基于超支化聚酰胺胺可生物降解阳离子基因递送系统的构建与体外评价

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1549

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (6): 936-944.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1549

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基于超支化聚酰胺胺可生物降解阳离子基因递送系统的构建与体外评价

王杨¹，聂锦山²，顾准¹，朱铠³

¹苏州健雄职业技术学院，江苏省太仓市 215411；²苏州大学附属太仓医院消化内科，江苏省太仓市 215400；³复旦大学附属中山医院心外科，上海市 200032

收稿日期:2018-10-16 出版日期:2019-02-28 发布日期:2019-02-28
通讯作者: 王杨，苏州健雄职业技术学院，江苏省太仓市 215411
作者简介:王杨，女，1979年生，江苏省连云港市人，博士，讲师，主要从事功能高分子与生物大分子研究。
基金资助:
江苏省高校自然科学研究面上项目(16KJB430037)，项目负责人：王杨；苏州健雄职业技术学院“三级联动”科研基金项目(2017SJLD14)，项目负责人：顾准；太仓市基础研究计划项目(TC2016YYJC09)，项目负责人：顾准；江苏省高校“青蓝工程”优秀青年骨干教师项目，项目负责人：王杨

Construction and in vitro evaluation of a biodegradable cationic gene delivery system based on hyperbranched polyamidoamine

Wang Yang¹, Nie Jinshan², Gu Zhun¹, Zhu Kai³

¹Suzhou Chien-Shiung Institute of Technology, Taicang 215411, Jiangsu Province, China; ²Department of Gastroenterology, Taicang No. 1 People Hospital, the Affiliated Hospital of Soochow University, Taicang 215400, Jiangsu Province, China; ³Department of Cardiac Surgery, Zhongshan Hospital, Fudan University & Shanghai Institute of Cardiovascular Diseases, Shanghai 200032, China

Received:2018-10-16 Online:2019-02-28 Published:2019-02-28
Contact: Wang Yang, Suzhou Chien-Shiung Institute of Technology, Taicang 215411, Jiangsu Province, China
About author:Wang Yang, MD, Lecturer, Suzhou Chien-Shiung Institute of Technology, Taicang 215411, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Natural Science Research Project of Jiangsu Provincial Universities (General Project), No. 16KJB430037 (to WY); the Three-Level Linkage Research Foundation of Suzhou Chien-Shiung Institute of Technology, No. 2017SJLD14 (to GZ); the Basic Research Project of Taicang Municipality, No. TC2016YYJC09 (to GZ); the Excellent Youth Teacher Project of Jiangsu Provincial Universities (to WY)

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

超支化聚酰胺胺：具有与树枝状聚合物聚酰胺胺相似的结构与性质，是一种聚合物链中含大量沿其链排列叔胺基和酰胺基的高分子量与高度支化结构的聚合物。

基因递送：利用生物相容性材料作为基因载体材料，通过包裹或静电吸附、化学键结合等方式与外源DNA形成载体/基因复合物纳米微囊或纳米颗粒，形成的复合物再通过化学键作用或静电吸附作用与细胞表面的受体结合，利用细胞胞吞作用实现基因的靶向输送与表达。

背景：与其他聚阳离子相比，超支化聚酰胺胺的细胞毒性小、生物相容性好、溶血活性低、易于表面修饰，在基因递送中是一类具有广阔应用前景的阳离子聚合物。但目前应用于基因转染的超支化聚酰胺胺大多不可降解，易在体内聚集引起细胞毒性。

目的：合成还原降解超支化聚酰胺胺(redox-degradable hyperbranched polyamidoamine，DHPAA)，考察其作为基因递送载体的安全性和有效性。

