关节牵伸高度对膝骨关节炎模型兔软骨修复的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1242

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (19): 2972-2979.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1242

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关节牵伸高度对膝骨关节炎模型兔软骨修复的影响

石华南，张永红，彭瑞健，李晓辉，郭秀娟

(山西医科大学第二医院骨科，山西省太原市 030001)

收稿日期:2019-01-30 出版日期:2019-07-08 发布日期:2019-07-08
通讯作者: 张永红，博士，主任医师，博士生导师，山西医科大学第二医院骨科，山西省太原市 030001
作者简介:石华南，男，1991年生，河南省洛阳市人，汉族，山西医科大学第二医院骨科在读硕士，主要从事牵拉组织再生研究。
基金资助:
山西省回国留学人员科研资助项目(2015-104)

Influence of joint distraction height on cartilage repair in rabbit models of knee oteoarthritis

Shi Huanan, Zhang Yonghong, Peng Ruijian, Li Xiaohui, Guo Xiujuan

(Department of Orthopedics, the Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China)

Received:2019-01-30 Online:2019-07-08 Published:2019-07-08
Contact: Zhang Yonghong, MD, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, the Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
About author:Shi Huanan, Master candidate, Department of Orthopedics, the Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
Supported by:
the Research Project of Shanxi Provincial Overseas Scholarship, No. 2015-104

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
关节牵伸：是通过使用外固定架对关节进行牵伸，使关节达到去负荷的一项技术。关节牵伸技术应用于膝骨关节炎，目的是减轻关节软骨的机械应力，防止进一步的磨损和撕裂，进而刺激软骨细胞开启软骨组织修复；并且关节牵伸铰链允许活动，行走过程中关节液压力的变化可以改善软骨细胞营养，进一步促进软骨组织的修复。
基质金属蛋白酶：其家族成员具有相似的结构，一般由5个功能不同的结构域组成：疏水信号肽序列；前肽区，主要作用是保持酶原的稳定。当该区域被外源性酶切断后，基质金属蛋白酶原被激活；催化活性区，有锌离子结合位点，对酶催化作用的发挥至关重要；富含脯氨酸的铰链区；羧基末端区，与酶的底物特异性有关，其中酶催化活性区和前肽区具有高度保守性。各种基质金属蛋白酶间具有一定的底物特异性，但不是绝对的。同一种基质金属蛋白酶可降解多种细胞外基质成分，而某一种细胞外基质成分又可被多种基质金属蛋白酶降解，但不同酶的降解效率可不同。

摘要
背景：有研究证实关节牵伸可激活软骨细胞再生，此项技术已逐步应用于骨关节炎的治疗过程中。但该技术的相关基础研究相对薄弱，尤其是不同牵伸高度对软骨修复的影响报道较少。
目的：探讨关节牵伸治疗兔膝骨关节炎中不同牵伸高度对软骨修复的影响。
方法：将五六月龄新西兰大白兔(山西医科大学实验动物中心提供)随机分为造模组及空白对照组。造模组采用关节腔注射体积分数4%木瓜蛋白酶的方法制备兔膝骨关节炎模型，空白对照组关节腔注射生理盐水。随后将造模组兔随机分成模型组、正常关节间隙牵伸组、1.5倍正常关节间隙牵伸组及2.0倍正常关节间隙牵伸组。后3组安置Ilizarov 3/4环形外固定架进行关节牵伸，空白对照组、模型对照组不做特殊处理。牵伸6周后，取材观察各组软骨修复情况，采用ICRS软骨修复大体评分、Mankin骨关节病组织评分、免疫组织化学染色观察软骨组织中白细胞介素1β、基质金属蛋白酶13的表达情况。
结果与结论：①空白对照组软骨平滑完整；模型组软骨破坏明显，可见软骨缺损；正常关节间隙牵伸组缺损区可见软骨再生，未完全填充缺损区；1.5倍正常关节间隙牵伸组再生软骨完全填充，组织学观察为透明软骨；2.0倍正常关节间隙牵伸组再生软骨完全填充缺损区，组织学观察为透明软骨。各牵伸组ICRS评分显著高于模型组，Mankin评分显著低于模型对照组(P < 0.001)，其中正常关节间隙牵伸组与1.5倍和2.0倍正常关节间隙牵伸组的差异有显著性意义(P < 0.001)；②各牵伸组软骨组织白细胞介素1β、基质金属蛋白酶13的表达显著低于模型组(P < 0.001)，其中正常关节间隙牵伸组的表达显著高于1.5倍和2.0倍正常关节间隙牵伸组(P < 0.001)；③结果提示，1.5倍和2.0倍正常关节间隙牵伸较正常关节间隙牵伸可以更好地实现软骨再生。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-3129-0552(石华南)

