基底样型乳腺癌肿瘤干/祖细胞的长时程无血清培养

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.33.011

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (33): 5313-5319.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.33.011

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基底样型乳腺癌肿瘤干/祖细胞的长时程无血清培养

董华英¹，王伟¹，陈元文²，包俊杰²，陈鑫²，吴诚义²

¹海南省人民医院乳腺外科，海南省海口市 570311；²重庆医科大学附属第一医院内分泌乳腺外科，重庆市 400016

修回日期:2017-09-13 出版日期:2017-11-28 发布日期:2017-12-01
通讯作者: 吴诚义，教授，博士生导师，重庆医科大学附属第一医院内分泌乳腺外科，重庆市 400016
作者简介:董华英，男，1977年生，河北省邢台市人，汉族，2011年重庆医科大学毕业，博士，副主任医师，主要从事乳腺疾病的基础与临床研究。
基金资助:
海南省卫生计生科教项目(02A2150014P1)

Long-term serum-free culture of cancer stem/progenitor cells from basal-like breast carcinoma

Dong Hua-ying¹, Wang Wei¹, Chen Yuan-wen², Bao Jun-jie², Chen Xin², Wu Cheng-yi²

¹Department of Breast Surgery, Hainan General Hospital, Haikou 570311, Hainan Province, China; ²Department of Endocrine and Breast Surgery, the First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China

Revised:2017-09-13 Online:2017-11-28 Published:2017-12-01
Contact: Wu Cheng-yi, Professor, Doctoral supervisor, Department of Endocrine and Breast Surgery, the First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
About author:Dong Hua-ying, M.D., Associate chief physician, Department of Breast Surgery, Hainan General Hospital, Haikou 570311, Hainan Province, China
Supported by:
the Health Education and Family Planning Program of Hainan Province, No. 02A2150014P1

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
乳腺癌干细胞：是第一个被发现的实体肿瘤干细胞，其引发了肿瘤干细胞的研究热潮。随后，人们发现脑部肿瘤、胃癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、黑色素瘤和多发骨髓瘤等多种肿瘤中均存在肿瘤干细胞。目前乳腺癌最常用的标记物为CD44⁺CD24^-和ALDH1⁺，但乳腺癌是一组高度异质性的疾病，各亚型乳腺癌可能起源于不同类型的肿瘤干细胞，亟待发现新的标记物筛选各种亚型乳腺癌干细胞进行分类研究。
无血清培养基：是指不需要添加血清即可维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基，一般是由基础培养基和替代血清的补充因子组成。借助神经干细胞的培养方法，无血清培养基被用来培养乳腺癌干细胞。

