骨形态发生蛋白2和转化生长因子β2协同促进骨髓间充质干细胞成骨分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1519

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
三维立体培养：利用各种方法及材料，使细胞呈空间立体方式生长，更接近于体内生长模式，形成类似体内组织的结构，发挥其功能。细胞三维培养一方面能够为体外培养细胞提供与其组织来源相似甚至相同的细胞生长微环境和细胞联系，从而既有利于各类细胞的定向分化诱导，又有利于细胞分化表型的维持和增殖；另一方面可望在体外构建与各类组织、器官相应的细胞三维生长类似物或等同物。
转化生长因子β2：在细胞的增殖、分化、胚胎发育、胞外基质形成、骨的形成和重建以及肿瘤的抑制和转移扩散等方面起着重要的作用。转化生长因子β2被指出可以抑制白细胞介素2依赖的T细胞生长，并且能抑制肿瘤发展中的免疫监视，因而以一种自分泌的方式促进肿瘤生长。转化生长因子β2可以影响杀伤细胞的活力和降低白细胞介素2、白细胞介素6、白细胞介素10、干扰素γ等细胞因子的表达。

摘要
背景：从细胞及基因水平揭示骨形态发生蛋白2和转化生长因子β2具有协同促进骨髓间充质干细胞成骨分化的机制，为骨细胞的再生提供了实验和理论基础。
目的：探讨过表达骨形态发生蛋白2和转化生长因子β2协同促进骨髓间充质干细胞成骨分化的作用。
方法：通过酶消化法原代培养获取大鼠骨髓间充质干细胞，慢病毒包装骨形态发生蛋白2及转化生长因子β2的重组质粒。将携带目的基因重组质粒的慢病毒转染至第3代骨髓间充质干细胞，MTS实验检测骨髓间充质干细胞的增殖情况，定量PCR检测骨形态发生蛋白2和转化生长因子β2的mRNA表达水平，细胞爬片免疫组化检测二维混合培养条件下成骨分化标志物RUNX2在蛋白水平的表达量，体外三维培养获得的细胞团块经石蜡切片做Vonkossa染色(银染)定量分析成骨分化的阳性区域及表达强度。
结果与结论：①转染骨形态发生蛋白2及转化生长因子β2的骨髓间充质干细胞的增殖能力与未转染的骨髓间充质干细胞相比差异无显著性意义(P > 0.05)；②转染后骨髓间充质干细胞的骨形态发生蛋白2及转化生长因子β2 mRNA水平高于未转染的骨髓间充质干细胞，差异有显著性意义(P < 0.05)；③体外二维培养条件下细胞爬片RUNX2免疫组化及体外三维培养石蜡切片Vonkossa染色均发现共转染组骨髓间充质干细胞的成骨分化能力强于单独转染组(P < 0.05)；④结果表明，慢病毒携带骨形态发生蛋白2和转化生长因子β2的重组质粒过表达具有协同促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2845-4085(常晓朋)

关键词: 骨髓间充质干细胞, 骨形态发生蛋白2, 转化生长因子β2, 慢病毒, RUNX2, 成骨分化, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: It is revealed from the cell and gene level that bone morphogenetic protein 2 (BMP2) and transforming growth factor β2 (TGFβ2) synergistically promote the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, providing an experimental and theoretical basis for the bone regeneration.
OBJECTIVE: To investigate the overexpression of BMP2 and TGFβ2 in vitro to synergistically promote the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Primary rat bone marrow mesenchymal stem cells were obtained by enzymatic digestion. Recombinant plasmids of BMP2 and TGFβ2 were packaged by lentivirus. The lentivirus carrying the recombinant plasmids of the target genes BMP2 and TGFβ2 was transfected into the third generation of bone marrow mesenchymal stem cells. MTS (cell proliferation assay) was used to detect the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells in different treatment groups at different time points. Quantitative PCR was used to detect the overexpression of BMP2 and TGFβ2 at mRNA levels. Immunohistochemistry of cell slides was performed to detect the expression level of osteogenic differentiation marker RUNX2 at the protein level under two-dimensional mixed culture conditions. The cell pellet obtained by three-dimensional culture in vitro was subjected to paraffin sectioning for Vonkossa staining (silver staining) to determine the positive region and expression intensity of osteogenic differentiation, and quantitative analysis was performed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells transfected with BMP2 and TGFβ2 was not statistically different from that of untransfected cells (P > 0.05). (2) The BMP2 and TGFβ2 mRNA levels were significantly higher in the transfected cells than untransfected ones (P < 0.05). (3) RUNX2 immunohistochemistry under the in vitro two-dimensional culture conditions and Vonkossa staining under the in vitro three-dimensional culture showed that the BMP2 and TGFβ2 co-transfected bone marrow mesenchymal stem cells had stronger osteogenic ability than BMP2 or TGFβ2 alone transfected cells (P < 0.05). In conclusion, the overexpression of recombinant plasmids of BMP2 and TGFβ2 carried by lentivirus synergistically promotes the osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Bone Morphogenetic Proteins, Transforming Growth Factor beta2, Tissue Engineering

中图分类号:

常晓朋，陈涛，赵寅，梁明. 骨形态发生蛋白2和转化生长因子β2协同促进骨髓间充质干细胞成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(1): 1-6.