关键词: 关节牵伸, 软骨组织再生, 牵伸高度, Ilizarov技术, 软骨修复, 膝骨关节炎, 机械应力, 骨缺损

Abstract:

BACKGROUND: Joints distraction has been shown to activate cartilage cell regeneration, which has been gradually used in the treatment of osteoarthritis. However, the related basic research of this technology is weak. Especially the influence of different joint distraction height on cartilage repair is little known.
OBJECTIVE: To explore the influence of different joint distraction height on cartilage repair in rabbit knee osteoarthritis.
METHODS: New Zealand white rabbits, aged 5-6 months (provided by Experimental Animal Center of Shanxi Medical University) were randomized into mode and blank control groups. A model of rabbit knee osteoarthritis was made by intra-articular injection of 4% papain. The blank control group underwent intra-articular injection of normal saline. Afterwards, the rabbit models were randomized into modeling, normal joint space distraction, 1.5×joint space distraction and 2.0×joint space distraction groups. The rabbits in the latter three groups, the joint distraction was carried out by placing Ilizarov External Fixator(3/4). The blank control and modeling groups received no treatment. At 6 weeks after surgery, animals of each group were sacrificed for gross observation and macroscopically analyzed using ICRS system and Mankin scoring system. The expression levels of interleukin 1β and matrix metalloproteinase 13 in cartilage tissue were detected by immunohistochemical staining.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The articular cartilage in the blank control group was smooth and intact. In the modeling group, the defect of articular cartilage was obvious. The defect area in the normal joint space distraction group showed cartilage regeneration, but did not completely fill the defect area. In the 1.5×joint space distraction group, the regenerated cartilage was completely filled the defect area, and histological observation showed transparent cartilage. The regenerated cartilage the 2.0×joint space distraction group was completely filled in the defect area, and histological observation showed transparent cartilage. The ICRS score and Mankin score in each distraction group were significantly higher than those in the modeling group (P < 0.001), and the scores in the 1.5× and 2.0×joint space distraction groups were significantly higher than those in the normal joint space distraction group (P < 0.001). (2) The expression levels of interleukin 1β and matrix metalloproteinase 13 in cartilage tissue in each distraction group were significantly lower than those in the modeling group (P < 0.01), and the levels in the 1.5×and 2.0×joint space distraction groups were significantly lower than those in the normal joint space distraction group (P < 0.001). (3) In summary, the regeneration of cartilage can be better achieved by 1.5× and 2.0×joint space distraction groups than the normal joint space distraction.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: joint distraction, cartilage tissue regeneration, joint distraction height, Ilizarov technology, cartilage repair, knee osteoarthritis, mechanical stress, bone defects

中图分类号:

R454.4
R363

石华南，张永红，彭瑞健，李晓辉，郭秀娟. 关节牵伸高度对膝骨关节炎模型兔软骨修复的影响[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(19): 2972-2979.