摘要
背景：乳腺癌干细胞是乳腺癌细胞中的亚群，具有类似干细胞的自我更新和多系分化潜能，具有放化疗和缺氧抵抗性、高致瘤性和高侵袭转移性等特征，在乳腺癌的发生发展以及复发转移中发挥重要作用。乳腺癌干细胞学说在一定程度上阐明了乳腺癌的发病机制，在治疗方案选择、新的治疗靶点的发现和乳腺癌预后的判断等方面有很大的应用价值。
目的：从基底样型乳腺癌组织中分离培养肿瘤干/祖细胞，并通过无血清悬浮技术长时程培养，研究其自我更新能力、分化潜能和细胞表型等生物学特性。
方法：20例基底样型乳腺癌患者，其中10例患者未经过任何治疗，另外10例患者术前均行新辅助化疗(≥4周期)，术前于肿瘤边缘切取1 cm³新鲜肿瘤组织，立即送实验室，经机械分离后获取肿瘤细胞。应用无血清悬浮培养技术富集乳腺癌干/祖细胞微球体后，通过单克隆实验检测乳腺癌干/祖细胞微球体细胞的克隆形成和自我更新能力，在添加血清的培养液中诱导乳腺癌干/祖细胞微球体细胞分化，观察其分化能力。通过流式细胞术检测CD44⁺/CD24^-和ALDH1⁺表型细胞的比例。
结果与结论：①在含生长因子的无血清培养基中，未行新辅助化疗的基底样型乳腺癌细胞均可生成乳腺癌干/祖细胞微球体，而大部分新辅助化疗后的乳腺癌组织中可直接分离获得微球体样的细胞团；②乳腺癌干/祖细胞微球体细胞可连续传代形成新生的乳腺癌干/祖细胞微球体，随着培养传代次数的增加，贴壁细胞逐渐增多，新产生的乳腺癌干/祖细胞微球体数量逐渐减少，球体直径变小，且乳腺癌干/祖细胞微球体也更加容易贴壁。乳腺癌干/祖细胞微球体细胞在添加血清的培养基中培养可贴壁分化；③乳腺癌干/祖细胞微球体中富集了CD44⁺/CD24^-和ALDH1⁺表型细胞，诱导分化后两种表型细胞的含量大幅下降或缺失；④大部分化疗后的乳腺癌干/祖细胞微球体细胞具有更强的自我更新和分化潜能，含有更高比例的CD44⁺/CD24^-和ALDH1⁺表型细胞；⑤结果表明，基底样型乳腺癌组织中存在具有自我更新和多向分化等干/祖细胞样特性的肿瘤细胞，新辅助化疗可富集乳腺癌干/祖细胞形成微球体样细胞团。不同标本来源的乳腺癌干/祖细胞生物学行为存在一定差异，其可随环境因素的作用而变化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID:0000-0002-5408-5826(董华英)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 乳腺癌, 分子分型, 新辅助化疗, 肿瘤干细胞, 细胞培养

Abstract:

BACKGROUND: Breast cancer stem cells, a subgroup of breast cancer cells, have self-renewal and multilineage differentiation potential and are characterized as resistance to chemotherapy, radiotherapy and hypoxia, and high propensity for invasiveness and metastasis, which play an important role in the recurrence and metastasis of breast cancer. The breast cancer stem cell theory can elucidate the pathogenesis of breast cancer to a certain extent, and has great values in the selection of treatment options, the discovery of new therapeutic targets and the prognosis of breast cancer.
OBJECTIVE: To isolate the breast cancer stem/progenitor cells from basal-like breast carcinoma and study their self-renewal ability, phenotype and differentiation potential over long-term serum-free suspension culture in vitro.
METHODS: Twenty patients with basal-like breast cancer, including 10 patients without any treatment and 10 with neoadjuvant chemotherapy (≥ 4 cycles), were enrolled. A 1 cm³ fresh tumor tissue sample from each patient was taken and immediately sent to the laboratory to mechanically isolate tumor cells. Then, the stem/progenitor cells of basal-like breast carcinoma were enriched in ultra low attachment plates in serum free media as nonadherent mammospheres. Serial sphere formation assay was performed to determine colony formation and self-renewal ability of mammosphere-derived cells. Differentiation was induced by culturing mammosphere-derived cells in DMEM-F12 supplemented with serum but without growth factors. The proportion of CD44⁺/CD24^-and ALDH1⁺ cell population was evaluated by flow cytometry.
RESULTS AND CONCLUSION: The mammospheres formed after inoculation of primary basal-like breast cancer cells isolated from the tumor tissues of breast cancer patients who did not receive neoadjuvant chemotherapy cultured in the serum-free medium with growth factors, while the mammospheres could be directly isolated from the tumor specimens of patients with neoadjuvant chemotherapy. The mammosphere-derived cells could be passaged continuously to form new mammospheres. With the increase of subculture frequency, the number of adherent cells was increased, but the number of new mammospheres decreased, and the spheres became smaller and easier to adhere. The mammosphere-derived cells could be induced to differentiate in the medium supplemented with serum. The CD44⁺/CD24^- and ALDH1⁺ cells were enriched in mammosphere-derived cells, and these two phenotypic cells were decreased sharply in number or absent after cell differentiation. Most of the mammosphere-derived cells after chemotherapy had stronger potentials of self-renewal and differentiation, with higher proportion of CD44⁺/CD24^- and ALDH1⁺ cells. In summary, cancer cells with self-renewal and multilineage differentiation potentials exist in the basal-like breast cancer tissues. Neoadjuvant chemotherapy can enrich breast cancer stem/progenitor cells to form spheroid-like cell clusters. Some differences in biological behaviors exist between the stem/progenitor cells from different breast cancer samples, which can vary with environmental factors.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Breast Neoplasms, Neoplastic Stem Cells, Tumor Cells, Cultured, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

