微小RNA-10b调控乳腺癌MCF-7细胞中乳腺癌干细胞标记物乙醛脱氢酶1 mRNA和蛋白的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1622

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
微小RNAs：是广泛分布存在的一类小分子非编码RNA，长度为18-25个核苷酸，由DNA转录产生，不翻译成蛋白质，能够通过碱基互补配对的方式与靶基因的3’-UTR部分或完全互补，并剪切靶基因的转录产物或抑制转录产物的翻译，通常在转录后调控靶向的功能蛋白，在细胞的生长、发育、凋亡及代谢等重要生命过程中起着调控基因表达的重要作用，同时也在恶性肿瘤的发生、发展、侵袭以及转移等过程扮演着非常重要的角色。
乳腺癌干细胞：是一类存在于乳腺癌组织中具有自我更新能力和产生异质性肿瘤细胞的细胞亚群，研究发现200个左右的乳腺癌干细胞就可以在小鼠移植瘤模型中形成新的肿瘤，且乳腺癌干细胞对常规的化疗药物具有耐药性，具有很强的迁移和侵袭能力，与乳腺癌的起源、转移和复发等有着极为密切的关系。

摘要
背景：miR-10b能够调控乳腺癌干细胞的相关特性，乙醛脱氢酶1是最重要的乳腺癌干细胞标记物之一，二者在乳腺癌细胞中的相互作用尚需进一步研究。
目的：探讨miR-10b对乳腺癌MCF-7细胞中乳腺癌干细胞标记物乙醛脱氢酶1 mRNA和蛋白表达的影响。
方法：常规培养乳腺癌MCF-7细胞株，分别将miR-10b模拟物或其阴性对照转染进入乳腺癌MCF-7细胞；转染48 h，通过实时荧光定量PCR实验和Western blot实验检测乙醛脱氢酶1 mRNA和蛋白的表达。
结果与结论：①将miR-10b模拟物转染进入MCF-7细胞之后，miR-10b在MCF-7细胞株中的表达显著高于对照组(P=0.003 47)；②miR-10b过表达之后显著上调了MCF-7细胞株中乙醛脱氢酶1 mRNA和蛋白的表达(P=0.009 54和P=0.003 11)；③结果表明，上调miR-10b表达能够诱导乙醛脱氢酶1阳性乳腺癌干细胞的产生，从而为miR-10b调控乳腺癌细胞侵袭、转移提供新的研究依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2008-899X(韩明利)

关键词: 乳腺癌, miR-10b, 乳腺癌细胞, 乳腺癌干细胞, 乙醛脱氢酶1, 干细胞标记物

Abstract:

BACKGROUND: MicroR-10b can regulate the characteristics of breast cancer stem cells, and acetaldehyde dehydrogenase 1 (ALDH1) is one of the most important markers of breast cancer stem cells. The interaction between them in breast cancer cells needs further explorations.
OBJECTIVE: To investigate whether over-expression of microRNA-10b affects ALDH1 mRNA and protein levels in human breast cancer MCF-7 cells.
METHODS: hsa-miR-10b mimics or its negative control was transfected into breast cancer MCF-7 cell line. At 48 hours after transfection, the mRNA and protein expression of ALDH1 in the cells was detected using real-time RT-PCR and western blot assays, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Over-expression of microR-10b was found in the MCF-7 cell line transfected with hsa-miR-10b mimics, which was significantly higher than that in the control group (P=0.003 47). Both of ALDH1 mRNA and protein levels were up-regulated in the MCF-7 cell line overexpressing microR-10b, as compared with the control group (P=0.009 54 and P=0.003 11, respectively). To conclude, over-expression of microR-10b induces the ALDH1 mRNA and protein expression in the breast cancer MCF-7 cell line, providing new evidence that microR-10b regulates the invasion and metastasis of breast cancer cells.