Shi Huanan, Zhang Yonghong, Peng Ruijian, Li Xiaohui, Guo Xiujuan. Influence of joint distraction height on cartilage repair in rabbit models of knee oteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(19): 2972-2979.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析新西兰大白兔2只用于验证造模，其余均进入结果分析，无脱落。

2.2 膝关节软骨形态验证造模情况左膝关节X射线：可见空白对照组关节形态正常，未见明显骨赘形成(图2A)；模型组关节间隙变窄，软骨下骨硬化，可见明显的骨赘形成(图2B)。大体观：可见空白对照组软骨呈半透明状，无软化，表面光滑、无裂纹，关节液清亮，滑膜未见明显增生(图2C)；模型组软骨色泽灰暗，负重区可见明显磨损，深达软骨下骨，滑膜增生明显(图2D)。苏木精-伊红染色：可见空白对照组软骨表面光滑整齐，四层结构清晰，中层细胞呈柱状排列(图2E)；模型组软骨病变明显，四层结构破坏，可见全层缺失(图2F)。番红O-固绿染色：可见空白对照组软骨基质呈深红色，潮线清晰，蛋白聚糖含量正常(图2G)；模型组软骨缺损，潮线可见(图2H)。

2.3 关节牵伸后6周各组软骨形态大体观结果空白对照组软骨呈半透明状，无软化，表面光滑、无裂纹，关节液清亮，滑膜未见明显增生(图3A)；模型对照组软骨厚度变薄，软化，表面粗糙，可见多发裂纹，局部深达软骨下骨，滑膜增生明显(图3B)；正常关节间隙牵伸组软骨缺损区可见软骨再生，再生软骨质软，表面欠光滑，再生软骨未完全填充软骨缺损区(图3C)；1.5倍正常关节间隙牵伸组再生软骨完全填充且高出缺损区，再生软骨颜色苍白、质软，表面欠光滑(图3D)；2.0倍正常关节间隙牵伸组再生软骨完全填充缺损区，再生软骨颜色苍白、质软，表面欠光滑(图3E)。2.0倍正常关节间隙牵伸组软骨修复ICRS评分明显高于模型对照组(P < 0.001)，3个实验组评分均低于空白对照组(P < 0.01)，见图4。正常关节间隙牵伸组分值显著低于1.5倍和2.0倍正常关节间隙牵伸组(P < 0.001)，1.5倍和2.0倍正常关节间隙牵伸组无明显差异(P > 0.05)。

2.4 关节牵伸后6周各组软骨苏木精-伊红染色、番红O-固绿染色显微镜观察结果空白对照组软骨表面光滑整齐，四层结构清晰，中层细胞呈柱状排列，番红O-固绿染色显示糖胺多糖均匀表达(图5A)；模型对照组可见明显软骨缺损区，番红O-固绿染色显示糖胺多糖不表达(图5B)；正常关节间隙牵伸组软骨缺损区再生软骨无明显四层结构，以浅层纤维组织为主，深层为较薄的透明软骨，可见成团分布的同源细胞群，番红O-固绿染色显示浅层糖胺多糖不表达，深层可见其表达(图5C)；1.5倍正常关节间隙牵伸组软骨表面欠光滑，可见软骨组织的四层结构，各层软骨细胞排列不整齐，可见软骨裂隙，深层可见多个成团分布的同源细胞群，番红O-固绿染色显示糖胺多糖在软骨表层以下表达(图5D)，但不均匀；2.0倍正常关节间隙牵伸组软骨表面欠光滑，可见软骨组织的四层结构，各层软骨细胞排列不整齐，深层可见多个成团分布的同源细胞群，番红O-固绿染色显示糖胺多糖在软骨全层表达，欠均匀，以深层为主，表层含量低(图5E)。

各牵伸组Mankin骨关节病组织评分明显低于模型组(P < 0.001)，显著高于空白对照组(P < 0.001)，其中正常关节间隙牵伸组分值显著高于1.5倍和2.0倍正常关节间隙牵伸组(P < 0.001)，1.5倍和2.0倍正常关节间隙牵伸组间无明显差异(P > 0.05)，见图6。

2.5 关节牵伸后6周各组白细胞介素1β、基质金属蛋白酶13在软骨组织的表达光镜下可见各组白细胞介素1β、基质金属蛋白酶13的表达情况：空白对照组仅见软骨表层极弱表达；模型对照组软骨全层基质、软骨细胞胞浆高表达，呈深棕色，阳性结果较空白对照组显著增强；正常关节间隙牵伸组再生软骨全层表达，以表、中层显著；1.5倍正常关节间隙牵伸组再生软骨以表层表达为主，中层可见散在表达；2.0倍正常关节间隙牵伸组软骨表层仍可见表达，阳性结果高于空白对照组。见图7，8。

