骨碎补总黄酮联合纳米骨材料诱导MC3T3-E1细胞的成骨分化及其机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1713

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (18): 2888-2893.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1713

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骨碎补总黄酮联合纳米骨材料诱导MC3T3-E1细胞的成骨分化及其机制

李晋玉¹，俞兴¹，姜俊杰²，徐林¹，赵学千¹，孙旗¹，郑晨颖¹，白春晓¹，刘楚吟¹，张喆¹，贾育松¹

¹北京中医药大学东直门医院骨科，北京市 100700；²中国中医科学院中医临床基础医学研究所，北京市 100700

收稿日期:2019-01-22 出版日期:2019-06-28 发布日期:2019-06-28
通讯作者: 贾育松，主任医师，北京中医药大学东直门医院骨一科，北京市 100700
作者简介:李晋玉，男，1984年生，山西省晋城市人，汉族，2018年北京中医药大学毕业，博士，副主任医师，主要从事中医药在骨组织工程中的应用研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81503601)，项目负责人：李晋玉；国家自然科学基金项目(81603517)，项目负责人：姜俊杰；北京中医药大学东直门医院青苗人才项目(DZMYS-201802)，项目负责人：李晋玉

Osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells induced by osteopractic total flavone and nano-hydroxyapatite/collagen composite and the underlying mechanism

Li Jinyu¹, Yu Xing¹, Jiang Junjie², Xu Lin¹, Zhao Xueqian¹, Sun Qi¹, Zheng Chenying¹, Bai Chunxiao¹, Liu Chuyin¹, Zhang Zhe¹, Jia Yusong¹

¹Department of Orthopedics, Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China; ²Institute for Basic Research in Clinical Medicine, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China

Received:2019-01-22 Online:2019-06-28 Published:2019-06-28
Contact: Jia Yusong, Chief physician, Department of Orthopedics, Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China
About author:Li Jinyu, MD, Associate chief physician, Department of Orthopedics, Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81503601 (to LJY) and 81603517 (to JJJ); the Young Talent Project of Dongzhimen Hospital of Beijing University of Chinese Medicine, No. DZMYS-201802 (to LJY)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

骨碎补总黄酮：是由水龙骨科植物槲蕨干燥根茎中提取的有效成分，实验证明骨碎补总黄酮能够促进成骨细胞的增殖，抑制破骨细胞的成熟分化。

骨桥蛋白：一种含有Arg-Gly-Asp(RGD)结构的酸性糖蛋白，存在于矿化和活性沉积区，它与诱导成骨细胞成熟表型表达和矿化骨基质形成的活性蛋白密切相关；在成矿阶段，骨连接素、纤连蛋白与骨桥蛋白的表达高度相关。

背景：前期研究发现，骨碎补总黄酮可促进纳米骨材料表面MC3T3-E1细胞的成骨分化，其作用机制有待进一步研究。

目的：探讨骨碎补总黄酮联合纳米骨材料对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响及作用机制。

方法：将MC3T3-E1细胞接种于纳米骨材料表面，分别加入含0，100，250 mg/L骨碎补总黄酮的培养基培养。培养第1，3，5，7，9，11，14天，检测细胞碱性磷酸酶活性；培养第1，2，3，4周，ELISA法检测培养上清中骨钙蛋白水平；培养第7，14，21天，茜素红S染色观察细胞钙化结节形成情况；培养第14天，PCR检测成骨相关基因表达。

结果与结论：①第1，3，14天，3组细胞碱性磷酸酶活性比较差异无显著性意义(P > 0.05)；培养第5，7，9天，100，250 mg/L组碱性磷酸酶活性均高于0 mg/L组(P < 0.05)，100 mg/L组、250 mg/L组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)；②培养第1，2，3，4周，100，250 mg/L组骨钙蛋白质量浓度均高于0 mg/L组 (P < 0.05)，100 mg/L组、250 mg/L组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)；③培养第7，14，21天，100，250 mg/L组可见明显的钙化结节；④培养第14天，100，250 mg/L组骨钙蛋白、Ⅰ型胶原和骨桥蛋白mRNA表达水平均高于0 mg/L组(P < 0.05)，100 mg/L组、250 mg/L组间骨钙蛋白、Ⅰ型胶原和骨桥蛋白mRNA表达比较差异无显著性意义(P > 0.05)；⑤结果表明，骨碎补总黄酮联合纳米骨材料可诱导MC3T3-E1细胞分化为成骨细胞，其机制可能是通过提高碱性磷酸酶活性、骨钙蛋白水平及Ⅰ型胶原、骨钙蛋白和骨桥蛋白mRNA表达来实现的。

