2.1  差异表达的lncRNA与mRNA  以logFC >1或者< -1，并且校正后P < 0.05为筛选标准，退变椎间盘组与正常组比较共获得491个差异表达的lncRNA，其中239个为下调，252个为上调，差异表达的lncRNA的分层聚类树形图和热图见图1。退变椎间盘组与正常组比较共获得2 290个mRNA，其中743个为下调，1 547个为上调。

2.2  差异表达lncRNA的ceRNA网络  在下调差异表达lncRNA的ceRNA网络中，有59个lncRNA，经miRDB、miRTarBase、TargetScan三大数据库共同预测得到26个miRNA，miRNA预测的mRNA与芯片数据差异mRNA取交集后得到56个mRNA。在上调差异表达lncRNA的ceRNA网络中，有70个lncRNA，经miRDB、miRTarBase、TargetScan三大数据库共同预测得到34个miRNA，miRNA预测的mRNA与芯片数据差异mRNA取交集后得到118个mRNA，下调与上调差异表达lncRNA的ceRNA网络见图2，3；ceRNA网络中下调和上调的mRNA见表1。

2.3  蛋白互作网络及模块分析  以置信度得分> 0.9为筛选参数，共得到86对蛋白互作关系，60个蛋白，其中有21个下调的mRNA编码的蛋白，39个上调的mRNA编码的蛋白。运用MCODE插件筛选得到2个关键蛋白互作模块，模块1中有BTRC、CUL3、KLHL5、SIAH1、UNKL、RNF138共6个蛋白，模块2中有MAPK1、YWHAE、FOXO1、YWHAH共4个蛋白，见图4。

2.4  GO富集分析  以P < 0.05为筛选指标，蛋白模块1的GO富集分析结果中，生物过程为蛋白质多泛素化、蛋白质泛素化、泛素依赖性蛋白质分解代谢过程、Wnt信号通路等；细胞成分为Cul3-RING泛素连接酶复合物、核、细胞质；分子功能涉及泛素蛋白-蛋白质转移酶活性、泛素蛋白连接酶活性、连接酶活性、锌离子结合，见图5。蛋白模块2的GO富集分析结果中，生物过程为转录的正调节、DNA模板化、蛋白质插入线粒体膜的正调节参与凋亡信号通路、膜组织等；细胞成分为线粒体、细胞质、细胞质囊泡膜等；分子功能涉及离子通道结合、蛋白质结构域特异性结合，见图6。

2.5  KEGG富集分析  以P < 0.05为筛选指标，蛋白模块1的富集通路有泛素介导的蛋白水解和Wnt信号通路；蛋白模块2的富集通路有卵母细胞减数分裂、病毒致癌作用、PI3K-Akt信号通路等，见表2。

2.6  关键ceRNA网络  lncRNA与富集基因的mRNA竞争结合miRNA，其中下调的mRNA的关键ceRNA网络中hsa-miR-301b-3p、hsa-miR-107被lncRNA上调，见图7。上调的mRNA的关键ceRNA网络中hsa-miR-449c-5p、hsa-miR-301b-3p、hsa-miR-135a-5p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-876-3p被lncRNA下调，见图8。

椎间盘退变(intervertebral disc degenerative，IDD)是骨科临床常见问题，容易导致盘源性腰痛、椎间盘突出和椎体滑脱等疾病，严重时患者的工作和生活会受到影 响^[1]。目前暂无有效针对椎间盘退变的非手术治疗方案，主要是因为椎间盘退变的发病机制仍不明确，研究发现的有效特异性靶点较少^[2]。确定致病途径和分子机制对于发现新的椎间盘退变诊断与治疗策略至关重要。

Salmena等^[3]提出竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)假说，阐述了一种细胞内复杂的转录后调控机制，其中包括mRNA、长非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)等，它们可以作为“海绵”共同竞争miRNA的结合位点，从而调控其他RNA。多数情况下lncRNA与miRNA结合，通过隔离miRNA而下调miRNA与mRNA的结合，最终促进mRNA的表达^[4]。基因调控网络分析是一种稳定、动态的层次系统模型，越来越多地被用于研究各种疾病^[5-6]。从宏观上看，基因调控网络是由许多个lncRNA-miRNA-mRNA关系组成的，利用ceRNA网络分析将这些关系结合起来，可以清晰、系统地探索疾病发生发展的分子机制。

目前已有研究发现lncRNA GAS5激活了退变椎间盘髓核细胞(nucleus pulposus cells，NPC)内的线粒体凋亡通路，进而促进髓核细胞的凋亡^[7]。lncRNA HOTAIR能作为ceRNA下调miR-130b对PTEN表达的抑制，从而抑制Akt信号通路来诱导人退变椎间盘髓核细胞的增殖^[8]。然而到目前为止，暂未检索到系统阐述有关椎间盘退变的ceRNA网络调控研究。在此次研究中，作者对有关椎间盘退变的lncRNA微阵列芯片展开分析，并构建ceRNA网络，通过生物信息学方法分析ceRNA网络调控的相关功能和通路，为探索椎间盘退变的发病机制提供了理论依据。