经Image Pro Plus 6.0图像分析软件分析累积吸光度值，白细胞介素1β、基质金属蛋白酶13累积吸光度值越大，则阳性结果越高。各牵伸组累积吸光度值明显低于模型对照组(P < 0.001)，正常关节间隙牵伸组吸光度值显著高于1.5倍和2.0倍正常关节间隙牵伸组(P < 0.001)，1.5倍和2.0倍正常关节间隙牵伸组间无明显差异(P > 0.05)。各组白细胞介素1β累积吸光度值见图9，基质金属蛋白酶13累积吸光度值见图10。

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引言

膝骨关节炎是一种以关节软骨的变性、破坏及骨质增生等病理变化为特征的慢性关节病^[1]。目前膝骨关节炎被认为是在生物性、机械性等多方因素的作用下，由软骨细胞、基质及软骨下骨的正常合成和降解的耦联失衡引起的，但其发病机制尚不明确，治疗方法众多。目前的保守治疗并不能阻止或延缓膝骨关节炎的病理进展，晚期的膝骨关节炎患者多选择全膝关节置换^[2]。但针对年龄小于65周岁选择全膝关节置换的患者，置换后翻修率呈增长趋势^[3]。在膝骨关节炎的流行病学调查中，机械力学因素被认为是膝骨关节炎最重要的致病因素之一。关节的长期使用导致软骨磨损，局部产生炎症反应，关节表面的透明软骨坏死，关节软骨出现缺损，软骨下骨外露，即出现软骨原骨缺损，导致周围的软骨组织受到超生理的压应力，从而促进了异常部位的新骨形成，并产生逐级放大的恶性循环，最终不可避免地出现关节僵硬和功能丧失^[4-5]。因此一些学者提出关节牵伸，其目的是减轻关节软骨的机械应力，防止进一步的磨损和撕裂，进而刺激软骨细胞开启软骨组织修复^[6]。并且关节牵伸铰链允许活动，行走过程中关节液压力的变化可以改善软骨细胞营养，进一步促进软骨组织的修复^[7]。早在1978年，Judet和 Judet^[8]就曾对行关节松解或关节成形后的骨关节炎关节加用铰链式的牵张装置以防止关节承重，并允许其术后活动，X射线表现出关节间隙增加和软骨的再生。

膝关节牵伸已初步应用于临床，并有文献报道在大多数应用膝关节牵伸治疗的膝骨关节炎患者中，最终实施全膝关节置换的时间推迟了至少5年，不论是膝骨关节炎患者的主观感受功能，还是膝关节功能上都取得较为满意的结果^[9-11]。相关的实验研究也在逐步开展，在组织学层面上观察到软骨组织及软骨下骨的修复^[12-13]，但这方面的基础研究相对薄弱，关节牵伸高度对软骨修复的影响尚未见报道。

当前实验以新西兰大白兔为实验对象，制作膝骨关节炎模型，安置Ilizarov 3/4环形外固定架进行膝关节牵伸，研究不同的关节牵伸高度对软骨修复的影响。为临床应用关节牵伸技术治疗骨关节炎提供一定的理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计单因素多水平对照实验。

1.2 时间及地点于2017年3月至11月在山西医科大学第二医院骨与软组织工程重点实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 32只成年健康新西兰大白兔，雌雄不限，五六月龄，体质量3.0-3.5 kg，由山西医科大学实验动物中心提供，批号SYXK(晋)2015-0002，实验过程中对动物处理符合动物伦理学要求。

1.3.2 实验用主要试剂及仪器木瓜蛋白酶(北京依托华茂生物科技有限公司，中国)；兔抗兔、白细胞介素1β、基质金属蛋白酶13单克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司，中国)；EDTA抗原修复液、SABC免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒(武汉博士德生物科技有限公司，中国)；Ilizarov 3/4环形外固定架(北京瑞朗医疗器械有限公司)。小动物X射线机(Faxitron公司，美国)；超声快速脱钙机(上海路深生物科技有限公司，中国)；组织脱水机、石蜡包埋机、组织薄层切片机、展片机、加热板(Leica，德国)；倒置显微镜(Olympus公司，日本)。

