miR1-2诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化过程中的Wnt/β-catenin信号通路

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1503

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
MicroRNA：是由内源基因编码的内源性非编码单链RNA分子，在许多生物学过程中参与转录后基因表达调控，包括调节细胞增殖、凋亡和衰老，以及心脏的发育和心肌的再生。大多数miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇的形式存在于基因组中。
Wnt信号通路：1982年在小鼠乳腺癌发现了Wnt基因，由于此基因激活依赖小鼠乳腺癌相关病毒基因的插入，因此，当时被命名为Int1基因。之后的研究表明，Int1基因在小鼠正常胚胎发育中起重要作用，可控制胚胎的轴向发育。此后大量研究提示了Int1基因在神经系统胚胎发育中的重要性，因此将Wingless与Int1结合，称为Wnt基因。在胚胎发育中，Wnt基因调控的重要信号传导系统即为Wnt通路。其参与大脑的形成、参与生长锥的重建和多突触球状环(苔状神经纤维与颗粒细胞相接触时)的形成、参与脊椎动物的肢体起始和顶端外胚层脊的形成、调控EMT的信号通路等。

摘要
背景：骨髓间充质干细胞具有向心肌细胞分化的潜能，但其分化率较低，且其分化机制尚不完全明确。
目的：探讨miR1-2在小鼠骨髓间充质干细胞分化成心肌样细胞中的作用，揭示此过程中涉及的信号通路。
方法：用miR1-2和5-氮杂胞嘧啶处理小鼠骨髓间充质干细胞。通过qPCR检测心肌细胞标志物GATA4在骨髓间充质干细胞中的表达。流式细胞术检测细胞凋亡率，并通过测定该信号通路的上游蛋白评价Wnt/β-catenin信号通路的活性。
结果与结论：①miR1-2模拟物转染骨髓间充质干细胞24 h后，miR1-2在骨髓间充质干细胞中的表达显著增加。miR-2模拟物处理48 h后，骨髓间充质干细胞的凋亡率无显著差异；②转染miR1-2模拟物48 h后，与对照组相比，GATA4的表达随着时间的延长显著增加，处理72 h后，这些基因在miR1-2组中的表达显著高于5-氮杂胞嘧啶组和对照组；③与miR1-2-mimics-NC相比，用miR1-2模拟物处理后，β-catenin和Wnt11的mRNA和蛋白相对表达均显著增加，而添加Wnt/β-catenin信号通路抑制剂LGK-974后，β-catenin和Wnt11的相对表达量均显著降低；④结果提示，骨髓间充质干细胞中miR1-2可以更有效地诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化，并且与Wnt/β-catenin信号通路活性有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-8346-1106(高维)

关键词: miR1-2, 骨髓间充质干细胞, 心肌细胞分化, Wnt /β-catenin信号通路, 5-氮杂胞嘧啶, 凋亡率, GATA-4, 细胞转染, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) have the potential to differentiate into cardiomyocytes, but exhibit a low differentiation rate. Moreover, its differentiation mechanism is still unclear.
OBJECTIVE: To investigate the role of miR1-2 in the differentiation of mouse BMSCs into cardiomyocytes and to reveal the signaling pathways involved in this process.
METHODS: Mouse BMSCs were treated with miR1-2 and 5-azacytosine. The cardiomyocyte marker GATA4 in BMSCs was detected by qPCR. Apoptosis in BMSCs was detected by flow cytometry and the activity of Wnt/β-catenin signaling pathway was evaluated by measuring the upstream protein of this signal pathway.
RESULTS AND CONCLUSION: After 24 hours of transfection with miR1-2 mimics, the expression of miR1-2 in BMSCs was significantly increased. After 48 hours of transfection with miR-2 mimics, there was no significant difference in the apoptotic rate of BMSCs. After 48 hours of transfection with miR1-2 mimics, the expression of GATA4 increased significantly with time. After 72 hours of transfection with miR1-2 mimics, the expression of these genes was significantly higher in the miR1-2 group than in the 5-azacytosine group and the control group. Compared with miR1-2-mimics-NC, treatment with miR1-2 mimics could significantly increase the relative expression of β-catenin and Wnt11 at mRNA and protein levels, while addition of Wnt/β-catenin pathway inhibitor LGK-974 reduced the relative expression of β-catenin and Wnt11. To conclude, miR1-2 in BMSCs has the potential to effectively induce the differentiation of BMSCs into cardiomyocytes via the Wnt/β-catenin pathway.