ORCID: 0000-0002-2031-8644(李晋玉)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 纳米骨材料, 骨碎补总黄酮, MC3T3-E1细胞, 成骨分化, 骨桥蛋白, 骨钙蛋白；, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Preliminary study has found that osteopractic total flavone can promote osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells on the surface of nano-hydroxyapatite/collagen composite, but the underlying mechanism needs to be studied in depth.

OBJECTIVE: To investigate the effect of osteopractic total flavone combined with nano-hydroxyapatite/collagen composite on the osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells and its mechanism.

METHODS: MC3T3-E1 cells were seeded on the surface of nano-hydroxyapatite/collagen composite and cultured in culture media containing 0, 100 and 250 mg/L osteopractic total flavone, respectively. After 1, 3, 5, 7, 9, 11 and 14 days of culture, the activity of alkaline phosphatase was detected. After 1, 2, 3 and 4 weeks of culture, the level of osteocalcin in the culture supernatant was detected by ELISA. Alizarin red staining was used to observe the formation of calcified nodules at 7, 14 and 21 days of culture. At 14 days of culture, the expression of osteogenic related genes was detected by PCR.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) There was no significant difference in the alkaline phosphatase activity at 1, 3 and 14 days among groups (P > 0.05). At 5, 7 and 9 days of culture, the alkaline phosphatase activity in the 100 and 250 mg/L groups was higher than that in the 0 mg/L group (P < 0.05), and there was no significant difference between 100 and 250 mg/L groups (P > 0.05). (2) The mass concentration of osteocalcin in the 100 and 250 mg/L groups was higher than that in the 0 mg/L group at 1, 2, 3 and 4 weeks of culture (P < 0.05), and there was no significant difference between 100 and 250 mg/L groups (P > 0.05). (3) At 7, 14 and 21 days of culture, obvious calcified nodules were visible in the 100 and 250 mg/L groups. (4) At 14 days of culture, the mRNA expression levels of osteocalcin, type I collagen and osteopontin in the 100 and 250 mg/L groups were higher than that in the 0 mg/L group (P < 0.05), and there was no significant difference between 100 and 250 mg/L groups (P > 0.05). (5) These results imply that osteopractic total flavone combined with nano-hydroxyapatite/collagen composite can induce MC3T3-E1 cells to differentiate into osteoblasts, which may be by increasing alkaline phosphatase activity, osteocalcin level and mRNA expression of type I collagen, osteocalcin and osteopontin.

Key words: nano-hydroxyapatite/collagen composite, osteopractic total flauone, MC3T3-E1 cells, osteogenic differentiation, osteopontin, osteocalcin, the National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

R459.9
R336

李晋玉，俞兴，姜俊杰，徐林，赵学千，孙旗，郑晨颖，白春晓，刘楚吟，张喆，贾育松. 骨碎补总黄酮联合纳米骨材料诱导MC3T3-E1细胞的成骨分化及其机制[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(18): 2888-2893.

Li Jinyu, Yu Xing, Jiang Junjie, Xu Lin, Zhao Xueqian, Sun Qi, Zheng Chenying, Bai Chunxiao, Liu Chuyin, Zhang Zhe, Jia Yusong. Osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells induced by osteopractic total flavone and nano-hydroxyapatite/collagen composite and the underlying mechanism[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(18): 2888-2893.