董华英，王伟，陈元文，包俊杰，陈鑫，吴诚义. 基底样型乳腺癌肿瘤干/祖细胞的长时程无血清培养[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(33): 5313-5319.

Dong Hua-ying, Wang Wei, Chen Yuan-wen, Bao Jun-jie, Chen Xin, Wu Cheng-yi. Long-term serum-free culture of cancer stem/progenitor cells from basal-like breast carcinoma[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(33): 5313-5319.

图/表（结果） 1

2.1 微球体的分离培养及形态 机械分离后乳腺癌组织呈糊状(图1A)。10例化疗后的乳腺癌组织中，2例仅分离到少许坏死细胞和组织碎片(图1B)，将其在培养基中连续培养，每3 d换液并观察细胞形态，10 d后未见微球体形成，其余8例标本可分离到微球体样的微球体，相对于培养获取的微球体其体积较小，折光性较弱，微球体周围坏死细胞及组织碎片很少(图1C)，培养24 h后疏松的细胞从微球体表面脱落，剩余的微球体细胞连接紧密，其体积未见明显增大，折光性相对增强(图1D)，3 d后微球体折光性再次减弱，微球体表面可见坏死的细胞(图1E)，继续培养至7 d左右，微球体体积不再增大。

10例未经过化疗的标本只能分离到单细胞，经过无血清悬浮可获得微球体。培养48-72 h后可观察到细胞分裂现象，形成由数个到十几个细胞构成的结构疏松的新生微球体，经过7-10 d的培养，微球体体积不再增大，形成体积较大和折光性较强的成熟微球体，其细胞数增至数十至数百个，细胞之间连接紧密，界限难以区分(图1F)。所有的微球体需要及时胰酶消化传代，如微球体长期在无血清培养基中培养超过2周，球体中心的细胞开始凋亡，其折光性减弱，不断有新生细胞覆盖在微球体表面，同时伴有新的微球体形成，但其体积逐渐减小，数量也逐渐减少(图1G)，45-60 d后基本看不到新生的微球体，可见大量单细胞悬浮于培养液中，出现少量的贴壁细胞。

2.2 乳腺癌干/祖细胞微球体细胞具有自我更新和增殖潜能，可连续传代形成新生微球体 收集培养7 d左右的T₀代微球体并制成单细胞悬液，乳腺癌干/祖细胞微球体细胞继续接种于无血清培养液中，24 h后可见T₁代微球体形成，随着时间推移球体逐渐增大，5 d左右形成新的成熟微球体，7 d后微球体不再增大，表面开始出现老化的细胞，折光性开始减弱(图2A)。T₂和T₃代细胞克隆形成率相似，从T₄代开始其逐渐降低，T₂和T₃代微球体形态更接近球形，生长旺盛，T₄代之后不规则微球体逐渐增多。其中2例新辅助化疗后的标本细胞传至T₅代后无法继续传代，其余6例标本均可传代至T₁₅代。T₄代之后，传代过程中贴壁分化的细胞逐渐增多，细胞丢失增加，微球体数量减少，球体体积变小，细胞之间连接较前疏松，且更加容易贴壁分化(图2B)。未经新辅助化疗的10例标本，在无血清培养基中均可形成微球体，传代次数为5-10代不等。传代过程中的特征与新辅助化疗后的标本类似，表现为乳腺癌干/祖细胞微球体细胞克隆能力的下降和细胞丢失率的增加(图3)。