Key words: Mesenchymal Stem Cells, Myocytes, Cardiac, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

高维，李文薇，任增福，陈诗芸. miR1-2诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化过程中的Wnt/β-catenin信号通路[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(1): 7-12.

Gao Wei, Li Wenwei, Ren Zengfu, Chen Shiyun. miR1-2 induces the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into cardiomyocytes via Wnt/beta-catenin signal pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(1): 7-12.

图/表（结果） 3

2.1 5-氮杂胞嘧啶和miR1-2处理的骨髓间充质干细胞中miR1-2的表达水平 使用5-氮杂胞嘧啶处理骨髓间充质干细胞后，发现miR1-2的表达在24 h没有变化，但是在5-氮杂胞嘧啶干预后48 h显著增加了1倍，在72 h显著增加了2.5倍，这表明miR1-2在5-氮杂胞嘧啶诱导的骨髓间充质干细胞分化成心肌细胞过程中高度表达，见图1A。然后，将miR1-2模拟物转染骨髓间充质干细胞，处理24 h后，miR1-2在骨髓间充质干细胞中的表达显著增加，虽然miR1-2的水平随时间下降，但仍然高于转染72 h后的对照组，见图1B，表明miR1-2模拟介导骨髓间充质干细胞中miR1-2的表达。

2.2 5-氮杂胞嘧啶和miR-1模拟物对骨髓间充质干细胞凋亡的影响 通过研究5-氮杂胞嘧啶和miR1-2模拟治疗是否能诱导细胞凋亡。

流式细胞术分析显示，在5-氮杂胞嘧啶和miR-2模拟物处理48 h后，骨髓间充质干细胞的凋亡率没有显著差异。然而，5-氮杂胞嘧啶处理72 h后，细胞凋亡率显著增加，而不是miR1-2mimics组，表明与5-氮杂胞嘧啶不同，miR1-2不诱导细胞凋亡，见图2。

2.3 miR1-2的高度表达诱导骨髓间充质干细胞中心脏特异性基因的表达 为了确定骨髓间充质干细胞中miR1-2的过度表达是否能诱导这些细胞分化成心肌细胞，使用qPCR检测心脏特异性基因GATA4的表达水平。数据表明，GATA4的表达在5-氮杂胞嘧啶处理48 h后显著增加，但是72 h后GATA4的表达与对照组相比没有显著增加。在转染miR1-2模拟物48 h后，与对照相比，GATA4的表达随着时间的延长也显著增加，处理72 h后，这些基因在miR1-2模拟物处理组中的表达显著高于5-氮杂胞嘧啶组和对照组，见图3。这些结果表明，过表达miR1-2可以通过增加心脏基因的表达水平诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化。

2.4 高表达miR1-2激活Wnt/β-catenin信号通路 为了确定miR1-2的过度表达是否通过Wnt/β-catenin信号通路诱导小鼠骨髓间充质干细胞的心脏分化。为此，实验检测了miR1-2模拟物处理后骨髓间充质干细胞中Wnt/β-catenin信号通路上游蛋白β-catenin和Wnt11的转录水平。结果显示，与miR1-2-mimics-NC相比，用miR1-2模拟物处理后，β-catenin和Wnt11的相对表达均显著增加，见图4。这些结果表明Wnt信号通路可能在miR1-2诱导的骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化过程中发挥重要作用。

2.5 miR1-2通过Wnt/β-catenin信号传导激活诱导心肌细胞分化 为了研究miR1-2的高表达诱导的心脏特异性基因的增加水平是否通过Wnt信号传导，使用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂LGK-974来抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活。结果显示，miR1-2模拟物处理后，β-catenin和Wnt11的相对表达量均显著增加，而添加LGK-974后，β-catenin和Wnt11的相对表达量均显著降低，见图5。与qPCR分析结果相一致，Western blot分析也证实经72 h处理后，骨髓间充质干细胞增加了GATA4蛋白的表达，Wnt抑制剂处理后，与没有Wnt抑制剂处理的miR1-2模拟物组相比，GATA4的蛋白质表达显著降低，见图6。

参考文献

[1] 牛丽丽,裴雪涛.骨髓间充质干细胞在心血管疾病治疗中的应用[J].中华内科杂志,2003,42(3):208-210.