方法：以N，N'-双(丙烯酰)胱胺(BAC)和1-(2-氨乙基)哌嗪(AEPZ)为功能性单体，通过迈克尔加成一锅法合成DHPAA，采用核磁共振氢谱、凝胶渗透色谱和酸碱滴定法对其结构和性能进行表征。采用自组装法制备DHPAA/DNA复合物，使二者质量比分别为1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1；采用动态光散射和透射电镜测定复合物的粒径、形貌和Zeta电势；采用琼脂糖凝胶阻滞电泳、Picogreen荧光分析和体外释放DNA实验检测DHPAA对DNA的固缩能力及DHPAA的还原降解性。以人肾上皮细胞系HEK293、人乳腺癌细胞系MCF-7、间充质干细胞和子宫颈癌细胞系Hela为细胞模型，采用MTT法检测聚合物DHPAA的细胞毒性；以间充质干细胞和子宫颈癌细胞系Hela为细胞模型，采用MTT法检测DHPAA/DNA复合物的细胞毒性。以绿色荧光蛋白报告基因为研究对象(绿色荧光蛋白报告基因与DHPAA的质量比分别为1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1)，使用流式细胞仪与共聚焦激光扫描显微镜考察DHPAA在间充质干细胞中的体外转染效率。

结果与结论：①合成的聚合物DHPAA结构符合分子设计，在pH=3-10范围内具有良好的缓冲能力；聚合物DHPAA对DNA分子具有很好的固缩能力，形成的复合物在生理条件下很稳定，在还原性介质中能够快速释放出DNA；当DHPAA/DNA质量比由1∶1增加到10∶1时，复合物的包封率逐渐增加，此后质量比继续增加包封率不再增加；②在1-200 mg/L 范围内，聚合物DHPAA对HEK293、MCF-7、间充质干细胞和Hela细胞的存活率无影响；③当质量比由1∶1增加到10∶1时，25 mg/L DHPAA/DNA复合物对间充质干细胞和Hela细胞的存活率无影响；④当质量比由1∶1增加到10∶1时，DHPAA/绿色荧光蛋白报告基因复合物的转染效率逐渐增加，当质量比继续增加时转染效率增加缓慢；⑤结果表明，还原降解DHPAA生物相容性好，能够高效地将基因递送到细胞内并高效表达基因。综合考虑DHPAA的DNA负载效率和复合物的转染效果，选择10∶1为最佳聚合物/DNA质量比。

ORCID: 0000-0001-6276-5277(王杨)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 超支化聚酰胺胺, 还原降解, 基因递送, 基因传递系统, 细胞转染效率, 包封率

Key words: Transfection, Polymers, Tissue Engineering

中图分类号:

王杨，聂锦山，顾准，朱铠. 基于超支化聚酰胺胺可生物降解阳离子基因递送系统的构建与体外评价[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(6): 936-944.

Wang Yang, Nie Jinshan, Gu Zhun, Zhu Kai. Construction and in vitro evaluation of a biodegradable cationic gene delivery system based on hyperbranched polyamidoamine[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(6): 936-944.

图/表（结果） 11

2.1 载体材料DHPAA的合成与表征 DHPAA由单体A₂+B₃通过迈克尔加成“一锅法”反应合成，单体A₂选用含有二硫键的末端双烯基单体N，N'-双(丙烯酰)胱胺，单体B₃选用多元胺1- (2-氨乙基)哌嗪，使用甲醇为溶剂，反应条件温和，操作简单。图2为聚合物DHPAA的核磁共振氢谱图，2.10 ppm处出现了来自哌嗪六元环的-CH₂-特征峰，2.79-2.73 ppm处出现了来自N，N'-双(丙烯酰)胱胺的-CH₂(S-S)CH₂-特征峰，2.67 ppm 处出现来自N-氨乙基中的-CH₂-特征峰，2.60 ppm处出现了(-CH₂CONH)的特征峰，2.80 ppm处出现了(-CH₂NH₂)的特征峰，3.41 ppm 处出现了(>NCH₂-)的特征峰，3.34-3.23 ppm 处出现了(-CONHCH₂-)的特征峰，3.15 ppm出现了(-CH₂-NH-CH₂-CH₂N(CH₂)₄NH)的特征峰。DHPAA在D₂O中的核磁共振氢谱图表明，所合成的聚合物符合分子设计。采用激光光散射凝胶渗透色谱系统测定聚合物DHPAA的绝对分子质量，根据GPC结果分析，数均分子质量(M_n)为4.635×10⁴，重均分子质量(M_w)为1.372×10⁵，重复的聚酰胺胺单元大约为119。通过酸-碱滴定评价聚合物DHPAA的质子缓冲效应。见图3，0.15 mol/L氯化钠溶液的滴定曲线接近垂直，说明其缓冲能力非常小。相反，聚合物DHPAA溶液具有很强的缓冲能力，在pH=10-3的范围内的滴定曲线非常平缓。

