聚三亚甲基碳酸酯体外酶解性能的影响因素及其作用规律

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1556

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (6): 945-950.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1556

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聚三亚甲基碳酸酯体外酶解性能的影响因素及其作用规律

李乌云塔娜¹，赵灵燕¹，张巍²，夏远¹，杨立群²

¹内蒙古医科大学，内蒙古自治区呼和浩特市 010020；²辽宁省计划生育科学研究院，中国医科大学，辽宁省沈阳市 110031

收稿日期:2018-10-13 出版日期:2019-02-28 发布日期:2019-02-28
通讯作者: 杨立群，博士，副研究员，辽宁省计划生育科学研究院，中国医科大学，辽宁省沈阳市 110031
作者简介:李乌云塔娜，1983年生，内蒙古自治区通辽市人，蒙古族，2011年东北大学毕业，硕士，实验师，主要从事卫生检验工作。
基金资助:
国家十三五重点研发计划项目(2016YFC1000902)，项目负责人：杨立群；国家自然科学基金项目(51503093)，项目负责人：杨立群；辽宁省重点研发计划项目(2018225079)，项目负责人：杨立群；辽宁省自然科学基金项目(20170540491)，项目负责人：张巍；沈阳市高层次创新人才计划项目(RC170359)，项目负责人：杨立群；沈阳市科学技术计划项目(F16-205-1-37)，项目负责人：杨立群

In vitro enzymatic degradation of poly(trimethylene carbonate): influencing factors and their effects

Li Wuyuntana¹, Zhao Lingyan¹, Zhang Wei², Xia Yuan¹, Yang Liqun²

¹Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010020, Inner Mongolia Autonomous Region, China; ²Liaoning Research Institute of Family Planning, China Medical University, Shenyang 110031, Liaoning Province, China

Received:2018-10-13 Online:2019-02-28 Published:2019-02-28
Contact: Yang Liqun, MD, Associate researcher, Liaoning Research Institute of Family Planning, China Medical University, Shenyang 110031, Liaoning Province, China
About author:Li Wuyuntana, Master, Experimentalist, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010020, Inner Mongolia Autonomous Region, China
Supported by:
the National 13^th Five-Year Key Research & Development Program of China, No. 2016YFC1000902 (to YLQ); the National Natural Science Foundation of China, No. 51503093 (to YLQ); the Key Research & Development Program of Liaoning Province, No. 2018225079 (to YLQ); the Natural Science Foundation of Liaoning Province, No. 20170540491 (to ZW); the High-Level Innovation Talent Program of Shenyang, No. RC170359 (to YLQ); the Shenyang Science and Technology Program, No. F16-205-1-37 (to YLQ)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
聚三亚甲基碳酸酯：是一种无定形态或具有少许结晶的聚碳酸酯，其玻璃化转变温度大约为-17 ℃，在室温和体内条件下具有良好的弹性，其在体内降解不会释放出酸类物质，造成局部酸性上升，导致自动加速降解行为的发生，可作为体内植入材料及药物缓控释材料应用于临床，己在皮下避孕体系、三维组织工程支架、神经修复和药物控制释放等领域表现出极大的应用潜力。
开环聚合反应：是指环状化合物单体经过开环加成转变为线型聚合物的过程，包括链引发、链增长和链终止等基元反应。