[2] 巫洪坤,梁贵友.间充质干细胞治疗心血管疾病的研究进展[J].医学综述, 2015,21(14):2538-2541.

[3] 邹琪,张新超.诱导性多潜能干细胞在心血管疾病中的应用[J].中国心血管杂志,2015(4):313-316.

[4] 王宏茂,邱彬,邓然,等.胚胎干细胞对孕鼠缺血受损心肌的修复作用[J].中国实验动物学报,2016,24(2):127-133.

[5] 贺继刚,严丹,王平,等.GATA-4在心肌损伤修复中的作用机制研究进展[J].医学综述,2015,21(22):4033-4036.

[6] Singh A, Singh A, Sen D. Mesenchymal stem cells in cardiac regeneration: a detailed progress report of the last 6 years (2010-2015). Stem Cell Res Ther. 2016;7(1):82.

[7] 贾晓静,韩艳,潘晋兵.骨髓间充质干细胞通过血管生成作用治疗慢性肾疾病的研究进展[J].国际泌尿系统杂志,2016,36(2).

[8] 叶勖,王兴兵,汪健,等.MicroRNA-146a对人骨髓间充质干细胞分化能力的影响[J].中国实验血液学杂志,2016,24(2):596-601.

[9] 邵帅,周晨红,徐丽丽.体外诱导骨髓与脐血间充质干细胞向成骨细胞分化及其成骨活性的比较[J].中国组织工程研究, 2015,19(23):3652-3657.

[10] 郑蕊,廖承德,丁莹莹.体外诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的研究进展[J].现代肿瘤医学,2015(7):1027-1029.

[11] Makino S, Fukuda K, Miyoshi S, et al. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro. J Clin Invest. 1999;103(5):697-705.

[12] 孟春风,戴冬秋,郭科军.5-氮杂-2’-脱氧胞苷和曲古抑菌素A对卵巢癌顺铂耐药细胞中hMLH1表达及DNA甲基化的影响[J].癌症, 2008,27(12):1251-1255.

[13] 顾忆,李小曼,郑禄枫,等.MicroRNA-10b调控乳腺癌细胞生长增殖与凋亡的研究[J].中国药科大学学报,2015,46(2):242-249.

[14] 金向宇,洪卫.microRNA-34a在肺癌细胞凋亡中的作用[J].中华全科医学, 2016,14(6):940-943.

[15] 陈宏,陈群,齐鑫,等.microRNA-184在小儿先天性心脏病中的表达及其与心肌细胞的关系[J].医学分子生物学杂志, 2017,14(1):18-21.

[16] 王颖,王雷.微小RNA参与心肌缺血再灌注损伤的作用机制及研究进展[J].心血管病学进展,2017,38(4):434-438.

[17] Sluijter JPG, Mil AV, Vliet PV, et al. MicroRNA-1 and -499 regulate differentiation and proliferation in human-derived cardiomyocyte progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2010;30(4):859.

[18] Takaya T, Ono K, Kawamura T, et al. MicroRNA-1 and MicroRNA-133 in spontaneous myocardial differentiation of mouse embryonic stem cells. Circ J. 2009;73(8):1492.

[19] Kirby TJ, Chaillou T, Mccarthy JJ. The role of microRNAs in skeletal muscle health and disease. Front Biosci. 2015;20(1):37.

[20] 邓海燕,曾俊义,魏云峰,等.microRNA-1诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化过程中Notch信号分子的表达变化[J].基础医学与临床, 2014,34(9):1204-1210.

[21] 张怡,赵连三,唐红.小鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养[J].生物医学工程学杂志,2004,21(5):746-748.