2.2 DHPAA/DNA复合纳米粒子的性能表征

2.2.1 凝胶阻滞分析图4为不同质量比DHPAA/DNA质粒的电泳分析图，表明当质量比为1∶1时即可抑制DNA质粒的流动，见图4A；当DHPAA/DNA复合物分散于10 mmol/L 二硫苏糖醇时，复合物快速分解，并释放出游离DNA条带，见图4B。这些结果表明，二硫苏糖醇的存在使聚合物DHPAA中的二硫键发生断裂，引起复合物的分解。

2.2.2 聚合物DHPAA压缩DNA形成复合物的能力使用Picogreen试剂测定了DHPAA聚合物包裹DNA的能力，见图5所示，DHPAA/DNA复合物的荧光强度随着质量比的增加而逐渐降低，这表明当聚合物质量增加时，未包裹的游离DNA减少。在DHPAA与DNA质量比达到10∶1时，溶液的相对荧光强度不再发生变化，说明质量比10∶1时聚合物对于DNA的固缩已相对完全。当10 mmol/L二硫苏糖醇加入至复合物溶液中时，聚合物发生降解，质粒被游离出来，因此相对荧光强度几乎保持不变(90%-100%)，这些结果与电泳结果一致。

2.2.3 复合物的形态、粒径及Zeta 电位见图6。当聚合物DHPAA与DNA质粒的质量比从1∶1变化到20∶1，粒径从105.5 nm变化至59.8 nm，表明聚合物与DNA质粒质量比增加，粒径减小。此外，图6中所示的电势值表明，当质量比从1∶1变化到20∶1，电势从-9.98 mV变化至 29.1 mV(远高于纯DNA的电势-22.4 mV)，当质量比大于10∶1时，复合物的电势已大于20 mV，说明聚合物已可完全包裹DNA，这与Picogreen荧光分析结果一致。图7为质量比为10∶1复合物纳米粒降解前后的透射电镜形貌，降解前复合物纳米粒呈现出规则、均匀的球形形貌，粒径约为45 nm；降解后发生粒子聚集，粒径增加。

2.2.4 复合物的包封率测定与体外释放通过荧光分光光度法测定不同质量比DHPAA/DNA复合物的包封率，图8A结果表明，在质量比为10∶1时已接近90%，质量比继续增加包封率不再增加。因此，选用DHPAA与DNA质量比为10∶1的复合物为研究对象，研究其在中性或者还原性介质中DNA的释放行为。图8B结果表明，在不含二硫苏糖醇的释放介质中，DNA释放百分率接近0%，说明DHPAA/ DNA复合物很稳定，无法从复合物纳米粒中释放出DNA；相反，在二硫苏糖醇浓度为10 mmol/L的释放介质中，在0-4 h 内，DNA的释放百分率从0%增加到90%，这是因为在还原性环境中，DHPAA中的二硫键被还原，聚合物发生降解促进了DNA的释放，有利于体外或体内基因的表达。

2.3 DHPAA细胞毒性分析基因载体的细胞毒性对DNA的转染效率有很大的影响。图9显示了使用MTT法测定不同质量浓度聚合物对HEK293、MCF-7、间充质干细胞和Hela细胞的48 h毒性。由图可见，随着质量浓度的增加，聚乙烯亚胺对所有的细胞系表现出很强的细胞毒性，尤其当质量浓度为200 mg/L时，细胞存活率为20%-30%。相比之下，聚合物DHPAA毒性较小，在整个质量浓度范围内(1-200 mg/L)几乎对细胞存活率无影响，即使在200 mg/L条件下细胞存活率仍接近90%。图10为25 mg/L不同质量比DHPAA/DNA复合物对间充质干细胞和Hela细胞的48 h毒性分析。从图中可看出，所有复合物48 h的细胞毒性均较小，当聚合物DHPAA与DNA的质量比从1∶1增加至20∶1，间充质干细胞的存活率从90.57%变化到93.02%，Hela细胞的存活率从86.96%变化到90.65%，这说明聚合物不影响细胞存活率，是一种生物相容性好的基因递送材料。