背景：聚三亚甲基碳酸酯具有良好的生物相容性和生物降解性能，具有较大的临床应用前景。目前，国内外关于聚三亚甲基碳酸酯体外酶解性能影响因素及其作用规律的研究较少。
目的：研究聚三亚甲基碳酸酯的体外酶解性能，并探讨影响聚三亚甲基碳酸酯体外酶解性能的因素及其作用规律。
方法：通过开环聚合反应制备聚三亚甲基碳酸酯均聚物及其共聚物，2种均聚物的分子质量分别为135，256 kDa，共聚物的分子质量为238 kDa，将分子质量为256 kDa的均聚物制成棒条与膜片2种形状，其余2种样品制成棒条。将均聚物、共聚物样品分别置于脂肪酶溶液中，均聚物样品于第1，2，4，8，10，12周取出，共聚物样品于3，6，9，12，15 d后取出样品，测量样品质量变化，计算失重率及降解速率常数。
结果与结论：①分子质量、形状及共聚改性对聚三亚甲基碳酸酯的体外酶解性能有显著影响；②当分子质量由135 kDa增加至256 kDa时，聚三亚甲基碳酸酯均聚物棒条的酶解速率常数由每周1.46%增加到每周3.81%，说明分子质量越高，聚三亚甲基碳酸酯均聚物的体外酶解速率越快；③当形状由棒条转换为膜片时，分子质量为256 kDa聚三亚甲基碳酸酯均聚物的酶解速率常数由每周3.81%增加到每周9.16%，说明膜片形状样品降解速率更快；④在分子质量为256 kDa聚三亚甲基碳酸酯结构中引入等摩尔比己内脂成分后，其酶解速率常数由每周3.81%增加到每周14.49%，说明在结构中引入聚己内酯成分，可加速聚三亚甲基碳酸酯的降解速率；⑤各因素对聚三亚甲基碳酸酯体外酶解速率的影响程度顺序为：共聚组成>样品形状>分子质量。

ORCID: 0000-0001-8349-4410(李乌云塔娜)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 聚三亚甲基碳酸酯, 体外酶解, 降解速率, 开环聚合反应, 键引发, 键增长, 键终止

Abstract:

BACKGROUND: Poly(trimethylene carbonate) has great potential in clinical applications due to the excellent biocompatibility and biodegradability. Little is reported on the factors influencing the in vitro enzymatic degradation of poly(trimethylene carbonate) and the underlying mechanism.

OBJECTIVE: To investigate the in vitro enzymatic degradation of poly(trimethylene carbonate), and to explore the influencing factors and their effects on the poly(trimethylene carbonate) degradation.

METHODS: poly(trimethylene carbonate) homopolymers and copolymers were prepared by ring-opening polymerization. The molecular mass of the two homopolymers was 135 and 256 kDa, respectively. The molecular mass of the copolymers was 238 kDa. The homopolymer of 256 kDa was made into two shapes (rods and films), and the other two samples were shaped into rods. The in vitro enzymatic degradation of poly(trimethylene carbonate) was conducted in lipase solutions, the homopolymer samples were taken out at 1, 2, 4, 8, 10, and 12 weeks, and the copolymer samples were taken at 3, 6, 9, 12, and 15 days. The mass loss and degradation rate constant were measured.

RESULTS AND CONCLUSION: The molecular mass and shape as well as molar ratio played important roles on the in vitro enzymatic degradation behavior of poly(trimethylene carbonate). As the molecular mass increased from 135 to 256 kDa, the degradation rate constant of poly(trimethylene carbonate) homopolymer increased from 1.46% to 3.81%, indicating that the higher the molecular mass, the higher degradation rate of poly(trimethylene carbonate). The poly(trimethylene carbonate) film presented with higher degradation rate than the cylinder one with the same molecular weight, and the degradation rate constant increased from 3.81% to 9.16% as the shape of poly(trimethylene carbonate) with a molecular weight of 256 kDa changed from rods to films. The introduction of polycaprolactone segment accelerated the degradation rate of poly(trimethylene carbonate). The degradation rate constant increased from 3.81% to14.49% as the 50 mol% caprolactone content was introduced into the structure of poly(trimethylene carbonate) (256 kDa). In summary, the order of factors influencing the degradation rate of poly(trimethylene carbonate) is as follows: copolymer composition > shape > molecular mass.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Materials Testing, Lipase, Tissue Engineering

中图分类号:

李乌云塔娜，赵灵燕，张巍，夏远，杨立群. 聚三亚甲基碳酸酯体外酶解性能的影响因素及其作用规律[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(6): 945-950.