[22] 朱淑霞,宋治远,罗向东,等.体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究[J].第三军医大学学报, 2005,27(15):1555-1557.

[23] Jiang X, Hao HX, Growney JD, et al. Inactivating mutations of RNF43 confer Wnt dependency in pancreatic ductal adenocarcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(31):12649.

[24] Arminan A, Gandia CM. Cardiac differentiation is driven by NKX2. 5 and GATA4 nuclear translocation in tissue-specific mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 2009;18(6):907-918.

[25] 范丽君,肖倩蓉,林凯桑,等.大鼠脂肪干细胞和骨髓间充质干细胞向内皮分化的能力比较[J].南方医科大学学报, 2016,36(9):1247-1254.

[26] Glass C, Singla DK. MicroRNA-1 transfected embryonic stem cells enhance cardiac myocyte differentiation and inhibit apoptosis by modulating the PTEN/Akt pathway in the infarcted heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2011;301(5):2038-2049.

[27] White RA, Dowler LL, Pasztor LM, et al. Assignment of the transcription factor gata4 gene to human chromosome 8 and mouse chromosome 14:Gata4, is a candidate gene for Ds, (Disorganization). Genomics. 1995;27(1):20-26.

[28] Perrino C, Rockman HA. GATA4 and the two sides of gene expression reprogramming. Circ Res. 2006;98(6):715.

[29] Zhou P, He A, Pu WT. Chapter five–Regulation of GATA4 Transcriptional Activity in Cardiovascular Development and Disease. Curr Top Dev Biol. 2012;100:143-169.

[30] Wang X, Luo E, Bi R, et al. Wnt/β-catenin signaling is required for distraction osteogenesis in rats. Connect Tissue Res. 2018;59(1):45-54.

[31] Geng R, Noda T, Mulvaney JF, et al. Comprehensive expression of wnt signaling pathway genes during development and maturation of the mouse cochlea. PLoS One. 2016;11(2):e0148339.

[32] Gwak J, Sun GH, Park HS, et al. Small molecule-based disruption of the Axin/lβ-catenin protein complex regulates mesenchymal stem cell differentiation. Cell Res. 2012;22(1):237-247.

[33] 张建康,卫俊俊,唐曌隆,等.Wnt和Notch通路在老龄个体骨髓间充质干细胞成骨中的调控[J].国际口腔医学杂志, 2017,44(4):459-465.

[34] 张成,章少中,张亚洲,等.诱导心脏肌成纤维细胞向心肌样细胞转分化的miRNA[J].中国组织工程研究,2013,17(45):7924-7931.

[35] Wang T, Xu Z. miR-27 promotes osteoblast differentiation by modulating Wnt signaling. Biochem Biophys Res Commun. 2010;402(2):186-189.

[36] Wang J, Guan X, Guo F, et al. miR-30e reciprocally regulates the differentiation of adipocytes and osteoblasts by directly targeting low-density lipoprotein receptor-related protein 6. Cell Death Dis. 2013;4(10):e845.

引言

目前，将干细胞用于治疗心血管疾病是一种潜在的治疗方法，据报道胚胎干细胞能够修复损伤的心肌并表现出强大的治疗潜力^[1-5]。此外，骨髓间充质干细胞具有许多重要的生物学特性，如血管生成、抗凋亡、抗纤维化、抗炎和免疫抑制等作用^[6-7]。实际上，骨髓间充质干细胞由于具有多种分化能力，可以转化为多种细胞类型，如心肌细胞、成骨细胞、内皮细胞、神经元和脂肪细胞等^[8-10]。尽管骨髓间充质干细胞在心脏修复中的作用广为关注，但仍存在许多问题，比如骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的能力较差。据报道，骨髓间充质干细胞暴露于5-氮杂胞嘧啶后能够转分化为心肌样细胞，然而5-氮杂胞嘧啶是一种外源化学试剂，会引起细胞损伤^[11-12]。因此，寻找一种安全的诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的方法至关重要。