Chang Xiaopeng, Chen Tao, Zhao Yin, Liang Ming. Synergistic effect of bone morphogenetic protein 2 and transforming growth factor beta2 on osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(1): 1-6.

图/表（结果） 5

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学实验。

1.2 时间及地点 2017年5月至2018年5月在郑州大学附属郑州中心医院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF级SD大鼠40只，6周龄，雌雄各半，体质量约180 g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物机构许可证：SCXK(京)2017-0001，动物批号0275635。

1.3.2 实验试剂和仪器 DMEM培养基、优质胎牛血清(美国Gibco公司)；Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶(美国Sigma公司)；Ⅰ型胶原蛋白一抗(北京中山金桥公司)；RNA提取试剂盒、反转录反应试剂盒、qRT-PCR反应试剂盒(日本Takara公司)；CO₂细胞培养箱(美国Thermo Fisher公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs SD大鼠脱臼处死，无菌条件下分离双下肢，低糖DMEM培养液冲出骨髓，离心弃上清液，以含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养液重悬，以1×10⁹L^-1细胞浓度接种于底面积为25 cm²的培养瓶中，于37 ℃、体积分数为5%的CO₂培养箱中培养，24 h后换液，以后每3 d换液1次，待贴壁细胞融合率达到80%时，按1∶2 比例传代。

1.4.2 慢病毒包装及转染 应用经典的三质粒共转染293包装细胞的方法。胰酶消化293细胞后将其传代入225 cm²的培养皿中，细胞数量为5×10⁶个。在转染前1 h，更换一半新鲜的细胞培养液，将23 μg目的慢病毒质粒和23 μg两个帮助质粒加入4 mL浓度为300 mmol/L的氯化钙溶液中，将这些溶液均匀加入到293细胞的培养液中。转染3 d后，收集细胞悬液，反复冻融细胞悬液来收集病毒载体。

当原代培养的BMSCs在含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液中培养至85%融合时，分别将病毒滴度约为1×10¹⁵TU/L的Lenti-BMP2，Lenti-TGFβ2和Lenti-GFP病毒悬液加入细胞的培养液中，感染复数为1×10⁸。转染48 h，更换新鲜的含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液。

1.4.3 MTS检测细胞增殖能力 将第2代转染BMP2、TGFβ2的BMSCs及未转染的BMSCs消化计数，按5×10³/孔接种于96孔板，每孔100 μL，铺板后第1，2，3，4，5，6，7天分别向每孔加入20 μL MTS混合液(MTS∶PMS=20∶1)，3 h后用酶标仪在490 nm波长处检测吸光度值，用GraphPad Prism 5绘图并进行统计学分析。

1.4.4 qRT-PCR检测BMP2和TGFβ2的mRNA表达 将转染GFP、BMP2、TGFβ2的BMSCs及未转染的BMSCs用反转录试剂盒提取RNA，并用分光光度仪检测RNA浓度，RNA定量后通过反转录试剂盒反转录为cDNA，然后以20 μL反应体系进行qPCR反应。引物序列见表1。

1.4.5 细胞爬片免疫组化染色检测RUNX2的表达 取24孔板接种的5种细胞(转染GFP、BMP2、TGFβ2、BMP2+TGFβ2的BMSCs及未转染的BMSCs)，40 g/L多聚甲醛固定，PBS冲洗3次，然后用TritonX-100室温通透20 min，滴加正常山羊血清室温封闭1 h，RUNX2蛋白一抗孵育过夜，PBS冲洗3次，然后加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，PBS冲洗3次，DAB显色，苏木精复染，脱水透明封固，Image J定量分析软件对阳性细胞作定量分析。

1.4.6 细胞3D培养 当上述5种细胞培养至汇合率80%时，PBS冲洗3次，0.25%胰蛋白酶消化4 min，加入8 mL小牛血清终止消化，混匀吹打，计数，每个离心管细胞数为2.5×10⁵个，加入1 mL成骨诱导分化细胞培养基(含200 μg/L骨形态发生蛋白4)，混匀后2 000 r/min离心5 min，置于体积分数为5%CO₂的细胞培养箱中培养，每隔2 d或3 d更换1次培养基。

1.4.7 Vonkossa染色观察成骨分化能力 上述细胞团块3D培养至21 d后收集标本，用石蜡包埋细胞团块，切片后用硝酸银染色。具体步骤：取石蜡切片，蒸馏水稍洗，2%硝酸银溶液浸染16 h，快速用蒸馏水冲洗数次，加入氨银溶液，浸染20 min，快速用蒸馏水冲洗数次，梯度乙醇脱水，二甲苯透明封固，Image J定量分析软件对阳性细胞作定量分析。