Li Wuyuntana, Zhao Lingyan, Zhang Wei, Xia Yuan, Yang Liqun. In vitro enzymatic degradation of poly(trimethylene carbonate): influencing factors and their effects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(6): 945-950.

图/表（结果） 7

2.1 结构表征结果图3是PTMC均聚物的核磁谱图，核磁数据如下：δ=4.14(tr，4H，Ha)，2.02(m，2H，Hb)。其中，-CH₂-上质子的化学位移与文献[19]报道数据相符，验证了其结构的正确性。

图4为PTMC共聚物(三亚甲基碳酸酯/CL=50/50)的核磁共振谱图，核磁数据如下：δ=4.25-4.20(m，4H，Ha)、4.14-4.07(tr，2H，Hd)、2.34-2.30(m，2H，Hh)、2.07-2.00 (m，2H，Hb)、1.72-1.63(m，4H，He+g)及1.44-1.36 (m，2H，Hf)。其中，三亚甲基碳酸酯-CH₂-CH₂-CH₂-基团在2.05 ppm处的峰面积及ε-己内酯-COCH₂-基团在 2.30 ppm处的峰面积被用来计算共聚物组成^[20]。计算结果表明，共聚物组成比与投料比趋于一致。

2.2 物理性能表征结果 PTMC均聚物及共聚物的具体性能，见表1。

2.3 分子质量对PTMC降解性能的影响 PTMC均聚物在体外酶解过程中失重率及其与降解时间的函数关系曲线，见图5所示。PTMC在降解过程中均呈现显著失重，并且失重率随降解时间呈线性关系增长。分子质量为256 kDa的PTMC均聚物在脂肪酶溶液中降解4，8，12周后的失重率分别为(19.04 ±0.1)%，(31.71±0.37)%，(43.65±0.35)%，分子质量为135 kDa的PTMC均聚物失重率同样随降解时间的延长而逐渐增大，但其在同一时间点的失重率小于分子质量为256 kDa PTMC均聚物的失重率，例如其在降解12周后的失重率仅为(17.92±2.51)%。

2.4 样品形状对PTMC降解性能的影响不同形状PTMC (分子质量为256 kDa)均聚物在体外酶解过程中的失重率及其与降解时间的函数关系曲线，见图6所示，膜片状PTMC均聚物在脂肪酶溶液中降解12周后的失重率为(92.44±0.62)%，棒状PTMC均聚物在同一时间点的失重率仅为(43.65±0.35)%。

2.5 共聚对PTMC降解性能的影响图7给出了PTMC均聚物与共聚物在体外酶解过程中失重率及其与降解时间的函数关系曲线，PTMC均聚物在脂肪酶溶液中降解14 d后的失重率为(9.15±0.10)%，而PTMC共聚物在15 d的失重率就高达(32.11±0.28)%。

2.6 降解速率计算结果在一级动力学模型的基础上，通过失重率变化定量计算了PTMC的体外酶解速率常数，计算公式如下^[21-23]：

图5-7分别给出了不同分子质量、不同形状及不同共聚组成的PTMC失重率与降解时间的线性关系曲线，通过数据的线性拟合即可得到各样品的体外酶解速率常数，见表2。

由表2可知，PTMC的体外酶解速率常数与其分子质量、形状及共聚组成有密切关系。当分子质量由135 kDa增大至256 kDa时，PTMC均聚物的酶解速率常数由每周1.46%增大至每周3.81%；当相同分子质量的PTMC (M_n=256 kDa)均聚物形状由棒状转变为膜片时，其降解速率常数由每周3.81%增大至每周9.16%；此外，当其结构引入50%ε-己内酯成分时，PTMC降解速率常数由每周3.81%增大至每周14.49%。