MicroRNA(miR)是内源性非编码RNA，它们在许多生物学过程中具有重要的调节功能，包括调节细胞增殖、凋亡和衰老^[13-14]。此外，其还参与了心脏的发育和心肌的再生^[15-16]。最近，越来越多的证据表明，miRNA与干细胞分化密切相关，据报道，在心脏祖细胞中，miR1和miR499的过度表达通过抑制HDAC4或Sox6来降低细胞增殖速度并增强分化^[17]。分化的胚胎干细胞中的miR1和miR133水平均显著升高，而miR1能够促进胚胎干细胞向心脏细胞分化，然而，miR133可能会阻断肌原细胞的分化^[18]。在哺乳动物中，miR1有2个拷贝，一个是miR1-1，主要与骨骼肌发育有关，一个是miR1-2，主要参与心肌发育^[19]。由此推测miR1-2在骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化过程中起主要作用。

此外，miR1能够调节心肌发生，并通过下调Notch或STAT3信号通路来维持肌肉基因的表达^[20]。而Wnt信号通路在组织再生或多能干细胞向心肌细胞的分化过程中发挥重要作用，但miR1-2在骨髓间充质干细胞分化成心肌细胞中的作用尚未完全揭示。因此，为了确定miR1-2是否影响小鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化，在当前研究中，通过使用miR1-2模拟物转染小鼠骨髓间充质干细胞，并检测骨髓间充质干细胞中心脏特异性基因GATA4以及Wnt/β-catenin信号通路上游蛋白β-catenin和Wnt11的表达情况，以期揭示miR1-2在骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化中的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 于2016年3月至2017年4月在昆明医科大学海源学院形态学实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 5周龄雄性C57BL/6小鼠，1只，体质量18 g，购自重庆医科大学实验动物中心，许可证号：SYXK2012-0001。

1.3.2 实验主要仪器与试剂 MesenCult基础培养基购自北京诺为生物技术有限公司；胎牛血清、DMEM培养基、青霉素、链霉素均购自北京清大天一科技有限公司；GATA4、Wnt11、β-catenin和5-氮杂胞嘧啶购自Sigma-Aldrich公司；Lipofectamine 2000、二甲基亚砜购自上海泽迈生物技术有限公司；miR1-2和miR1-2- NC模拟物购自生工生物工程(上海)股份有限公司；LGK-974购自美国Apexbio公司；Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒购自上海博谷生物科技有限公司；BD FACSCalibur流式细胞仪购自济南腾览仪器有限公司；miRNA qPCR检测试剂盒和mRNA qPCR检测试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离和体外培养^[21] 从C57BL/6小鼠分离和培养骨髓间充质干细胞。使用200 mg/kg三溴乙醇腹腔注射，对小鼠进行麻醉。麻醉后，迅速分离小鼠股骨，然后从股骨骨髓腔中抽取骨髓抽吸物，将抽取物放入具有间充质干细胞刺激补充剂的MesenCult基础培养基烧杯中并分离骨髓细胞。将骨髓细胞用含有体积分数10%胎牛血清、青霉素(100 UmL)、链霉素(100 mg/L)的DMEM培养基在体积分数5%CO₂环境中培养。48 h后小心去除未贴壁的细胞并更换新鲜的培养基。当原代培养达到90%-95%融合时，将培养物在室温(25 ℃)下用0.5 mL 的0.25%胰蛋白酶(含有0.02%乙二胺四乙酸)处理1 min。第3-5代培养的骨髓间充质干细胞用于实验。

1.4.2 骨髓间充质干细胞转染 将骨髓间充质干细胞接种于60 mm³培养皿中，并如先前报道的方法用5 μmol/L 5-氮杂胞嘧啶处理以诱导心肌细胞分化^[22]。然后，通过Lipofectamine 2000转染50 nmol/L的miR1-2模拟物[正向(5'-3')：ACA UAC UUA UCU UAC UGU CCA UA，反向(5'-3')：UGG UAA AGA GUA CAU GUU AGU AU]到骨髓间充质干细胞中，并在骨髓间充质干细胞中过表达miR1-2。同样，miR1-2模拟物的阴性对照[模拟物miR1-2- NC，NC-正义链(5'-3')：UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT，NC-反义链(5'-3')：ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT]作为对照被转染，同时，用二甲基亚砜处理的骨髓间充质干细胞也用作为对照。miR1-2模拟转染后4 h将1 μmol/L LGK-974加入到骨髓间充质干细胞中，如参考文献[23]所述方式抑制WNT/β-catenin信号传导途径活性。在37 ℃、体积分数5%CO₂的潮湿空气中孵育24，48和72 h后收集细胞。分组处理情况如下：5-氮杂胞嘧啶组采用5 μmol/L 5-氮杂胞嘧啶处理；miR1-2-mimics组采用50 nmol/L的miR1-2模拟物处理；miR1-2-mimics NC组采用miR1-2阴性对照模拟物miR1-2-NC处理；miR1-2-mimics+LGK-974组在miR1-2模拟转染4 h后采用1 μmol/L LGK-974处理；对照组采用二甲基亚砜处理。