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Key words: Breast Neoplasms, Neoplastic Stem Cells, MicroRNAs, Aldehyde Dehydrogenase, Tissue Engineering

中图分类号:

韩明利，吕鹏威，钱学珂，杨雪，杨云卿，谷元廷. 微小RNA-10b调控乳腺癌MCF-7细胞中乳腺癌干细胞标记物乙醛脱氢酶1 mRNA和蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(9): 1349-1353.

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图/表（结果） 3

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外对照实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年1月至2018年4月在郑州大学第一附属医院重点实验室完成。

1.3 材料 人乳腺癌MCF-7细胞(美国典型培养物保藏中心)；胎牛血清(Gibico公司，美国)；DMEM培养基(Gibico公司，美国)；青链二抗(Invitrogen公司，美国)；Opti-MEM^®Ⅰ培养基(Invitrogen公司，美国)；Lipofectamine^TM 3000 (Invitrogen公司，美国)；TRIzol (Invitrogen公司，美国)；RNAimax转染试剂盒(Invitrogen公司，美国)；mirVana miRNA Isolation Kit试剂盒(Applied Biosystems 公司，美国)；One Step PrimeScript^® miRNA cDNA Synthesis Kit试剂盒(宝生物公司，大连，中国)；SYBR^® PrimeScript^® miRNA RT-PCR Kit试剂盒(宝生物公司，大连，中国)；PrimeScript^® RT reagent Kit试剂盒(宝生物公司，大连，中国)；SYBR^® Premix Ex Taq^TMⅡ试剂盒 (宝生物公司，大连，中国)；Western blot 试剂盒(四季青生物工程材料有限公司，杭州，中国)；乙醛脱氢酶1单克隆抗体(货号：BA3672，博士德生物工程有限公司，武汉，中国)；β-actin抗体(货号：BA2305，稀释比为1∶1 000，博士德生物工程有限公司，武汉，中国)；HRP标记羊抗兔IgG二抗(货号：ZB-2306，中杉金桥生物技术有限公司，北京，中国)。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 乳腺癌MCF-7细胞用含有体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素以及100 g/L链霉素(二抗)的DMEM培养基培养，放置于37 ℃、体积分数为5%CO₂、95%湿度培养箱中；细胞贴壁生长后用0.25%胰酶消化传代，每2 d或3 d传代1次。

1.4.2 细胞转染与实验分组 人miR-10b模拟物(hsa-miR-10b mimics)及阴性对照(hsa-miR-10b control)由Ambion公司(Foster City，CA，美国)设计并合成。根据RNAimax转染试剂盒说明书，细胞转染实验具体步骤如下：第3代贴壁细胞用0.25%胰酶消化，制备单细胞悬液，使用PBS调整细胞浓度为5×10⁸ L^-1，接种于6孔板；先用100 μL Opti-MEM^®Ⅰ培养基稀释50 pmol模拟物(mimics)，充分混匀，在室温下孵育5 min；同时用100 μL Opti-MEM^® Ⅰ培养基稀释2 μL lipofectamine^TM 3000，充分混匀，在室温下孵育5 min；然后，再将上述模拟物的稀释液和lipofectamine^TM 3000的稀释液充分混匀，在室温下孵育30 min；最后，将上述hsa-miR-10b mimics- lipofectamine^TM 3000混合液接种于6孔板，充分混匀，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂、95%湿度条件下培养48 h，进行下一步检测。

实验共分为3组：①空白组：未进行转染；②对照组：转染hsa-miR-10b control；③实验组：转染 hsa-miR-10b mimics。

1.4.3 实时荧光定量PCR检测miR-10b表达量 使用Primer 5.0软件设计PCR引物，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。Hsa-miR-10b实时荧光定量PCR引物为Forward：5'-GTG CAG GGT CCG AGG T-3'；Reverse：5'-TAC CCT GTA GAA CCG AAT TTG T-3'。内参Hsa-U6实时荧光定量PCR引物为Forward：5'-TGC GGG TGC TCG CTT CGG CAG C-3'；Reverse：5'-CAG TGC AGG GTC CGA GGT AT-3'。