图/表（结果） 4

2.1 碱性磷酸酶活性检测结果分析碱性磷酸酶活性以评估成骨细胞分化水平。各组细胞碱性磷酸酶活性随培养时间的变化趋势，见图1所示。中药干预第 1，3，14天时，3组间成骨细胞碱性磷酸酶活性比较差异无显著性意义(P > 0.05)；中药干预第5，7，9天时，100，250 mg/L组成骨细胞碱性磷酸酶活性均高于0 mg/L组(P < 0.05)， 100 mg/L组、250 mg/L组成骨细胞碱性磷酸酶活性比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.2 骨钙蛋白检测结果如图2所示，中药干预2，3，4周时间点，100，250 mg/L组骨钙蛋白质量浓度显著高于 0 mg/L组(P < 0.05)，100 mg/L组、250 mg/L组骨钙蛋白质量浓度比较差异无显著性意义(P > 0.05)；中药干预2周后，各组骨钙蛋白质量浓度达到峰值，随后其质量浓度有不同程度下降趋势，但各组在第4周的骨钙蛋白质量浓度仍要比1周时高。

2.3 茜素红S染色鉴定结果对3组进行茜素红S染色，来评估MC3T3-E1细胞中钙化结节形成的水平，并在光学显微镜下进一步观察结节情况。如图3A所示，大体宏观观察显示，中药干预7，14，21 d，0 mg/L组染色最小，但在100，250 mg/L组中观察到增加的染色，100 mg/L组和 250 mg/L组间的视觉差异不显著，并且两组均显示随着时间的推移染色水平增加。如图3B所示，光学显微镜下茜素红S染色可见钙化结节形成，小鼠MC3T3-E1成骨细胞的细胞质内有明显染色改变，呈现较深红色，提示茜素红S溶液可与细胞质钙离子相结合，250 mg/L组中钙化结节形成在分化的初始阶段(7 d)比100 mg/L组更显著，在中药干预14，21 d时，两组均表现出钙化结节的数量和大小增加，但大体观察看不到这种差异。

2.4 成骨基因表达检测结果 100，250 mg/L组的Ⅰ型胶原、骨钙蛋白和骨桥蛋白 mRNA表达水平均显著高于 0 mg/L组(P < 0.05)，100 mg/L组和250 mg/L组Ⅰ型胶原、骨钙蛋白和骨桥蛋白mRNA表达水平比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图4。

参考文献

[1]Shakir M,Jolly R,Khan AA,et al.Resol based chitosan/ nanohydroxyapatite nanoensemble for effective bone tissue engineering.Carbohydr Polym.2017;139:317-327．

[2]周静,冯卓卓,罗洁,等.纳米支架材料在骨组织工程应用中的优势[J].临床口腔医学杂志,2018,34(10):633-635.

[3]李晋玉,赵学千,孙旗,等.骨碎补总黄酮的实验及临床研究概况[J].中国骨质疏松杂志,2018,24(10):1357-1364.

[4]冯庆玲,崔福斋,张伟.纳米羟基磷灰石胶原骨修复材料[J].中国医学科学院学报,2002,24(2):124-128.

[5]李晋玉.骨碎补总黄酮联合纳米骨材料对成骨细胞增殖分化及血管新生的影响[D].北京:北京中医药大学,2018.

[6]国家药典委员会中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2010:121.

[7]史岩,马秋野,喻一东,等.骨碎补总黄酮促进骨质疏松性骨折愈合中参与Wnt/β-catenin信号通路的初步研究[J].中医药学报, 2018,46(2):49-52.

[8]尹文哲,张小玲,叶义杰,等.骨碎补对微重力下共培养骨细胞中成骨细胞分化的影响[J].中医药学报,2017,45(4):16-20.

[9]齐鹏飞,尹文哲,孙奇峰,等.失重下骨碎补总黄酮抑制JNK通路促间充质干细胞增殖的研究[J].中医学报, 2016,31(11): 1742-1745.

[10]孙奇峰,尹文哲,高原,等.失重下骨碎补总黄酮经MAPK通路促间充质干细胞向成骨细胞分化研究[J].中医药学报, 2016,44(4): 10-13.

[11]刘伟,赵劲民,苏伟,等.骨碎补总黄酮可促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化[J].中国组织工程研究与临床康复, 2011,15(32): 6021-6026.

[12]舒晓春,刘君静,朱丹华,等.不同浓度的骨碎补总黄酮对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响[J].中国病理生理杂志, 2010,26(7):1261-1264.

[13]Song S,Gao Z,Lei X,et al.Total Flavonoids of Drynariae Rhizoma Prevent Bone Loss Induced by Hindlimb Unloading in Rats.Molecules.2017;22(7):1033.