1.4.3 细胞凋亡测定 使用Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。在用5-氮杂胞嘧啶和miR1-2模拟物在48和72 h温育后，用胰蛋白酶消化细胞并用PBS洗涤2次，并重新悬浮于浓度为(0.25-1.0)×10¹⁰L^-1的膜联蛋白V结合缓冲液。用5 μL FITC/膜联蛋白V和10 Μl PI染色悬浮液(100 μL)，将细胞轻轻涡旋并在25 ℃的黑暗中温育15 min。随后，将400 μL膜联蛋白V结合缓冲液加入到每个管中，然后通过BD FACSCalibur流式细胞仪进行分析。

1.4.4 Real-time PCR检测GATA4、Wnt11和β-catenin的mRNA表达 Real-time PCR检测miR1-2、GATA结合蛋白4(GATA4)、Wnt11和β-catenin的mRNA水平。首先，分离总RNA并反转录为cDNA。然后采用miRNA qPCR试剂盒和mRNA qPCR试剂盒进行qPCR。引物序列如下：β-catenin正向5'-GCA GTG AAG AAT GCA CAC GA-3'，反向5'-CAA GCA AAG TCA GCA CCA CT-3'。GAPDH正向5'-ACC TGA CCT GCC GTCT AGA A-3'，反向5'-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3'。U6正向5'-CCT GCG CAA GGA TGA C-3'，反向5'-GTG CAG GGT CCG AGG T-3'。Wnt11正向5'-CCA AAT CTC TGC CCT CCT CA-3'，反向5'-CCT CAC CCT TTG ACC AAC AGA-3'。GATA4正向5'-TCT CAC TAT GGG CAC AGC AG-3'，反向5'-GCG ATG TCT GAG TGA CAG GA-3'。参数如下：94 ℃预变性2 min、40个循环的94 ℃变性10 s、60 ℃退火35 s。基因表达的相对倍数变化通过2^-ΔΔCt(Ct：循环阈值)方法进行评估。miR1-2标准化为U6(内参基因) snRNA。将β-catenin、GATA4和Wnt11标准化为GAPDH (内参基因)。

1.4.5 Western blot法检测GATA4蛋白的表达 将含有等量蛋白质(30 μg)的每个样品和RIPA裂解液混合，总体积为100 μL，然后加入5×LoadingBuffer 20 μL，充分混合后在95 ℃煮沸5 min，于-20 ℃保存。然后制备SDS-PAGE胶，加入制备的样品后进行电泳分离，60 V恒压电泳30 min左右至跑完浓缩胶，再用120 V电压电泳60 min。将分离胶转移到PVDF膜上，200 mA恒流湿转90 min，然后将PVDF膜浸于PBST配制5%脱脂奶粉溶液中，并于摇床上轻摇60 min。将PVDF膜浸入PBST稀释的GATA4抗体中，4 ℃孵育过夜。然后用PBST洗涤3次，并与辣根过氧化物酶标记的二抗溶液(1∶1 000)室温孵育1 h进行GATA4(1∶1 000)表达的免疫印迹和检测。PBST洗涤3次后使用增强化学发光法显示免疫反应条带，蛋白条带灰度值采用Image J软件进行分析，灰度值计算为GATA4/β-catenin的比值。