2.4 体外基因转染实验使用流式细胞仪和荧光共聚焦显微镜对不同质量比的HPAA/pEGFP复合物进行了间充质干细胞细胞转染实验。图11结果表明，当DHPAA与pEGFP质量比从1∶1增加至20∶1，复合物转染效率从34.9%增加至63.5%，远大于纯DNA质粒的转染效率(0.115%)；当聚合物与pEGFP质量比为10∶1时，复合物的转染效率接近60%，质量比继续增加，转染效率增加缓慢。图12为不同质量比DHPAA/pEGFP复合物的荧光共聚焦图像，结果表明随着DHPAA与pEGFP质量比的增加，细胞中的绿色荧光强度增强，当质量比增加至10∶1以上，可明显地观察到视野下的绿色荧光增强，这表明较多绿色荧光蛋白被表达，这与流式细胞仪分析结果一致。

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引言

材料方法

1.1 设计可生物降解DHPAA作为载体的基因递送系统的构建与体外转染性能评价。

1.2 时间及地点实验于2016年12月至2017年12月在苏州健雄职业技术学院苏州市生物医药绿色合成重点实验室完成，部分生物实验在上海师范大学分析测试中心完成。

1.3 材料

实验主要仪器：核磁共振波谱仪(Bruker-500 MHz，瑞士Bruker公司)；激光光散射凝胶渗透色谱系统(Waters 515，USA)；pH计(雷磁PHS-3E型，上海仪电科学仪器股份有限公司)；荧光酶标仪(Fluoroskan Ascent FL，美国Thermo Scientific)；动态光散射(DLS，Nano-ZS90，Malven)；透射电子显微镜(Tecnai G2 Spirit，荷兰FEI)二氧化碳培养箱(HERA cell CO₂，美国Thermo Scientific)；酶标仪(Multiskan Spectrum，美国Thermo Scientific)；流式细胞仪[FACS Calibur，碧迪医疗器械(上海)有限公司]；共聚焦激光扫描显微镜(FV1200，日本 Olympus)。

实验主要细胞与试剂：人肾上皮细胞系HEK293、人乳腺癌细胞系MCF-7和子宫颈癌细胞系Hela(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库提供)；间充质干细胞系(Sciencell，USA)；N，N'-双(丙烯酰)胱胺、1- (2-氨乙基)哌嗪(纯度>98%，百灵威科技有限公司)；二硫苏糖醇(纯度>99%，百灵威科技有限公司)；MTT(纯度>98%，Sigma)；he plasmid DNA质粒(8.5 kb，购于苏州金唯智生物科技有限公司)；PicoGreen dsDNA 定量试剂盒(Life technologies，USA)；pEGFP绿色荧光蛋白质粒基因(Clontech，5.3 kb，作者所在实验室扩增和提取)；DMEM高糖、DMEM低糖、RPMI1640、MEM细胞培养基(HyClone，USA)；甲醇、乙醚、丙酮等实验用有机溶剂均为市售分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

1.4 实验方法

1.4.1 载体材料DHPAA的合成 DHPAA采用一锅法迈克尔加成聚合反应制备得到^[22-23]，见图1。具体如下：首先，在50 mL圆底烧瓶中加入N，N'-双(丙烯酰)胱胺(1.5 mmol，0.391 g)和10 mL甲醇溶液，磁力搅拌溶解；将1-(2-氨乙基)哌嗪(1.5 mmol，0.194 g)溶于2 mL甲醇溶液后搅拌下缓慢加入上述烧瓶中，混合物在50 ℃下反应 6 d。反应结束后，在剧烈搅拌下将反应混合物加入至过量乙醚中进行沉淀。将沉淀通过离心分离、溶解至甲醇后，在含有体积分数5%浓盐酸的100 mL丙酮溶液中沉淀、真空干燥得淡黄色固体粉末(DHPAA)。