严格按照试剂盒说明书进行实验操作，具体步骤如下：①用mirVana miRNA Isolation Kit提取各组细胞的总miRNAs；②使用One Step PrimeScript^® miRNA cDNA Synthesis Kit进行反转录反应，每50 μL反应体系使用1 μg miRNAs；③利用MiniOpticon^TM Two-Color Real-Time PCR Detection System，使用SYBR^® PrimeScript^® miRNA RT-PCR Kit进行实时荧光定量PCR反应；④实时荧光定量PCR的反应体系量为20 μL；反应参数如下：95 ℃预变性5 min、95 ℃变性10 s、59.6 ℃退火20 s、72 ℃延伸30 s (共39个循环)；⑤反应结束后得到CT值，利用Bio-Rad CFX Manager Software使用2^-ΔΔCT法统计分析miR-10b的相对表达(U6为内参)。

1.4.4 实时荧光定量PCR检测乙醛脱氢酶1 mRNA表达量 Hsa-ALDH1实时荧光定量PCR引物为Forward：5'-CCC TGC TAC CAG AGA CCA AGA C-3'；Reverse 5'-GCA GGT TCC TTG TCT CAT CAG C-3'。内参β-actin的引物为Forward：5'-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3'；Reverse 5'-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG-3'。

严格按照试剂盒说明书进行实验操作，具体步骤如下：①首先用TRIzol分别提取各组细胞的总RNA；②然后利用PrimeScript^® RT reagent Kit进行反转录，每50 μL反应体系含2 μg总RNA；反转录条件：37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s；③接下来利用SYBR^® Premix Ex Taq^TM II Kit进行实时荧光定量PCR反应，反应体系量为20 μL；反应参数如下：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸30 s (共39个循环)；④使用2^-ΔΔCT法统计分析乙醛脱氢酶1 mRNA的相对表达(以β-actin作为内参)。

1.4.5 Western blot检测乙醛脱氢酶1蛋白表达量 消化各组贴壁细胞，收集到EP管中，加入RIPA蛋白裂解液30 min，然后12 000 r/min、4 ℃离心30 min，留上清液，-20 ℃保存；配胶，蛋白上样量为60 μg/孔，80 V电压使蛋白积聚，100 V电压分离蛋白，转膜，5%脱脂奶粉封闭过夜；第2天，先孵育兔抗人乙醛脱氢酶1单克隆抗体(TBST稀释，稀释比为1∶200)和β-actin抗体(TBST稀释，稀释比为1∶1 000)，4 ℃过夜；第3天，孵育HRP标记羊抗兔IgG二抗(TBST稀释，稀释比为1∶2 500)，室温90 min；洗膜，滴上1∶1混匀的ECL化学发光显示剂A、B液，反应1 min，即可上机显像拍照；利用ImageJ电脑软件扫描图像的灰度，计算出乙醛脱氢酶1与β-actin灰度的比值作为乙醛脱氢酶1蛋白的相对表达量。

1.5 主要观察指标 miR-10b mRNA、乙醛脱氢酶1 mRNA及乙醛脱氢酶1蛋白的表达变化。

1.6 统计学分析 利用SPSS 17.0进行统计分析，数据以x(_)±s表示，组间均数比较使用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

miRNAs是一类高度保守的短链非编码RNA，其调控层次主要在基因表达的转录后水平，在包括哺乳动物在内的多种生物组织中广泛存在，其相关的生物发生、作用机制具有重要意义^[1]。研究表明，多种miRNAs参与了乳腺癌的发生发展过程，包括细胞增殖、血管生成以及侵袭和转移过程等^[19-21]。乳腺癌的转移过程通常与原癌性miRNAs的上调或抑癌性miRNAs的下调有关^[22-23]。近几年，课题组既往的实验研究也已经对miRNAs(miR-21、miR-760、miR-30d等)在乳腺癌干细胞侵袭和转移性质中的作用及信号机制做了一定的探讨^[24-29]。作者发现，部分miRNAs可以通过促进乳腺癌干细胞“干性”及其相关上皮间质转化来调控乳腺癌的侵袭与转移，并且有miRNAs在乳腺癌干细胞中高表达，能调控乳腺癌干细胞自身的上皮间质转化过程^[24-29]。