1.4 方法

1.4.1 分组与兔膝骨关节炎模型的建立^[14] 将32只新西兰大白兔按随机数字表法分为造模组25只，空白对照组7只。于实验开始第1，4及7天采用体积分数10%水合氯醛 (4 mL/kg)腹腔麻醉，待麻醉生效后将其仰卧位置于手术台上，左下肢常规备皮、消毒，将左膝关节屈曲45°，以髌骨下极髌韧带外缘为进针点，斜向髁间窝方向进针，抵达股骨髁后回撤2 mm，造模组注入体积分数4%木瓜蛋白酶 0.3 mL；空白对照组注入等体积的生理盐水。

造模6周后分别随机抽取造模组和空白对照组1只兔子，行X射线、关节软骨大体观及组织形态学观察验证造模成功。造模成功后，将造模组剩余24只兔子随机均分成4组：模型对照组、正常关节间隙牵伸组、1.5倍正常关节间隙牵伸组、2.0倍正常关节间隙牵伸组，每组各6只。后3组安置Ilizarov 3/4环形外固定架进行关节牵伸，对照组造模后不做特殊处理。

实验动物造模过程的相关问题
造模目的：	观察不同的关节牵伸高度对兔膝骨关节炎软骨修复的影响
借鉴已有标准实施动物造模：	参考文献[14]建立膝骨关节炎动物模型
选择动物的条件：	①新西兰大白兔；②雌雄不限；③5至6月龄
动物来源及品系：	新西兰大白兔32只由山西医科大学实验动物中心提供
模型与所研究疾病的关系：	为临床应用关节牵伸技术治疗骨关节炎提供理论依据
造模技术描述：	髌骨下极髌韧带注射木瓜蛋白酶
造模主要诱导用药：	体积分数4%木瓜蛋白酶
动物数量及分组方法：	新西兰兔随机分为5组(n=6)： ①空白对照组：注射生理盐水；②模型1组：髌骨下极髌韧带注射木瓜蛋白酶，不做特殊处理；③模型2组：髌骨下极髌韧带注射木瓜蛋白酶，安置Ilizarov 3/4环形外固定架进行正常关节间隙牵伸；④模型3组：髌骨下极髌韧带注射木瓜蛋白酶，安置Ilizarov 3/4环形外固定架进行正常1.5倍正常关节间隙牵伸；⑤模型4组：髌骨下极髌韧带注射木瓜蛋白酶。安置Ilizarov 3/4环形外固定架进行2.0倍正常关节间隙牵伸
造模成功评价指标：	行X射线、关节软骨大体观及组织形态学观察关节间隙变窄，软骨下骨硬化，可见明显的骨赘形成验证造模成功
造模后实验观察指标：	①同组别间新鲜标本的ICRS软骨修复评分；②苏木精-伊红染色、番红O-固绿染色：组织结构的详细观察，Mankin 骨关节病组织评分；③免疫组织化学染色观察不同组软骨缺损修复后白细胞介素1β、基质金属蛋白酶13的表达
造模后动物处理：	麻醉后进行关节牵伸6周
伦理委员会批准：	实验方案经山西医科大学伦理委员会批准

1.4.2 Ilizarov 3/4环形外固定架的安置及关节牵伸进行关节牵伸的3组兔采用体积分数10%水合氯醛腹腔麻醉 (4 mL/kg)，待麻醉起效，左下肢备皮后仰卧位固定于手术台上，常规消毒铺无菌巾。将环形外固定架套入左膝部，调整近远端环与皮肤距离合适，分别在股骨下段与胫骨上段各交叉置入1枚1.5 mm全针及1枚2.0 mm的螺纹针，避开血管、神经、肌腱等重要结构，安装固定螺母，调整关节铰链位于膝关节的旋转中心(图1A)。分别按要求牵开关节间隙(以右侧正常膝关节间隙为标准)，正常关节间隙牵伸组(图1B)、1.5倍正常关节间隙牵伸组(图1C)、2.0倍正常关节间隙牵伸组(图1D)，X射线机透视验证。关节牵伸后单笼饲养，允许自由活动，不进行抗生素治疗，生理盐水棉棒定期护理针道(2次/d)。左膝每2周拍摄一次X射线，确保牵伸未丢失。