2.3 乳腺癌干/祖细胞微球体细胞经血清诱导后贴壁分化 将乳腺癌干/祖细胞微球体细胞置于添加血清的培养基中培养，6-12 h后镜下可见到细胞开始贴壁，细胞形态由圆形变成梭形(图4A)，3-5 d后绝大多数细胞贴壁生长，贴壁细胞相互融合，镜下偶见悬浮细胞(图4B)。相对于未接受化疗的标本，来源于新辅助化疗后残存癌组织的乳腺癌干/祖细胞微球体细胞贴壁时间短，生长速度快。在所有的标本中无血清培养后微球体生成早、生长速度快的，其细胞分化和生长速度也较快。

2.4 乳腺癌干/祖细胞微球体细胞中存在CD44⁺/CD24^-和ALDH1⁺表型细胞 流式细胞术检测发现，乳腺癌干/祖细胞微球体细胞中均含有CD44⁺/CD24^-和ALDH1⁺表型细胞，传代次数超过5代的化疗后标本中两种表型细胞比例较未化疗标本增高(图5)。在传代未超过5次的2例化疗后标本与未化疗标本中两种表型细胞比例接近。乳腺癌干/祖细胞微球体细胞中含有较高比例的CD44⁺/CD24^-和ALDH1⁺表型细胞，经含血清培养基诱导分化后两种表型细胞含量大幅下降或缺失(图6，7)。

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引言

材料方法

1.1 设计 乳腺干/祖细胞的分离培养。

1.2 时间及地点 2016年1至12月在眼科学重庆市市级重点实验室完成。

1.3 对象 20例基底样型乳腺癌患者，均为女性；年龄32-60岁，平均年龄43.8岁。其中10例患者未经过任何治疗，另外10例患者术前均行新辅助化疗(≥ 4周期)，为了获取足够的细胞，选取化疗后肿瘤≥ 3 cm×3 cm的患者。所有标本的收集经患者本人及家属同意，均在术中取材，取材后迅速放置于DMEM-F12培养基中，于30 min内送达实验室，立即分离细胞进行培养。研究经重庆医科大学伦理部门审核批准。

主要试剂和仪器：DMEM-F12、B27添加剂、胰酶和胎牛血清(Gibco)；D-Hank’s液(HyClone)；碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子(PeproTech)；添加生长因子的DMEM-F12培养基(1∶50 B27，20 μg/L表皮生长因子，20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子)；ALDEFLUOR®干细胞鉴定试剂盒(加拿大StemCell公司)；倒置显微镜(OLYMPUS)；净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；高温灭菌CO₂细胞培养箱(Thermo Forma 371)。

1.4 方法

1.4.1 基底样型乳腺癌干/祖细胞的培养 剪刀修剪标本，去除脂肪组织和血凝块，D-Hank’s液冲洗后将其置于预先放置在培养皿内的200目不锈钢细胞筛网上，无菌手术镊固定标本，用眼科手术剪反复剪切标本，将其分割为< 1 mm³的组织块，肉眼呈糊状，用D-Hank’s液反复冲洗细胞筛上的组织，使细胞充分过滤，细胞培养管收集细胞后，以250×g离心5 min，去除上清液，加入红细胞裂解液，离心收集细胞，用添加生长因子的DMEM-F12培养基重悬细胞，接种入25 cm²的细胞培养瓶中，显微镜观察细胞形态，置入37 ℃，体积分数为5%CO₂恒温培养箱中孵育(首次分离培养过程中避免使用酶类消化)。每3 d换液1次，半量和全量换液交替进行。一般7 d左右传代1次(观察乳腺癌干/祖细胞微球体长程培养形态变化情况除外)，传代时离心收集细胞，D-Hank’s液冲洗2遍，加入0.05%胰酶消化细胞10 min，使用胶头滴管不断吹打细胞至球体消失，再次离心收集细胞，调整细胞浓度后置入细胞培养箱中培养。