1.5 主要观察指标 ①原代细胞培养的BMSCs形态；②定量PCR检测转染后BMSCs中基因的过表达情况，MTS检测转染后BMSCs的增殖情况；③3D混合培养细胞团块成骨分化的Vonkossa染色阳性区域面积百分比；④3D混合培养条件下细胞团块成骨分化标志物RUNX2 mRNA表达。

1.6 统计学分析 所有实验均重复3次以上，计量资料数据均采用x(_)±s表示。应用SPSS 20.0统计学软件进行相关的统计分析，组间比较采用成对t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

股骨头坏死是骨科临床的常见病和多发病，是一种退行性疾病，病情进展可以引起软骨下骨和关节面软骨的塌陷^[11-12]，临床症状多表现为髋关节疼痛、不同程度的功能障碍，严重影响患者的生活质量和劳动能力^[13-15]。疾病的早期外科治疗方法包括股骨头钻孔减压术、坏死骨组织刮除术加活骨植入术、带血管蒂的骨瓣移植术等^[16-17]，晚期治疗主要采用关节置换术。随着基因治疗技术的进展，应用相关病毒携带目的基因治疗骨科疾病已经应用于临床研究^[18-20]。该研究希望通过基因治疗技术联合应用Lenti-BMP2和Lenti-TGFβ2协同促进BMSCs的成骨分化，寻找治疗股骨头坏死的新方法，为保留患者股骨头或延缓甚至避免人工关节置换探索新的治疗方法提供理论及实验依据。

BMSCs是骨组织工程重要的种子细胞来源^[21-22]。在成骨诱导因子的作用下，BMSCs具有分化为骨、软骨、肌肉和脂肪的能力。基因治疗和转基因技术的发展为构建稳定的BMSCs微环境，延缓种子细胞的老化进程，促进细胞的增殖和分化等问题提供了可行的手段^[23-25]。

骨形态发生蛋白属于转化生长因子β超家族，在顺序级联中启动软骨和骨形成^[26]。研究证实BMP2通过腺病毒基因整合至细胞体内产生了足够的骨形成相关蛋白来治愈节段性骨缺损^[27-28]。在BMP家族成员中，BMP2在体内具有最高的骨诱导活性^[29]。该研究发现BMP2转染的BMSCs与单独BMSCs相比，表达BMP2的BMSCs成骨分化能力得到增强。尽管成骨因子BMP2在诱导骨形成期间非常重要，但骨再生是一个非常复杂的过程，其涉及许多生长因子。TGFβ2是最具特征的成骨分化因子，在骨愈合和骨骼发育中至关重要^[30-31]。研究表明，TGFβ2可刺激骨髓间充质干细胞增殖^[32]。国内对TGFβ2成骨分化的研究也比较多，胡正雄等^[33]发现TGFβ2可促进BMSCs增殖和诱导其向成骨细胞分化；gene X可促进BMSCs向成骨细胞分化，且在细胞因子TGFβ2联合作用下成骨分化作用更明显，TGFβ2能增加蛋白质和胶原的产生而促进形成骨基质，证实了TGFβ2具有诱导成骨潜力。TGFβ2在刺激骨祖细胞增殖时，还可诱导ERI丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性，从而促进骨祖细胞向成骨细胞的分化^[34]。

研究发现BMP2或者TGFβ2单独应用可以促进BMSCs成骨分化，但是联合应用这两种细胞因子的研究较少。该研究通过定量分析发现体外二维培养条件下共转染BMP2和TGFβ2的BMSCs的成骨分化标志物表达量明显高于单独转染的BMSCs。通过定量分析发现共转染BMP2和TGFβ2的BMSCs在三维培养条件下钙盐沉积阳性区域面积明显高于单独转染的BMSCs，单独转染任一种基因的BMSCs钙盐沉积阳性区域面积明显高于未转染的BMSCs，可能的机制为：①共转染BMP2和TGFβ2的BMSCs增殖能力比另外3组强，细胞凋亡较少；②共转染BMP2和TGFβ2的BMSCs成骨分化的标志物RUNX2表达量比另外3组多，相应的成骨分化能力强，可以诱导更多的BMSCs分化为成骨细胞；③TGFβ2促进骨祖细胞向成骨细胞分化并诱导钙盐的沉积。同时应用三维培养技术是一种新的培养细胞方式，三维培养技术能在细胞培养过程中为BMSCs提供更加接近体内的环境，这种技术在基础实验研究中极大地提高了细胞实验的精准性。

该研究的创新之处在于首次提出联合应用BMP2和TGFβ2可以产生协同促进BMSCs成骨分化的作用，BMP2促进BMSCs向成骨细胞方向分化，同时在TGFβ2的诱导作用下让骨祖细胞向成骨细胞分化。该研究通过基因改造BMSCs，为骨缺损的治疗特别是股骨头坏死提供更加优质的种子细胞，将产生巨大的经济和社会价值。

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