[14]王鑫众,张利恒,罗浩,等.强骨胶囊与骨瓜提取物注射液治疗骨质疏松性股骨骨折的价值分析[J].中国药物经济学, 2019,14(1): 44-47.

[15]李刚建,闵奇,赵鑫.强骨胶囊联合骨瓜提取物注射液治疗骨质疏松性股骨骨折的临床研究[J].现代药物与临床, 2018,33(5): 1135-1139.

[16]翟景艳.强骨胶囊治疗老年Colles骨折术后的临床疗效[J].中国民康医学,2017,29(12):53-54.

[17]栾小红.强骨胶囊结合仙灵骨葆胶囊治疗骨质疏松性股骨骨折34例[J].河南中医,2014,34(10):1949-1950.

[18]刘国辉,陈东,杨述华,等.强骨胶囊治疗骨质疏松性股骨转子间骨折的临床观察[J].中西医结合研究,2010,2(1):4-6.

[19]高焱.骨碎补总黄酮治疗骨折延迟愈合和骨不连[J].中医正骨, 2007,19(7):11-12,82.

[20]李慧英,孟东方,阮志磊.骨碎补总黄酮对激素性股骨头坏死血钙、血磷及空骨陷窝率的影响[J].中华中医药杂志, 2016,31(12): 5352-5354.

[21]阮志磊.骨碎补总黄酮对激素性股骨头坏死的实验研究[D].郑州:河南中医学院,2015.

[22]王月芬.强骨胶囊治疗成人股骨头缺血性坏死216例[J].河南中医,2009,29(6):572-573.

[23]杨成.钻孔减压术配合强骨胶囊治疗成人股骨头缺血性坏死疗效观察[J].实用中医药杂志,2017,33(5):493-494.

[24]赵秀敏,艾红军,常新.成骨细胞和破骨细胞的传导通路和相关因子[J].中国实用口腔科杂志,2009,2(3):176-179.

[25]李彬,张柳.RUNX2与骨代谢的调控[J].中国骨质疏松杂志, 2009, 15(1):63-67.

[26]徐成峰,胡大海,赵周婷,张万福,白晓智,蔡维霞.兔骨髓间充质干细胞体外分离培养及多向诱导分化[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(6):1002-1005.

[27]Zhang L,Hu Y,Sun,CY,et al.Lentiviral sh RNA silencing of BDNF inhibits in vivo multiple myeloma growth and angiogenesis via down-regulated stroma-derived VEGF expression in the bone marrow milieu.Cancer Sci. 2010; 101(5):1117-1124.

[28]张贤,朱丽华,钱晓伟,等.杜仲醇提取物诱导骨髓间充质干细胞成骨分化中的Wnt信号途径[J].中国组织工程研究, 2012,16(45): 8520-8523.

[29]Zhou PR, Liu HJ, Liao EY, et al.LRP5 polymorphisms and response to alendronate treatment in Chinese postmenopausal women with osteoporosis. Pharmacogenomics. 2014;15(6):821-831.

引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点实验于2017年5至12月在北京中医药大学教育部中医内科学重点实验室完成。

1.3 材料小鼠MC3T3-E1成骨细胞株(中国北京协和医院细胞生物中心)；骨碎补总黄酮(北京岐黄医药股份有限公司)；纳米骨材料由清华大学材料科学与工程系提供，是在仿生思路和既有胶原-钙磷盐复合材料的基础上制备的一种新型纳米复合骨材料，以胶原分子为模板，通过生物自组装，钙磷盐沉积到有序排列的胶原纤维上，合成过程保持常温，具有与天然骨相似的分级结构和特性，具有均一的孔隙和孔间连接，单个晶体尺寸4-6 nm，孔径集中在50-300 µm，孔隙率为70%-80%^[2]，见表1。