1.4.3 取材与大体观察于关节牵伸后6周对各组动物静脉注射过量水合氯醛进行安乐死。取下外固定架，解剖出左膝关节，观察骨关节炎软骨破坏修复情况并留取影像资料，根据国际软骨修复协会软骨修复评分标准(ICRS)分别从缺损填充、新生软骨颜色、缺损边缘、修复软骨表面光滑程度进行大体评分，分数为0-16分，16分代表正常的关节软骨，评分越高代表软骨修复越好^[15]。

1.4.4 标本的制作与切片染色样本离体后置于体积分数4%甲醛中固定4 d，后置于含20%脱钙液的脱钙机中脱钙25-30 d(针刺法观察脱钙情况以刺破双侧皮质为准)，将胫骨平台沿正中冠状面切开，使用组织脱水机脱水31 h，常规石蜡包埋，切片(厚度5 μm)。进行苏木精-伊红染色、番红O-固绿染色，依据Mankin骨关节病组织评分系统对光镜下软骨形态进行评分，分数为0-14分，0分代表正常的关节软骨，评分越高代表软骨组织病理改变越严重^[16]。

1.4.5 免疫组织化学染色样本处理及切片同上(注意要使用防脱载玻片)。在70 ℃条件下展片30 min，常规脱蜡；PBS冲洗5遍，体积分数3%过氧化氢去离子水孵育10 min，PBS冲洗，使用体积分数2% EDTA抗原修复液(100 ℃)修复2 min，用PBS冲洗5遍洗掉残留液；滴加兔抗兔白细胞介素1β一抗(1∶700)，37 ℃温箱孵育120 min；PBS冲洗3次(2 min/次)，滴加羊抗兔二抗，37 ℃温箱孵育30 min；PBS冲洗，滴加DAB显色液室温显色5 min，蒸馏水冲洗，苏木素染核10 s，盐酸乙醇洗5 s，脱水、透明封固。样本基质金属蛋白酶13测定：稀释浓度1∶700，处理步骤同上。利用Image Pro Plus 6.0图像分析软件测定白细胞介素1β、基质金属蛋白酶13累积吸光度值。

1.5 主要观察指标 ①不同组别间新鲜标本的ICRS软骨修复评分；②苏木精-伊红染色、番红O-固绿染色：组织结构的详细观察，Mankin骨关节病组织评分；③免疫组织化学染色观察不同组软骨缺损修复后白细胞介素1β、基质金属蛋白酶13的表达。

1.6 统计学分析采用IBM SPSS 19.0统计学软件处理数据。数据表示为x(_)±s。根据实验设计使用单因素方差中的LSD多重比较。P < 0.05认为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

关节软骨的破坏是膝骨关节炎的主要病理变化，其病变呈渐进性，相关研究表明，软骨的自身修复能力较差，无法自行逆转损伤的病理生理过程。膝骨关节炎的致病因素有很多，如：退变、创伤、炎症、机械因素导致的微骨折等，其确切致病机制尚未完全明确，越来越多的研究显示，机械损伤是导致骨关节炎的发生以及进展的主要原因，包括继发炎症、软骨退变以及软骨下骨的硬化^[17-19]。关节牵伸可以通过去除软骨的机械应力刺激，来缓解骨关节炎的进程。同时有学者认为带铰链的牵伸装置允许关节活动，在关节负重和非负重状态下关节内存在关节液压的改变，关节软骨可在去除机械力学刺激以及关节内存在合适的液压情况下实现一定程度的再生^[20]。有学者曾通过测量实施关节牵伸患者踝关节内的压力，发现患者在负重、非负重及下肢活动时踝关节内存在着3-12 kPa 的压力变化，并认为此范围内的压力变化有利于软骨修复再生^[21-22]。该学者在后期研究关节牵伸技术治疗狗膝骨关节炎的实验中也证实了该观点^[23]。近年来相关动物实验研究也在逐步开展，但在研究中，关节牵伸的高度并未有统一的标准，如兔子动物实验中关节牵伸高度有：正常关节间隙、1.5 mm牵伸、2.0 mm牵伸。尚未有研究显示不同牵伸高度对软骨修复的影响^[12]。