1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞中miR1-2的表达水平；②骨髓间充质干细胞凋亡率；③骨髓间充质干细胞中心脏特异性基因GATA4的表达、Wnt/β-catenin信号通路上游蛋白β-catenin和Wnt11的表达。

1.6 统计学分析 使用SPSS 18.0软件进行统计分析，数据表示为x(_)±s。2组间比较采用t 检验，3组及以上数据比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

有研究表明骨髓间充质干细胞能够分化成心肌细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞^[24-25]。在当前研究中发现用miR1-2模拟物处理的骨髓间充质干细胞显示心脏特异性标记物GATA4的表达增加，心脏特异性标志物的水平显著高于5-氮杂胞嘧啶组。此外，miR1-2模拟物组的凋亡率显著低于5-氮杂胞嘧啶组。Glass等^[26]也报道miRNA1转染的胚胎干细胞可以通过调节梗死心脏中的PTEN/Akt通路来抑制凋亡。转录因子GATA4是人类由GATA4基因编码的蛋白质，该基因编码锌指转录因子GATA家族的成员。GATA4蛋白质被认为是调节参与胚胎发生和心肌分化和功能的基因，研究显示，该基因的突变与心脏间隔缺损以及生殖缺陷有密切关系^[27]。GATA4是哺乳动物心脏发育的关键转录因子，对胚胎的存活至关重要。GATA4在胚胎和成人心肌细胞中均有表达，其在许多心脏基因中起着转录调节剂的作用，并且还调节心脏的肥大性生长。研究显示，GATA4促进心脏形态发生和心肌细胞存活，并在成人心脏中具有维持心脏功能的作用^[28]。而GATA4基因的突变或缺陷可导致多种心脏问题，包括先天性心脏病、和心室缺陷以及心室肌发育不全等。GATA4不仅对心脏发育很重要，而且对哺乳动物胎儿卵巢的发育和功能也有重要作用，并有助于胎儿雄性性腺发育，突变可能导致生殖发育缺陷。从GATA4缺失的异常可以看出，GATA4在胎儿发育过程中的心肌分化、心脏形成和胚胎存活方面是必不可少的^[29]。因此，当前研究结果表明，miR1-2可以诱导骨髓间充质干细胞分化成心肌细胞。

Wnt信号通路在胚胎和出生后心肌细胞发育过程中起着至关重要的作用，Wnt11可以调节细胞黏附，下调Wnt11会导致心室流出道的缺陷^[30-31]。Wnt信号通路也同时调节骨髓间充质干细胞的增殖和分化^[32-34]。此外，miRNA可以调控基因表达，是心肌细胞发育和干细胞分化的重要因子。最近，越来越多的证据表明，miRNA可以通过靶向Wnt信号通路来调控各种生物过程，例如，miR218被报道能够通过激活Wnt信号环促进骨髓间充质干细胞的分化；miR27可抑制腺瘤性结肠息肉基因表达，导致β-catenin的积累，从而激活Wnt信号通路促进成骨细胞分化^[35]。Tcf-1是Wnt/β-catenin信号通路的关键靶基因，通过miR30e的过表达来抑制低密度脂蛋白受体相关蛋白6，可显著下调β-catenin/Tcf转录活性，并显著抑制成骨细胞分化^[36]。在该研究中，miR-2的过表达激活了Wnt/β-catenin途径，β-catenin和Wnt11的表达显著增加。使用Wnt信号转导抑制剂LGK-974阻断Wnt/β-catenin信号传导，Wnt/β-catenin信号通路的β-catenin和Wnt11的相对表达量均显著降低。结合前人研究结果及当前研究结果，表明miR1-2可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进骨髓间充质干细胞分化成心肌细胞。

综上所述，骨髓间充质干细胞中miR1-2可以更有效地诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化，并且与Wnt/β-Cadenin信号通路活性有关。这些发现将显著提高对miRNA在干细胞心肌细胞分化中的作用的理解，并改善骨髓间充质干细胞治疗受损的心肌细胞修复和再生的效果。尽管在研究中，用miR1-2处理的骨髓间充质干细胞表达心脏特异性基因，但是在诱导后心肌细胞的形态学和心肌细胞抗原表达方面仍需要进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程