实验用试剂：BOP/NBT碱性磯酸酶显色试剂盒(中国北京碧云天生物公司)；Alizarin Red染色剂(中国北京索莱宝科技有限公司)；茜素红S染液(中国北京谷歌生物科技有限公司)；Trizol RNA提取试剂(日本Takara公司)；RNeasy试剂盒(美国Qiagen公司)；Col-I、OCN、OPN抗体(美国Sigma)；RNA isoPlus(中国大连Takara宝生物工程有限公司)；Primescript RT Reagent Kit(中国大连Takara宝生物工程有限公司)；Light Cycler 480 SYBR GREEN I Master (美国Roche诊断)；Donkey Anti-Goat IgG H&L抗体(美国eBiosecince公司)；Goat Anti-Rabbit IgG H&L 抗体(美国eBiosecince公司)；α-MEM培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Sciencell公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨碎补总黄酮溶液的配制用含体积分数3%胎牛血清的α-MEM培养基，将骨碎补总黄酮配成500 g/L的溶液，4 ℃保存；用含体积分数3%胎牛血清的α-MEM 培养基，将骨碎补总黄酮溶液浓度稀释成250，100，0 mg/L，现用现配。

1.4.2 小鼠MC3T3-E1细胞与纳米骨材料共培养将纳米骨材料切成厚度均匀的薄片，铺满培养皿的底部，尽量保持骨材料的完整性。将MC3T3-E1细胞吹打均匀，制成细胞浓度为2.0×10⁹ L^-1的细胞悬液，接种于纳米骨材料上，每孔接种细胞悬液50 µL，30 min后翻转，继续接种等量细胞液，1 h后移入直径10 mm的培养皿内，加入含体积分数3%胎牛血清的培养液10 mL，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养。

按相同的方法，将小鼠MC3T3-E1细胞以2×10⁴/孔的密度接种在含纳米骨材料的24或96孔板上，待细胞达到70%汇合时，加入不同质量浓度(0，100，250 mg/L)骨碎补总黄酮的培养基培养。

1.4.3 碱性磷酸酶活性检测中药干预第1，3，5，7，9，11，14天时，胰酶消化，离心收集细胞，超声裂解细胞，吸取细胞裂解液200 μL，按碱性磷酸酶试剂盒说明书操作，依次加入缓冲液和基质液，孵育，加入显色剂，收集细胞培养基，采用紫外分光光度仪测各管吸光度值，按公式计算出细胞内碱性磷酸酶水平，实验重复测定3次。

1.4.4 ELISA法测定骨钙蛋白中药干预第1，2，3，4周，收集培养上清，按照说明加入准备好的样品、标准品、酶标试剂，37 ℃反应60 min，洗板6次，加入显色液A、B，37 ℃显色15 min，加入终止液，终止反应，检测样本中骨钙素浓度，空白调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度，测定应在加终止液后15 min以内进行；用标准物的浓度与吸光度值计算出标准曲线的直线回归方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。实验重复测定3次。

1.4.5 茜素红S染色评估钙化结节水平中药干预7，14，21 d，取各组小鼠MC3T3-E1成骨细胞，去培养基，用DPBS将细胞洗涤3次，每次5 min，以新鲜解冻的40 g/L多聚甲醛将细胞在室温下固定20 min，使用2%茜素红S溶液(pH=4.2)在室温下染色细胞10 min，同时将光照最小。染色的细胞再次用DPBS洗涤，并使用光学显微镜评估。因小鼠MC3T3-E1成骨细胞属于小鼠成骨细胞的早期细胞或者成骨前体细胞，在常规培养早期，不会出现较为明显或者肉眼可见的大块红色沉淀，故选择中药干预7，14，21 d进行实验观察。

1.4.6 Real-time PCR检测成骨相关基因表达中药干预14 d，提取MC3T3-E1细胞RNA，根据反转录试剂盒说明书操作，反转录为cDNA，采用实时定量PCR检测成骨基因Ⅰ型胶原、骨钙蛋白、骨桥蛋白的表达，设计的PCR引物序列见表2，β-Actin作为内参，待反应结束后，在PCR仪上获取Ct值，通过计算机软件得出基因的相对表达量。

1.5 主要观察指标 ①骨碎补总黄酮联合纳米骨材料干预后，MC3T3-E1细胞的增殖能力；②骨碎补总黄酮联合纳米骨材料干预后，MC3T3-E1细胞成骨分化过程中碱性磷酸酶的表达；③骨碎补总黄酮联合纳米骨材料干预后，MC3T3-E1细胞成骨分化过程中骨钙蛋白的表达；④骨碎补总黄酮联合纳米骨材料干预后，MC3T3-E1细胞成骨分化过程中钙化结节水平；⑤骨碎补总黄酮联合纳米骨材料干预后，MC3T3-E1细胞成骨分化基因Ⅰ型胶原、骨钙蛋白、骨桥蛋白的mRNA表达。