目前仍未发现治疗椎间盘退变的特效方法，临床上常采取卧床休息、物理治疗与传统康复等保守治疗方案^[13]。揭示椎间盘退变的病因和分子机制对于治疗和预防至关重要。如今，随着DNA微阵列和高通量测序技术的快速进步，能够在基因水平上研究包括椎间盘退变在内的疾病。DNA微阵列基因表达谱已被广泛用于探索疾病的基因调控机制^[14-15]，已有研究发现部分mRNA在退变的椎间盘中存在异常表达^[16]，并与此次研究的部分结果相契合。在研究中，作者从GSE56081芯片中提取数据，并使用生物信息学分析在椎间盘退变样本和正常组织样本之间鉴定了239个下调和252个上调的lncRNA，通过与高度保守的miRNA家族文件比对分析后得出lncRNA-miRNA关联。基于三大miRNA数据库共同预测结果与芯片数据的差异mRNA取交集后，获得可靠的miRNA-mRNA关系，基于多个lncRNA-miRNA-mRNA关系构建ceRNA网络。为缩小研究范围，寻找椎间盘退变的关键机制，通过蛋白互作关系分析ceRNA网络中mRNA编码的蛋白，并挖掘关键蛋白互作模块，根据KEGG富集分析中的富集基因构建关键lncRNA-miRNA-mRNA调控关系，得到关键ceRNA网络中被上调和下调的miRNA。模块1涉及泛素介导的蛋白水解和Wnt信号通路，并且生物过程与泛素依赖性蛋白质分解代谢过程、Wnt信号通路等相关。模块2主要涉及PI3K-Akt信号通路，其生物过程为蛋白质插入线粒体膜的正调节参与凋亡信号通路。这些内容均与椎间盘退变的发病机制有关。

椎间盘退变的重要机制之一是髓核组织细胞外基质代谢紊乱，细胞外基质主要成分Ⅱ型胶原、聚集蛋白多糖的合成减少，继而导致椎间盘髓核组织纤维化，最终引起椎间盘退变^[17-18]。模块1涉及Wnt信号通路，通过影响Wnt/β-catenin通路能够减少炎性因子白细胞介素1β在髓核细胞中介导的细胞外基质降解，从而维持稳定的细胞外基质代谢^[19]。提高细胞外基质的合成来恢复髓核组织生物学稳定性，是一种治疗椎间盘退变的有效方法^[20]。研究发现炎症因子通过激活大鼠髓核细胞中Wnt/β-catenin通路从而诱导髓核细胞的凋亡，当抑制Wnt/β-catenin通路后，髓核细胞的凋亡率显著降低^[21]，说明Wnt信号通路在调控髓核细胞的凋亡过程中起到重要作用。模块2涉及到PI3K-Akt信号通路，已知胰岛素样生长因子1受体(联合骨形态发生蛋白7)通过增强Akt活性协同促进聚集蛋白多糖的积累^[22]。在退变性人腰椎间盘标本中miR-4458水平显着增加，用miR-4458模拟物转染人髓核细胞通过沉默胰岛素样生长因子1受体抑制PI3K/Akt信号通路，导致细胞外基质分解增加^[23]，说明PI3K/Akt信号通路与细胞外基质代谢密切相关。Wang等^[24]在研究中通过敲低miR-138-5p以上调其靶基因SIRT1的表达，从而抑制肿瘤坏死因子α处理的人髓核细胞的凋亡。在机制上，SIRT1的上调降低了PTEN水平以激活PI3K/Akt途径。这些发现揭示了PI3K/AKT信号通路作为SIRT1介导的抑制髓核细胞凋亡的另一个重要机制。进一步研究，对关键蛋白模块进行GO富集分析，发现了蛋白质泛素化、Wnt信号通路、细胞凋亡等术语，这些结果与之前有关椎间盘退变的研究一致^[21，25]。

文章的不足之处在于芯片包含的样本数量较少可能会影响到结果的准确性。此外，受研究方法的限制，仅预测了退变椎间盘样本对比正常样本差异表达的lncRNA关联的miRNA，再通过与miRNA关联的mRNA分析相关功能与通路，而不能完全说明这些lncRNA的实际功能。后续可以设计体内和体外实验分析研究涉及的lncRNA的详细功能和作用机制。有趣的是，lncRNA在调控PI3K-Akt信号通路和泛素介导的蛋白水解通路的过程中发生了串扰，hsa-miR-301b-3p同时出现在了下调和上调的mRNA的ceRNA网络中，hsa-miR-301b-3p在退变椎间盘髓核细胞中究竟是下调或是上调，需要设计实验进一步验证。

综上所述，研究构建了有关椎间盘退变的ceRNA网络，揭示了退变椎间盘的髓核细胞中差异lncRNA与mRNA竞争miRNA，从而调控蛋白合成，最终影响泛素介导的蛋白水解、Wnt信号通路和PI3K-Akt信号通路。并发现7种miRNA(hsa-miR-107、hsa-miR-449c-5p、hsa-miR-301b- 3p、hsa-miR-135a-5p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-20b- 5p、hsa-miR-876-3p)可能在导致椎间盘退变的蛋白质分解代谢与细胞凋亡的过程中发挥关键作用，为椎间盘退变的治疗发掘了许多潜在的靶点，期待在未来的实验中得到验证。

目前暂无有效针对椎间盘退变的非手术治疗方案，主要是因为椎间盘退变的发病机制仍不明确，研究发现的有效特异性靶点较少。确定致病途径和分子机制对于发现新的椎间盘退变诊断与治疗策略至关重要。