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引言

可生物降解脂肪族聚碳酸酯具有良好的生物降解性、优异的生物相容性和物理机械性能^[1-3]，是一类重要的生物降解医用高分子材料。与聚羟基羧酸酯及其共聚物相比^[4-6]，可生物降解脂肪族聚碳酸酯最大的优势是在降解过程中无酸性降解产物生成^[7]，不会使机体产生无菌炎症等不良反应。作为生物医用材料的可生物降解脂肪族聚碳酸酯，最常见且研究较广泛的是三亚甲基碳酸酯均聚物-聚三亚甲基碳酸酯[poly(trimethylene carbonate)，PTMC]。PTMC是一种无定形态或具有少许结晶的聚碳酸酯，其玻璃化转变温度大约为-17 ℃^[2]，在室温和体内条件下具有良好的弹性。同时，PTMC在体内降解不会释放出酸类物质，造成局部酸性上升而导致自动加速降解行为的发生，可作为体内植入材料及药物缓控释材料应用于临床，己在皮下避孕体系^[8]、三维组织工程支架^[9-12]、神经修复^[13-15]、药物控制释放等领域表现出极大的应用潜力^[16-17]。因此，PTMC的研究及其应用正引起人们越来越广泛的兴趣与关注。

研究表明，PTMC的水解速率非常慢。Pego等^[18]发现PTMC在为期2年时间内的水解过程中，其分子质量及力学性能仅发生较小的变化，降解速率常数仅为0.004×10^-2/d，证明了PTMC的非水解特性；而同为体外降解实验，PTMC的体外酶解性能与体外酶水性能存在明显差异。与其非水解性能相比，PTMC在脂肪酶溶液中降解非常快。相对分子质量为29.1万的PTMC，在PBS中几乎不降解，而在Thermomyces lanuginosus 脂肪酶溶液中降解40 d后，失重率就已高达86%，60 d后几乎降解完全^[1]。在酶的作用下，PTMC 的降解速率明显提高。由于人体内有酶存在，可能对PTMC的体内降解行为产生显著影响。因此，深入研究PTMC的体外酶解性能对探索其体内降解行为具有重要的指导意义。实验分别从分子质量、样品形状及共聚比例等多角度出发，深入研究PTMC的体外酶解性能，并探讨上述因素对PTMC体外酶解性能的影响及作用规律，为开展体内降解性能研究提供指导与支持，为进一步促进PTMC在生物医学领域的广泛应用奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计开环聚合反应及降解实验。

1.2 时间及地点实验于2013年7月至2017年5月在辽宁省计划生育科学研究院生物材料研究室完成。

1.3 材料三亚甲基碳酸酯(山东济南岱罡生物科技有限公司提供，使用前乙酸乙酯重结晶2次)；ε-己内酯(99%，美国Sigma-Aldrich公司，使用前用CaH₂干燥并减压蒸馏)；催化剂Sn(Oct)₂和脂肪酶溶液lipase from Thermomyces lanuginosus(100 000 U/g)(Sigma-Aldrich公司)；其他试剂购于国药集团化学试剂有限公司；高分辨超导核磁共振波谱仪(瑞士Bruker公司，Bruker AV II-600 MHz)；凝胶渗透色谱仪(美国Waters公司，1515型isocratic HPLC)；差示扫描量热仪(德国Netzsch公司，DSC200F3型)；热重分析仪(德国Netzsch公司，TGA209F3型)。

1.4 实验方法

1.4.1 PTMC的制备 PTMC均聚物或共聚物采用聚合-成型一体化技术，通过反应单体在模具内的本体开环聚合反应制备而得，即开环聚合反应与成型过程同步发生。具体步骤为：3个内含聚四氟管材(内径为3 mm，长度为3 cm)的聚合管分别标记为No.1、No.2、No.3，在氮气保护下，将5.1 g(0.05 mol)三亚甲基碳酸酯装入No.1，5.1 g (0.05 mol)三亚甲基碳酸酯装入No.2，2.55 g(0.025 mol)三亚甲基碳酸酯及3.6 g(0.025 mol)ε-己内酯加入No.3后，分别加入2 000 μL、200 μL及400 μL浓度为0.25 mol/L的Sn(Oct)₂无水甲苯溶液，并以此为催化剂。抽真空除去甲苯溶液，用氮气在真空下置换聚合管中的空气。连续置换3次后，负压下封闭聚合管。将聚合管置于(130±2) ℃的油浴中加热将单体熔化，振荡，使单体与催化剂混合均匀，然后在此温度聚合24 h后撤掉油浴，冷却至室温终止反应。将聚合管砸碎，取出聚四氟管，将棒状聚合物抽出，裁剪成长为1 cm的棒条备用。将No.2部分棒条溶解于氯仿，铺膜，干燥后待用。PTMC均聚物及共聚物的合成路线，见图1，2。

