵媚, 李娇, 李国生, 王光耀, 林浩, 郑曼莉, 李愿玲. 干细胞及多种细胞来源外泌体治疗慢性呼吸系统疾病的意义与可能性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 4053-4057.
[9]	高坤, 陈大宇, 张勇, 刘伟东, 孙淑芬, 赖文强, 马笃军, 吴益宏, 林展鹏, 蒋鹰鹭, 余伟吉. 牛膝醇提物调控滑膜成纤维细胞外泌体抑制软骨细胞外基质降解[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3636-3640.
[10]	张剑慧, 马贺然, 谭毅, 王芝辉. 人脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶修复猪膝关节损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2969-2975.
[11]	高元慧, 向杨, 曹卉, 王顺兰, 郑琳麟, 何浩伟, 张应爱, 张淑芳, 黄邓高. 两种月龄近交系五指山小型猪脂肪间充质干细胞生物学特性的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2988-2993.
[12]	严秀蕊, 陶金, 梁雪云. 人胎盘间充质干细胞来源外泌体保护氧化应激损伤肺上皮细胞的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2994-2999.
[13]	王康, 智晓东, 王伟. 干细胞来源外泌体修复周围神经损伤的效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 3083-3089.
[14]	赵双丹, 郑嘉华, 亓文博, 黄向华. 间充质干细胞外泌体应用于生殖系统疾病治疗的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 3097-3102.
[15]	刘冯, 张瑜, 王燕丽, 骆威, 韩超珊, 李杨欣. 温敏型壳聚糖水凝胶包封外泌体在缺血性疾病中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2479-2487.