miR-10b是在包括乳腺癌在内的多种实体肿瘤均高表达的miRNAs之一^[8-12]。研究表明，miR-10b在乳腺癌细胞及组织中均相对高表达^[7-8]，而且在乳腺癌干细胞中有更高的表达^[13]，作者认为，miR-10b可能调控乳腺癌细胞、乳腺癌组织以及乳腺癌干细胞“干性”相关基因和特性。目前，乙醛脱氢酶1已经被公认为是乳腺癌干细胞最主要的标记物之一^[16-18]，因为其特异性表达于不成熟的、具有乳腺癌干细胞“干性”的、具有多向分化能力及无限增殖分化能力的乳腺癌细胞。相互印证的实验证据表明，miR-10b表达是乳腺癌恶性行为中的一个重要事件，但其变化的临床意义目前仍不明确，其上调或下调对乳腺癌干细胞有何影响？靶向乳腺癌干细胞的分子机制又是什么？这些都是有待回答的问题。该研究仅通过上调乳腺癌MCF-7细胞株中miR-10b的相对表达，证实了miR-10b对乳腺癌干细胞标记物乙醛脱氢酶1 mRNA和蛋白表达的影响及其调控作用。

首先，将hsa-miR-10b mimics或hsa-miR-10b control分别转染进入乳腺癌MCF-7细胞中，分别建立过表达miR-10b的MCF-7细胞及对照MCF-7细胞；然后，通过实时荧光定量PCR实验检测了这两组细胞中乳腺癌干细胞标志物乙醛脱氢酶1 mRNA的表达，结果发现miR-10b过表达显著上调了乙醛脱氢酶1 mRNA的表达；最后，又通过Western blot实验检测了上述各组细胞中乙醛脱氢酶1蛋白的表达，结果发现miR-10b过表达亦显著上调了乙醛脱氢酶1蛋白的表达。这就证明，miR-10b过表达显著上调了乙醛脱氢酶1在mRNA和蛋白水平的相对表达量，这和miR-10b在乳腺癌细胞及组织中对乙醛脱氢酶1的调控结果是一致的^[14]。值得一提的是，无论在mRNA水平，还是在蛋白水平，乙醛脱氢酶1表达量上调的倍数都是相近的(3.4倍vs.4.2倍)；而miR-10b表达量的上调倍数(>7倍)相对于乙醛脱氢酶1表达的上调倍数(约4倍)显著增加，并不是等比例上调。这就提示，除了miR-10b的作用之外，肯定还有其他基因和相关信号通路调控乙醛脱氢酶1 mRNA及蛋白的相对表达，需要进一步的实验研究去证实。

综上所述，miR-10b过表达显著上调了乳腺癌MCF-7细胞中乳腺癌干细胞标记物乙醛脱氢酶1 mRNA和蛋白的表达，证实miR-10b和乙醛脱氢酶1之间存在着相互的作用和关联。该研究表明，在miR-10b调控乳腺癌细胞的相关分子机制中，包括了其对乳腺癌干细胞标志物乙醛脱氢酶1表达的作用和调控通路；miR-10b的相关信号通路可能在一定范围内通过调控乳腺癌干细胞标记物乙醛脱氢酶1的表达来诱导乳腺癌干细胞表型的变化，从而肯定了miR-10b在调控肿瘤恶性特质中的重要作用及地位，也为进一步明确乳腺癌干细胞的相关调控机制提供了新的理论依据和实验依据，但复杂的相关分子机制仍需大量的实验研究进一步证实。

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