1.4.2 乳腺癌干/祖细胞微球体细胞(mammosphere- derived cells，MSDCs)的无血清培养和单克隆形成实验 参照Ponti等^[12]的实验方法，收集T₀代微球体(化疗后的标本分离得到的微球体，为了方便表述也标记为T₀)，培养7 d，观察其形态变化，制作成单细胞悬液，进行锥虫蓝染色并计数，以每孔100个细胞接种于24孔培养板中，添加含有生长因子的DMEM-F12培养基，在培养箱内培养7 d，显微镜下计数每孔中T₁代微球体(经培养后获得微球体为第1代微球体)和悬浮单细胞。同法连续进行传代，动态观察T_n代微球体的形成情况。因为只有干细胞才能形成微球体，因此一个微球体代表一个干细胞起源的克隆，细胞球形成率和细胞丢失率计算公式如下：微球体形成率(%)=微球体数/接种细胞数×100%，细胞丢失率(%)=(接种细胞数-微球体数-悬浮单细胞数)/接种细胞数×100%。

1.4.3 乳腺癌干/祖细胞微球体细胞的诱导分化 收集微球体，制作成单细胞悬液，用添加体积分数为5%胎牛血清的DMEM-F12培养液重悬乳腺癌干/祖细胞微球体细胞，按照每孔1×10⁵个细胞接种于预先放置了多聚赖氨酸预包被过的盖玻片的6孔板中培养，3-5 d更换培养基，于显微镜下连续动态观察细胞生长情况。

1.4.4 CD44⁺/CD24^-和ALDH1⁺表型细胞的检测

CD44⁺/ CD24^-表型细胞检测步骤如下：收集T₂代微球体，酶解制作成单细胞悬液。每组细胞设置测定管和同型对照管，细胞数为每管1×10⁵个。测定管中以2%的体积分数加入CD44-FITC和CD24-PE抗体(工作液1︰20稀释)，同型对照管加入同体积的对照抗体，混匀后室温下避光孵育20 min。PBS冲洗2次，多聚甲醛溶液固定细胞，流式细胞仪检测CD44⁺/CD24^-细胞所占的比例。

ALDH1⁺表型细胞检测其步骤如下：收集T₂代微球体，酶解制备单细胞悬液，离心收集细胞去上清液后用反应缓冲液重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁸ L^-1 -1×10⁹ L^-1；测试管加入1 mL细胞悬液，对照管加入5 µL的DEAB试剂，然后在测试管内加入5 µL活化的ALDEFLUOR试剂，混合均匀并立即取出0.5 mL混合物迅速转入DEAB对照管中，将检测样本和对照样本在37 ℃下孵育30 min；孵育后，以250×g将所有试管离心5 min去除上清液，将细胞团重悬于0.5 mL的ALDEFLUOR检测缓冲液中，立即流式细胞仪检测或4 ℃下保存于24 h之内上机检测。

1.5 主要观察指标 ①无血清培养过程中主要观察微球体的形成时间、数量、直径大小、折光性变化以及其是否贴壁生长；②添加血清后主要观察乳腺癌干/祖细胞微球体细胞是否贴壁生长、细胞形态变化等。

1.6 统计学分析 应用SPSS 11.0统计学软件进行统计学分析，细胞丢失率和微球体形成率采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

基底样乳腺癌是近年来从乳腺癌基因表达谱研究角度分类的一种乳腺癌亚型，其起源于乳腺导管上皮外层肌上皮细胞(即基底细胞)，该亚型乳腺癌发病年龄较其他亚型低，易发生远处转移，是乳腺癌中预后最差的一种亚型^[13-15]。无血清悬浮培养技术是体外富集干细胞的常用方法，最早用于神经干细胞的培养。Ponti等^[12]借用该无血清悬浮培养技术，用添加生长因子的无血清培养基培养乳腺癌原代细胞及MCF-7细胞株，发现其非黏附性生长，形成球体状结构微球体，可在体外连续传代，具有干细胞的特性，建立了乳腺癌干细胞的培养模型。该培养体系与组织化培养体系类似，均在培养基中添加生长因子，而后者需要支持介质(如基质胶Matrigel)，使细胞能够三维生长，形成微器官，后来被用于肿瘤研究，但是该培养体系仍不能替代体内移植验证实验^[16]。本研究采用无血清培养技术，成功在基底样乳腺癌组织分离培养出了微球体，并在基底样乳腺癌新辅助化疗后的残存癌组织中分离出了类似微球体的细胞团。