1.4.2 载体材料DHPAA的表征利用核磁共振波谱仪对材料进行结构确认；激光光散射凝胶渗透色谱系统测定聚合物DHPAA的绝对分子量，采用十八角度激光光散射仪和示差折光指数检测器，以牛血清蛋白作为标准样品，超纯水(0.02%叠氮化钠)为流动相，流动速度1.0 mL/min，柱温25 ℃；采用酸碱滴定法测定DHPAA的缓冲能力，具体方法如下：将一定量的聚合物溶于10 mL 0.15 mol/L氯化钠溶液中，得到氨基浓度为20 mmol/L，用 0.1 mol/L NaOH调节pH值至10.0，再用0.1 mol/L HCl调节pH值至3.0，每加入20 μL 0.1 mol/L HCl测定pH值，记录pH值从10.0到3.0的变化。

1.4.3 DHPAA/DNA复合纳米粒子的制备采用自组装法制备DHPAA/DNA复合物。使用之前，将he plasmid DNA质粒储备溶液用TE缓冲溶液(pH=7.5)稀释至10 mg/L，再将载体材料溶解至TE缓冲溶液(pH=7.5)中，并根据设定的聚合物/DNA质量比或N/P比等体积缓慢加入至DNA溶液中，见表1。室温下反应混合溶液涡旋混匀30 s后，室温静置30 min形成复合物纳米粒。

1.4.4 DHPAA/DNA复合纳米粒子的体外性质评价

凝胶阻滞电泳分析：配制质量浓度为10 mg/L不同聚合物/DNA质量比的复合物溶液。将上述复合物纳米粒溶液与5×DNA loading buffer按4∶1混匀后，用微量移液器将混合液加到样品孔中，每孔加10 μL。安装好电极导线，打开电源，调电压至120 V，当溴酚蓝指示剂移到距凝胶前沿1.0-2.0 cm时，停止电泳。取出凝胶，在254 nm的紫外灯下观察，有橙红色荧光条带的位置，即为DNA条带，照相记录电泳图谱。

Picogreen荧光表征：根据使用说明，将50 μg复合物纳米粒与稀释的PicoGreen dsDNA试剂混合。避光孵育 20 min后，溶液的荧光强度通过Fluoroskan Ascent FL Microplate Fluoromete测定，激发波长为485 nm，发射波长520 nm。相对荧光强度通过复合物纳米粒子的荧光强度与DNA自身的荧光强度比值计算得到。为了证明材料的还原降解性，在上述稀释的PicoGreen dsDNA溶液中加入一定量的二硫苏糖醇，使其终浓度为10 mmol/L，相同条件下测定相对荧光强度。

复合物形态、粒径及表面Zeta电势测定：使用动态光散射测定凝胶粒子的流体力学直径和表面电势；透射电子显微镜观察真空状态下复合物纳米粒形态、分布状态和粒径大小；将适量的质量比为10∶1的复合物分散在10 mmol/L二硫苏糖醇溶液中，使其质量浓度为200 mg/L，37 ℃条件下孵育2 h后，使用透射电子显微镜观察发生降解的复合物纳米粒的形貌。

复合物体外释放DNA实验：按前述方法制备聚合物与DNA质粒质量比为10∶1的复合物，通过透析去除未结合的DNA。复合物纳米粒子中释放出的DNA浓度用荧光分光光度法测定。取1 mL上述复合物加入透析袋中(含或不含10 mmol/L二硫苏糖醇)，置于含20 mL TE(Tris-EDTA)缓冲溶液的烧杯中，按照实验设计在37 ℃空气浴中分别振荡不同时间后，取出1mL溶液(同时补充1mL TE)与PicoGreen dsDNA 试剂混合10 min，荧光强度通过Fluoroskan Ascent FL Microplate Fluorometer进行检测(激发485 nm，发射520 nm)。释放出的DNA浓度通过一系列DNA标准品浓度-荧光曲线确定。