1.6 统计学分析实验数据运用SPSS 20.0软件进行统计和分析，结果用x(_)±s表示，对数据先做正态和方差齐检验，符合者用单因素方差分析比较，组间比较用LSD分析法。若不符合正态分布或方差不齐者，用非参数检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

骨碎补为水龙骨科植物槲蕨的干燥根茎，是一味常用的传统中药，中医认为骨碎补性温，味苦，归肝、肾经，具有强骨补肾、止痛续伤之功效，临床用于筋骨折伤、肾虚腰痛、跌扑闪挫、耳鸣耳聋、牙齿松动的治疗，外治白癜风、斑秃^[6]。骨碎补的主要生物活性成分是黄酮类化合物，因其潜在的药用价值而备受关注，在基础及临床研究中被广泛应用。体外实验证实，骨碎补总黄酮能促进大鼠间充质干细胞向成骨细胞增殖、分化^[7-12]。动物实验研究显示，骨碎补总黄酮能增加去卵巢大鼠股骨密度和机械强度，改善骨小梁微结构^[13]。临床研究表明，骨碎补总黄酮治疗骨质疏松性骨折^[14-18]、骨不连^[19]、股骨头坏死^[20-23]。因此，实验研究采用骨碎补总黄酮作为促进细胞增殖、分化的研究对象。

纳米骨材料骨植体表面可提供适宜的环境，促进胶原和矿物的沉积及成骨细胞的黏附，一旦细胞黏附于种植体表面，随后的骨生长便在细胞的调节下进行。纳米骨材料除了具有生物活性和优异的骨传导性能，也是一种生物可降解材料，可作为骨组织工程理想的支架材料。

在成骨化过程中，碱性磷酸酶是成骨化的特异性因子^[24]，可调节骨形态发生^[25]。碱性磷酸酶的激活在细胞外基质形成的早期阶段以高水平发生，但随着时间的推移而降低^[26]。此次实验结果表明在培养细胞到第7-9天时，100， 250 mg/L组碱性磷酸酶活性高于0 mg/L组(P < 0.05)；在第11天时，3组碱性磷酸酶活性无明显差异(P > 0.05)，说明100，250 mg/L的骨碎补总黄酮联合纳米骨材料，能够增强体外成骨细胞的碱性磷酸酶活性，主要是对MC3T3-E1细胞早期分化的影响。骨钙蛋白的生理功能是保持骨的正常矿化，调节羟基磷灰石结晶的形成和增长，是成骨细胞分化的中期敏感标志物^[27]。实验结果表明， 100，250 mg/L组骨钙蛋白质量浓度显著高于0 mg/L组 (P < 0.05)，由此可知，骨碎补总黄酮联合纳米骨材料可促进MC3T3-E1细胞的中期分化。在实验后期时，采用茜素红S染色后观察骨结节的形成和矿化，因小鼠MC3T3-E1成骨细胞属于小鼠成骨细胞的早期细胞或者成骨前体细胞，在常规培养早期不会出现较为明显或者大体可见的大块红色沉淀，故选择7，14，21 d进行实验观察。此次研究中，100，250 mg/L组之间的矿化水平无差异，但两组相比0 mg/L组相同时间点的钙化水平更高。因此，如果将骨碎补总黄酮与骨移植支架材料植入骨缺损，可以促进局部引导骨再生期间较早的钙化结节形成，改善一般骨生成过程的效率。

骨桥蛋白是存在于矿化和活性沉积区、一种含有Arg-Gly-Asp(RGD)结构的酸性糖蛋白，它与诱导成骨细胞成熟表型表达和矿化骨基质形成的活性蛋白密切相关。在成矿阶段，骨连接素、纤连蛋白与骨桥蛋白的表达高度相关^[28]。Ⅰ型胶原是钙盐沉积和细胞附着的支架，可促进细胞附着并刺激细胞分化^[29]。实验采用不同质量浓度的骨碎补总黄酮培养基诱导MC3T3-E1细胞14 d，随着骨碎补总黄酮质量浓度的增加，MC3T3-E1细胞培养物中的骨钙蛋白、Ⅰ型胶原和骨桥蛋白mRNA表达水平逐渐增加，100，250 mg/L组所有成骨细胞标志物mRNA均显著高于0 mg/L组(P? < 0.05)，说明在矿化期，骨碎补总黄酮联合纳米骨材料可促进成骨细胞相关基因表达，更有利于新骨组织的矿化，以利于新骨的形成。