研究中有2例新辅助化疗后的残存癌组织中未能分离和培养出微球体，分析其原因为：乳腺癌是一组高度异质性的疾病，基底样型乳腺癌可能存在不同亚型，该类型乳腺癌的干细胞与其他亚型基底样乳腺癌干细胞存在差异，在乳腺癌细胞被化疗药物杀灭的过程中，该类型的干/祖细胞可能对某种化疗药物敏感而被同时清除，因此不能分离出微球体样细胞团，经无血清长期培养亦不能形成微球体，而对于大多数基底样乳腺癌而言，干/祖细胞能够逃避化疗药物的杀伤，具有充足的时间在体内自我更新和增殖，并在特性微环境下形成类似于无血清培养出的微球体样细胞团^[17-18]。本研究发现，化疗后残存癌组织中分离出的微球体样细胞球起初折光性较弱，球体表面的细胞与球体内部细胞连接松散，推测是由于球体表面存在分化的乳腺癌细胞或微球体细胞在特定环境下生长旺盛，新生细胞尚未和大多数细胞连接紧密所致。悬浮培养24 h后球体表面部分乳腺癌细胞或松散的新生细胞脱落，球体内部的干/祖细胞被充分暴露，折光性随即增强，可见连接紧密的细胞球，细胞之间的间界限模糊，球体表面仍可见少量坏死的细胞。培养7 d后，由于乳腺癌细胞无法在无血清培养基中长期存活，球体表面的乳腺癌细胞发生凋亡，在微球体表面出现坏死的细胞层，该部位的折光性减弱。未经过新辅助化疗的10例乳腺癌标本分离出的细胞全部在无血清培养基中形成微球体。本研究中18例标本分离和培养的微球体，经胰酶消化后能在无血清培养基中形成新的微球体并能够连续传代，提示基底样型乳腺癌组织中存在具有自我更新潜能的干细胞亚群。来源于未经过新辅助化疗的乳腺癌组织的原代细胞，大部分在无血清培养基中培养24 h内不能形成微球体，但T₂代及以后传代的微球体中并未发现该现象，推测其原因为乳腺癌干/祖细胞微球体细胞对添加生长因子的无血清培养基需要一定的时间来适应。