1.4.5 MTT法检测聚合物和复合物的细胞毒性选择HEK293、MCF-7、间充质干细胞和HeLa为模型细胞，检测载体材料在不同浓度下对不同细胞存活率的影响。使用含体积分数10%胎牛血清的DMEM低糖培养液培养间充质干细胞，含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养液培养Hela细胞，含体积分数10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养MCF-7细胞，含体积分数10%胎牛血清的MEM培养液培养HEK293细胞。消化处于对数生长期的4种细胞，配制成细胞浓度为5×10⁷ L^-1的悬液并接种于96孔板中，每孔体积100 μL；96孔细胞培养板置于37 ℃、体积分数5%CO₂ 培养箱中培养24 h，弃96孔板中上清液，相应孔分别加入不同质量浓度的聚合物材料(1，10，25，50，100， 200 mg/L)，每种浓度设置3复孔，另设立正常对照组 (0 mg/L)和与聚合物相同浓度的聚乙烯亚胺(25K)对照组，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养48 h。弃上清，每孔加入1 g/L的MTT溶液100 μL，37 ℃继续孵育4 h。弃去培养液，每孔加入150 μL DMSO溶解，摇床震荡10 min，以保证MTT被活细胞还原并与DMSO充分溶解；使用多功能酶标仪于λ=570 nm处测试每孔的A值，计算各组细胞的增殖率。复合物的细胞毒性检测方法与聚合物相同，选择间充质干细胞和HeLa为模型细胞，相应孔中分别加入10 μL前述方法制备的不同质量比复合物(1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1)，每种质量比的复合物设置3复孔，48 h后测试每孔的A值，计算各组细胞增殖率。

1.4.6 流式细胞仪检测转染效率为了更直观地研究聚合物DHPAA在间充质干细胞中的转染情况，使用增强型绿色荧光蛋白pEGFP质粒与DHPAA结合，以此评价聚合物DHPAA对基因的转染效率。流式细胞仪检测方法如下：0.25%胰酶溶液消化并收集生长状态良好的间充质干细胞，按1×10⁵个细胞/孔分布于6孔板中，37 ℃、体积分数5%CO₂环境中孵育过夜；取10 μg绿色荧光蛋白pEGFP质粒与不同质量的聚合物混合均匀，搅拌6 h后避光加入6孔板相应孔中，十字法混合均匀；细胞在37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养12 h后，弃上清液，PBS洗涤3次；胰酶消化并离心收集细胞(1 000 r/min)后弃上清；加入 400 μL PBS，以标准程序用流式细胞仪(FACS Calibur、BD检测，汞激发波长488 nm)计数1万个细胞。

1.4.7 荧光共聚焦检测转染实验荧光共聚焦检测转染效率方法如下：以1.5×10⁵的密度将间充质干细胞种于12孔板中，培养于1 mL含体积分数10%胎牛血清的DMEM低糖培养液中，37 ℃、体积分数5%CO₂浓度下培养24 h。向间充质干细胞液中加入不同质量比的DHPAA/pEGFP复合物纳米粒子(DNA 2 μg/孔)，孵育4 h后更换新鲜培养液，继续培养48 h。弃上清，PBS水洗2次，使用共聚焦激光扫描显微镜观察。

1.5 主要观察指标 ①核磁共振氢谱、凝胶渗透色谱和酸碱滴定法对DHPAA结构、分子量和缓冲性能进行表征；②动态光散射和透射电镜测定DHPAA/DNA复合物的粒径、Zeta电势和形貌；③琼脂糖凝胶阻滞电泳、Picogreen荧光分析和体外释放DNA实验检测DHPAA对DNA的固缩能力及还原降解性；④MTT法检测DHPAA及DHPAA/DNA复合物的细胞毒性；⑤流式细胞仪与共聚焦激光扫描显微镜考察DHPAA在间充质干细胞中的体外转染效率。

1.6 统计学分析采用Graphpad prism 7统计软件分析，细胞增殖率、转染率及相对荧光强度以x(_)±s表示，进行方差分析(ANOVA)对组间差异进行显著性检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

基于超支化聚酰胺胺可生物降解阳离子基因递送系统的构建与体外评价

Construction and in vitro evaluation of a biodegradable cationic gene delivery system based on hyperbranched polyamidoamine

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