此次研究结果表明，骨碎补总黄酮联合纳米骨材料能够促进MC3T3-E1细胞向成骨细胞转化，主要作用机制是通过提高碱性磷酸酶的活性和骨钙蛋白质量浓度，升高MC3T3-E1细胞培养物中Ⅰ型胶原、骨钙蛋白和骨桥蛋白mRNA的表达水平。100，250 mg/L组成骨能力无差异，但显著高于0 mg/L组的成骨能力，结果表明骨碎补总黄酮可有效促进MC3T3-E1细胞的分化、矿化。骨碎补总黄酮联合纳米骨材料培养的MC3T3-E1细胞，具备良好的功能状态及生物学特性，具备成骨效应。但实验在给药方面仍有不足，后期研究将采用骨碎补总黄酮药物缓释体系缓慢释放药物，以减少药物突释对细胞的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

骨碎补总黄酮联合纳米骨材料诱导MC3T3-E1细胞的成骨分化及其机制

Osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells induced by osteopractic total flavone and nano-hydroxyapatite/collagen composite and the underlying mechanism

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[1]	耿瑶, 尹志良, 李兴平, 肖东琴, 侯伟光. hsa-miRNA-223-3p调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1008-1013.
[2]	刘波, 陈祥和, 杨康, 余慧琳, 陆鹏程. DNA甲基化在运动干预骨质疏松中的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 791-797.
[3]	叶海民, 丁凌华, 孔维豪, 黄祖泰, 熊龙. 多级微管结构骨支架载体促进成骨成血管作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 621-625.
[4]	周武, 王彬娉, 王雅雯, 程亚楠, 黄谢山. 转化生长因子β和骨形成蛋白2联合诱导小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞的增殖与分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3630-3635.
[5]	刘珂珂, 段昕, 马向瑞, 张云涛. 以电纺丝膜为载体观察桂皮醛对高糖环境下成骨细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3500-3504.
[6]	李震, 黄永辉, 孙继芾, 孙海涛. 黏着斑激酶诱导小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 165-171.
[7]	郭志斌, 吴春芳, 刘子洪, 张钰英, 迟博婧, 王宝, 马超, 张国彬, 田发明. 辛伐他汀可刺激骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2963-2968.
[8]	汪鎏, 宋东哲, 黄定明. 骨形态发生蛋白9调控干细胞分化与骨再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 3064-3070.
[9]	陈亮, 孟姝, 程国平, 丁一. 鱼鳞胶原膜对大鼠骨髓间充质干细胞黏附增殖及成骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2494-2499.
[10]	刘焱, 高翔, 赵晓霞, 陈青宇, 高俊武. 人牙周膜干细胞条件培养液对炎症组织来源牙周膜干细胞增殖及成骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2005-2010.
[11]	孟茂花, 李英, 陈新, 成璐, 董强. 釉基质衍生物诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的效应及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2108-2113.
[12]	陈俊毅, 王宁, 陈西淼, 朱伦井, 段江涛, 张贤平, 贝朝涌. 脱钙骨基质体外诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(1): 26-31.
[13]	赵春涛, 卿明松, 余浪波, 彭笳宸. 运动学对线和机械力学对线指导全膝关节置换效果的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(9): 1435-1442.
[14]	涂鹏程, 郭杨, 马勇, 潘娅岚, 郑苏阳, 王礼宁, 吴承杰, 过俊杰. 威灵仙提取物可促进体外牵张应力环境下软骨细胞表型的维持[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1182-1187.
[15]	张聪, 赵岩, 杜小宇, 杜欣瑞, 庞廷娟, 付怡凝, 张浩, 张步洲, 李筱贺, 王利东. 青少年特发性脊柱侧凸腰主弯患者腰椎-骨盆的生物力学分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1155-1161.