1.1 设计 随机对照动物实验,细胞学体外实验。
1.2 时间及地点 于2016年3月在贵阳中医学院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 2月龄雌性新西兰大白兔37只,体质量(2.00±0.15)kg,由贵阳医学院动物实验中心提供,许可证号:SCXK(黔)2015-001。30只同等条件下单只单笼适应性喂养1周。编号后随机均分为骨质疏松组、骨关节炎组、骨质疏松+骨关节炎组3组,每组10只。7只给药后分别制备正常血清组(正常组)、低剂量补肾活血汤组(低剂量组)、中剂量补肾活血汤组(中剂量组)、高剂量补肾活血汤组(高剂量组)、盐酸氨基葡萄糖组、阿仑膦酸钠组、盐酸氨基葡萄糖+阿仑膦酸钠组含药血清。
1.3.2 药物 ①补肾活血汤:《伤科大成》中经典方剂,方药组成:熟地9 g、补骨脂9 g、杜仲3 g、菟丝子10 g、萸肉3 g、枸杞3 g、独活3 g、肉苁蓉3 g、归尾3 g、没药3 g、红花1.5 g。制备方法:瓦罐矿泉水直火加热,由北京同仁堂大药房提供,生药浓度为650 g/L,1 300 g/L,2 600 g/L的水煎液;②盐酸氨基葡萄糖片(江苏正大清江制药有限公司,国药准字H20060647);③阿仑膦酸钠片(石药集团欧意药业有限公司,国药准字H10980109);④甲泼尼松龙琥珀酸纳(天津药业焦作有限公司)。
1.3.3 主要试剂及仪器 PBS(北京索莱宝);胎牛血清(Hyclone货号:SV30087.01);0.25%胰蛋白酶(Hyclone 货号:SH30042.01);DMEM高糖无丙酮酸钠(hyclon);上样缓冲液5*Loading Buffer(康为世纪CW0027A);一步法WB(HRP)快速二抗试剂盒(鼠)(兔)(北京康为世纪 CW2030 CW2029);ECL 荧光显影剂(康为世纪CW0048 CW0049);7β-acitn 内参抗体 ABMAX 05-0079;Votex振荡器(上海琪特QT-1);低温高速离心机(Eppendorf 5430R);二氧化碳培养箱(美国BMLB2HC)。
1.4 实验方法
1.4.1 造模 ①骨质疏松症模型制备:将骨质疏松组新西兰大白兔适应性喂养1周后,切除双侧卵巢,并于术后第2-5周肌注甲泼尼松龙琥珀酸纳1 mg/(kg•d);②骨关节炎模型制备:将骨关节炎组新西兰大白兔适应性喂养1周后,切断右膝前交叉韧带,术后伤肢不固定;③骨质疏松+骨关节炎模型制备:将骨关节炎+骨质疏松组新西兰大白兔适应性喂养1周后分别进行骨质疏松组及骨性关节炎组操作,操作步骤同上。术后8周即可获得稳定的骨质疏松症、骨性关节炎、骨质疏松症+骨性关节炎动物模型[14]。得到稳定的动物模型后在麻醉下提取兔右膝关节软骨组织进行下一步实验,观察兔软骨细胞NF-KBp65蛋白的表达。
1.4.2 制备含药血清 7只新西兰大白兔的具体给药剂量根据黄继汉等
[15]所提出的Db=Da•Rab公式算出。持续给药1周,在末次灌胃1 h后取心脏血,制备含药血清。见
表1。
1.4.3 软骨细胞的提取及鉴定 实验8周末麻醉后提取3组新西兰大白兔右膝关节软骨组织(股骨和胫骨关节面)。经培养、冻存、复苏后,甲苯氨蓝染色法及Ⅱ型胶原蛋白免疫组织化学方法对软骨细胞进行鉴定后确定为软骨细胞。
1.4.4 蛋白印迹法(Western-blot)操作步骤
(1)细胞培养及药物干预:将呈对数生长期的软骨细胞用胰酶消化1 min,用含体积分数10%胎牛血清高糖DMEM培养基终止消化,离心后弃上清,用培养基制备成细胞悬液,以1×10-7 L-1的细胞浓度接种于6孔板中,放入37 ℃、体积分数5%CO2饱和湿度条件下二氧化碳培养箱中培养5 d,加入7组体积分数20%含药血清培养基,刺激细胞,药物作用24 h后收获细胞。
(2)软骨细胞蛋白质的提取:收获的细胞用PBS冲洗,蛋白抽提试剂提前预冷,提取蛋白时按照1∶99比例向 5 000 μL哺乳动物抽提试剂中加入蛋白酶抑制剂,混匀制成工作液;加入200 μL/孔的哺乳动物蛋白抽提试剂,冰浴混匀及超声破碎;冰上孵育20 min后,1 000 r/min离心20 min,收集上清。
(3)上样配制好SDS-PAGE凝胶,10 μL蛋白样品上样到SDS-PAGE凝胶加样孔(1-7分别为:正常组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、阿仑膦酸钠组、盐酸氨基葡萄糖组、盐酸氨基葡萄糖+阿仑膦酸钠组)。
(4)电泳30 mA电流强度电泳1.5 h,待预染Marker条带分离清晰,间距适宜时,停止电泳。
(5)转膜裁剪PVDF膜,无水甲醇泡10 s后用纯水浸泡,置于摇床上;在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、2块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过转移液的膜;将转膜夹子打开,按正反面放好夹子,在上面垫一张海绵垫及滤纸,切下与剪裁的PVDF膜同样大小并包含目的蛋白分子量条带的凝胶置于滤纸之上;再盖上滤纸和海绵垫,合上夹子;将夹子放入转移槽中,冰水浴,转膜电流为200 mA,转膜1.5 h。
(6)封闭取下PVDF膜,做好标记,置于4 mL封闭液中封闭1 h。
(7)抗体孵育与一抗反应,以PBS稀释的一抗终浓度NF-KBp65(1∶1 000)和β-actin终浓度(1∶5 000)加入装有PVDF膜的保鲜膜袋中,4 ℃孵育过夜,用PBST液清洗;与二抗反应,以PBS稀释的二抗羊抗鼠和羊抗兔终浓度(1∶200),加入装有PVDF膜的保鲜膜袋中,置摇床上轻摇2 h,用TBST液先快速清洗1次,然后5 min×5次。
(8)化学发光法显色加入增强发光剂与稳定剂,按照1∶1比例等体积混合;将混合物覆盖在膜表面,作用5 min;放入BIO-RAD凝胶成像仪中,选择化学发光,开始曝光;照相并保存。采用化学发光凝胶成像系统软件对图像进行分析,各组蛋白相对表达量=各组目的蛋白表达体积/各组β-actin蛋白表达体积。
1.4.5 结果分析 采用Gel-Pro analyzer4图像分析软件测定各带的灰度值做定量分析,结果以骨质疏松症NF-KBp65/β-actin、骨关节炎NF-KBp65/β-actin,骨质疏松症+骨关节炎NF-KBp65/β-actin的积分吸光度值的比值表示。
1.5 主要观察指标 不同剂量补肾活血汤处理后兔软骨细胞NF-KBp65蛋白的表达。
1.6 统计学分析 结果以
x±s表示,采用SPSS 18.0统计软件两因素重复测量方差进行统计分析,组间比较采用成组t 检验,P < 0.05表示差异有显著性意义。