1.4.2 结构表征与物理性能分析 ①PTMC均聚物与共聚物的核磁共振氢谱(¹H NMR)用高分辨超导核磁共振波谱仪在室温下测定，氘代氯仿CDC13为溶剂，以0.5%四甲基硅烷为内标物；②PTMC均聚物与共聚物的分子质量及其分布采用凝胶渗透色谱仪测定，以THF作为流动相(淋洗液)，流速1 mL/min，PTMC均聚物与共聚物的数均分子量(M_n)、重均分子量(M_w)和分子量分散系数(M_w/M_n)，以单分散聚苯乙烯的分子质量或分子量分散系数为标样，在恒温30 ℃下测定；③PTMC均聚物与共聚物的热性能在差示扫描量热仪上进行测试，升温速率为10 ℃/min，降温速率为10 ℃/min，测试温度范围为-100-100 ℃/min，N₂为保护气；④采用热重分析仪对PTMC均聚物与共聚物的热稳定性进行测试，升温速度为20 ℃/min，测试温度范围为38-600 ℃。

1.4.3 体外酶降解实验准确称取所制备的PTMC棒条或膜片样品质量后将其置于1 mL酶溶液中，并置于37 ℃空气浴中，每天振荡8 h，振幅为65次/min。酶溶液每3 d更换1次，以保持酶的活性。PTMC均聚物的棒条状及膜片样品分别于实验后第1，2，4，8，10或12周取出样品，共聚物样品分别于3，6，9，12，15 d后取出样品，用蒸馏水反复冲洗，吸干表面液体，真空干燥至恒质量，进行失重考察。样品的失重率(Mass loss)根据以下公式计算：

m_i-m_d

m_d

×100

式中，m_i、m_d分别为样品的初始质量和干燥后的质量；d_i、d_d分别为样品的初始直径和干燥后的直径。为避免误差，在实验实施过程中每组样品在每个时间点平行操作3个样品，失重率值为3个样品的平均值。

1.5 主要观察指标各样品的失重率、降解速率及降解速率常数。

1.6 统计学分析采用统计学软件SPSS 16.0进行数据统计分析。每个样品平行操作3个样品，计算其失重率的平均值及标准偏差。比较不同分子质量、形状及不同共聚组成样品的降解速率及速率常数分析分子质量、形状、共聚组成对PTMC体外酶解性能的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

目前，很多可生物降解聚合物已被用于医药领域研究，其中PTMC因具有良好的生物降解性、优异的生物相容性已引起广泛的关注。目前，PTMC的体外降解行为已有报道，但国内外关于其体外酶解性能的影响因素及其作用规律的研究较少。文章以分子质量、形状及共聚组成为考察因素，对PTMC的体外酶解行为进行考察，并分析上述因素对PTMC酶解性能的影响及作用规律。结果表明，分子质量、形状及共聚组成对PTMC的体外酶解行为具有显著影响，并可以通过上述因素对PTMC的体外酶解速率进行调控。

PTMC的体外酶速率随着分子质量的增加而增大。当分子质量由135 kDa增大至256 kDa时，PTMC的酶解速率常数由每周1.46%增加至每周3.81%，降解速率显著加速。这可能与PTMC的亲疏水性有关。PTMC的疏水性随分子量的增大而逐渐提高^[24]。据文献报道，脂肪酶在疏水性表面具有更高的活性^[25-26]。由此，脂肪酶更倾向于降解高分子质量的PTMC均聚物，由此导致PTMC的酶解速率常数随分子量的增大而增大；此外，由于PTMC的酶解机制为表面溶蚀降解^[24]，样品表面积对降解行为有很大影响，表面积越大降解速率越快。低分子质量PTMC容易发生蠕变流动，导致样品发生严重形变并进一步导致样品表面积减少^[24]。因此，低分子质量PTMC具有较慢的降解速率。