Dey等^[19]利用无血清悬浮培养技术富集乳腺干/祖细胞，通过长程培养研究其表型及功能特征，发现随着传代次数的增加球体体积逐渐减小，乳腺干/祖细胞的扩增能力和球体形成率不断下降，传至T₅代时无新生球体形成。陈元文等^[20]在乳腺癌干细胞的原代培养中发现了类似现象。本研究发现，基底样乳腺癌的干/祖细胞长程培养过程中微球体形成率随着传代次数的增加不断下降，新生微球体细胞数量逐渐减少，微球体体积呈下降趋势，直至无新生微球体形成，提示乳腺癌干/祖细胞微球体细胞在长期培养过程中其增殖潜能不断下降，直至消失。本研究与Dey等^[20]研究不同的是，未经化疗的乳腺癌干/祖细胞微球体细胞大多可以传至T₅代以上，个别标本甚至可以传至T₁₀代，而新辅助化疗后的乳腺癌干/祖细胞微球体细胞大多可以传代至T₁₅代，与作者前期的研究一致^[21]。在体外长程培养过程中，由于与体内环境存在差异，一旦干细胞赖以存活的微环境出现改变，乳腺癌干细胞的“干性”难以长期维持，因此乳腺癌干/祖细胞的培养方法有待改进。不同标本传代次数的不同提示基底样型乳腺癌干/祖细胞仍存在个体差异，其可能存在不同的起源，基底样乳腺癌仍然是一组异质性疾病，需要进一步分类，以便进行个体化治疗。化疗后的乳腺癌干/祖细胞微球体细胞传代次数的相对增加提示乳腺癌干细胞存活后自我更新能力增强，其可能成为日后乳腺癌复发和转移的根源。在添加血清的培养基中乳腺癌干/祖细胞微球体细胞不能形成悬浮的微球体，细胞形态变为长梭形并贴壁生长，提示乳腺癌干/祖细胞微球体细胞具有分化潜能。化疗后标本中乳腺癌干/祖细胞微球体细胞贴壁速度快于未经过化疗标本，呈现出更强的细胞分化能力。作者前期研究乳腺癌干/祖细胞分化前后细胞角蛋白的表达情况，发现基底样乳腺癌的干/祖细胞CK19⁺/CK14⁺，其不表达CK18，与乳腺上皮干细胞一致。经血清诱导分化后，不仅表达CK14等肌上皮标志，也表达管腔上皮标志CK18、CK19，提示有管腔上皮细胞和肌上皮细胞存在于其子代细胞中，证明基底样乳腺癌的干/祖细胞具有多向分化的潜能，可向管腔上皮和肌上皮双向分化^[22]。事实上，在无血清培养基中随着传代次数的增加新生微球体的悬浮能力也逐渐减弱，整个球体更加容易贴壁生长，同时微球体周围也可见到贴壁分化的细胞，提示乳腺癌干/祖细胞微球体细胞在新的微环境中继续演进，部分细胞克隆发生基因突变，更加适应新的环境而被选择，其他细胞由于不能适应新的环境而丧失克隆形成能力。

Al-Hajj等^[23]利用流式细胞术从细胞株和原代乳腺癌细胞中筛选出了表型为CD44⁺CD24^-的乳腺癌细胞亚群，其具有干细胞特性，在动物体内具有很强的致瘤能力，该表型细胞主要存在于基底样乳腺癌中，首次证实了乳腺癌干细胞的存在。随后Ginestier等^[24]发现了乳腺癌干细胞的功能性标记物ALDH1，ALDH1⁺细胞亚群与CD44⁺CD24^-细胞亚群存在少许交集，表型为ALDH1⁺CD44⁺CD24^-细胞亚群具有更强的致瘤能力。在随后的研究中发现多种肿瘤中均存在具有肿瘤干细胞特征的ALDH1⁺表型细胞^[25-28]。本研究通过流式细胞术检测发现基底样乳腺癌的乳腺癌干/祖细胞微球体细胞中均含有CD44⁺CD24^-和ALDH1⁺细胞亚群，且化疗后标本中的CD44⁺CD24^-和ALDH1⁺细胞的比例高于未经化疗标本，说明CD44⁺CD24^-和ALDH1⁺表型细胞普遍存在于基底样乳腺癌干/祖细胞微球体细胞中，新辅助化疗可以富集两种表型的细胞。本实验结果与文献报道相一致^[29-31]。

总之，研究证实基底样型乳腺癌组织中存在干/祖细胞样的致瘤性细胞亚群，未行化疗的乳腺癌组织分离细胞后可通过无血清悬浮培养获得富集乳腺癌干/祖细胞的微球体，而新辅助化疗后的残存乳腺癌组织中可以分离出含有乳腺癌干/祖的微球体样细胞团。化疗后的微球体中含有更高比例的CD44⁺CD24^-和ALDH1⁺表型细胞。基底样乳腺癌干/祖细胞微球体细胞在无血清悬浮培养基中传代次数有限，不同来源的标本其传代能力差异较大，且所有标本在传代过程中分化细胞越来越多，难以长期维持乳腺癌干细胞的“干性”，目前乳腺癌干细胞的培养方法亟需进一步改进，以便对生物学特性进行研究，为乳腺癌的个体化和精准治疗提供依据。

基底样型乳腺癌肿瘤干/祖细胞的长时程无血清培养

Long-term serum-free culture of cancer stem/progenitor cells from basal-like breast carcinoma

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