PTMC的降解行为不仅受其分子质量的影响，样品形状也对其有显著作用。实验将分子质量为256 kDa的PTMC通过溶剂挥发的方法制备成薄膜(id=10 mm，thk=0.5 mm)，并将制得的薄膜与相同分子质量的棒状PTMC一并置于相同条件下进行酶解实验。结果表明，分子质量为256 kDa PTMC棒条的酶解速率常数为每周3.81%，而相同分子量PTMC膜片的酶解速率常数为每周9.16%，膜片样品的降解速率明显大于棒条状样品的降解速率。这是由于膜状与棒状PTMC的表面积存在显著差异所造成的。PTMC膜片表面积约为50 mm²，而棒状PTMC的表面积约为30 mm²。由于PTMC在脂肪酶溶液中的降解机制为表面溶蚀降解，因此降解速率与样品表面积密切相关，表面积越大降解速率越快。因此，相同分子质量的PTMC膜片在脂肪酶溶液中降解更快。同时，尽管分子质量为256 kDa棒状PTMC比分子质量为135 kDa棒状PTMC在脂肪酶溶液中降解的更快，但是分子质量为256 kDa的PTMC膜片比相同分子质量的棒状PTMC在脂肪酶溶液中降解的还要快。该结果表明在体外酶解过程中，样品形状比分子质量对PTMC酶解行为的影响更为显著。

ε-己内酯具有较高的药物渗透性、良好的生物相容性及优异的力学性能，能在体内降解并被机体吸收^[27-28]。由于ε-己内酯是疏水性聚合物且具有较高的结晶度(约为60%)^[29]，在体内降解较慢，很适合应用于长效药物缓释体系，如Capronor^[30-31]。因此，将三亚甲基碳酸酯与ε-己内酯共聚可有效改善PTMC的物理性能并调控其体内外的降解速率^[8^，¹³^，^21]。实验结果表明，PTMC在脂肪酶溶液中降解14 d后的失重率为(9.15±0.10)%，而PTMC共聚物在 15 d的失重率就高达(32.11±0.28)%；同样，分子质量为 256 kDa的PTMC棒条酶解速率常数为每周3.81%，而在其结构中引入等摩尔比的ε-己内酯成分后，PTMCL的酶解速率常数为每周14.49%。PTMC共聚物比PTMC均聚物具有更快的降解速率，即在PTMC主链中引入ε-己内酯成分可显著加速PTMC的降解。这是由于脂肪酶对于酯键的断裂具有更高的催化活性。此外，共聚物的分子链活动性对其降解行为也有一定的影响^[32]。PTMC共聚物中ε-己内酯含量越高共聚物的玻璃化温度Tg越低。较低的Tg可促进聚合物分子链段的运动，这将使分子链及酯键更易于与酶接触，进而导致更快速的降解。同时，与分子质量及样品形状相比较而言，共聚组成对PTMC酶解行为的影响最为显著。因此，实验中各因素对PTMC体外酶解速率的影响程度顺序为共聚组成>样品形状>分子质量。

综上所述，PTMC的体外酶解行为受多种因素影响，在将PTMC应用于临床工作时可根据实际情况，选择合适的分子质量、样品形状或者通过获得不同共聚组成的共聚物等手段来调控PTMC的降解性能，以更好地满足临床应用需求。实验能够为促进PTMC在生物医药领域的广泛应用奠定科学基础和数据支持。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

聚三亚甲基碳酸酯体外酶解性能的影响因素及其作用规律

In vitro enzymatic degradation of poly(trimethylene carbonate): influencing factors and their effects

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