当前实验骨关节炎造模方法采用关节腔注射木瓜蛋白酶的方法，木瓜蛋白酶为蛋白水解酶，可以对关节进行溶解性破坏，引起关节软骨及滑膜组织的无菌性炎症反应，在兔膝关节正常活动情况下造成软骨的磨损，行成恶性循环，造成进行性的软骨缺损，经过6周的造模期，逐步出现软骨下骨的硬化及骨赘的形成^[24]。此方法更加符合膝关节退行性改变病因中机械力学因素造成的软骨损伤。

当前实验关节牵伸装置采用带铰链的Ilizarov环形外固定架，铰链存在0-90°的活动范围，不影响兔膝关节的正常活动。Ilizarov牵伸装置可以提供最佳的弹性固定，较单臂外架有更好的力学性能。Karadam等^[25]在应用允许关节活动的单臂外架牵伸装置治疗兔膝骨关节炎时，发现关节牵伸并没有起到良好的治疗效果。考虑安置单臂外架时并不能很好地保证外架活动中心处于膝关节旋转轴上，从而不能确保关节在活动情况下仍处于牵伸状态；再者，单臂外架较环形外架稳定性差，在兔骨质脆的情况下前者更容易出现针道松动，导致牵伸丢失。

相关研究表明，一些炎症因子在骨关节炎的病理生理过程中起着关键的作用^[26]。其中以基质金属蛋白酶家族及白细胞介素家族的表达增加与活性增强对关节软骨及滑膜组织的破坏作用最为主要。基质金属蛋白酶家族被视为软骨基质降解过程的特异性酶，特别是其对Ⅱ型胶原的降解作用，基质金属蛋白酶家族中有多个亚型具有胶原酶活性，其中以基质金属蛋白酶13作用最为显著^[27]。基质金属蛋白酶家族也同时受到白细胞介素1β等多种细胞因子的调控，白细胞介素1目前被广泛认为在其中作为关键性致炎因子存在，介导软骨细胞的变性死亡，以及关节液的分解代谢，其异常表达，其中以白细胞介素1β增高为主^[28-30]。

当前实验设计不同的牵伸高度观察关节牵伸技术对关节软骨修复的影响，发现在正常关节间隙牵伸情况下并不能取得很好的软骨再生效果，软骨修复大体ICRS评分较低，组织学染色显示软骨缺损区多以纤维组织填充为主，无明显的软骨四层结构，仅底层可见少量的软骨细胞团，Mankin评分较高。1.5倍、2.0倍正常关节间隙牵伸组牵伸效果较好，软骨修复大体ICRS评分明显高于正常关节间隙牵伸组，Mankin评分明显低于正常关节间隙牵伸组。免疫组织化学染色检测软骨组织中软骨组织白细胞介素1β、基质金属蛋白酶13的表达各牵伸组累积吸光度值显著低于模型组，其中正常关节间隙牵伸组分值显著高于1.5倍和2.0倍正常关节间隙牵伸组。

上述结果证实了Ilizarov环形外固定架可以确保兔膝关节牵伸效果，去除关节的机械力学刺激，同时允许活动保证关节内流体静水压的变化，从而促进软骨细胞的再生。并且不同的牵伸高度对软骨的再生有比较直观的影响，1.5倍、2.0倍正常关节间隙牵伸组软骨再生效果明显优于正常关节间隙牵伸组，后者牵伸效果不佳可能与软骨面仍有接触、关节内流体静水压的变化有关。但不同关节牵伸间隙与关节内的流体静水压的确切关系以及再生软骨在拆除外架后能否承受机械力学刺激等方面仍需进一步的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关节牵伸高度对膝骨关节炎模型兔软骨修复的影响

Influence of joint distraction height on cartilage repair in rabbit models of knee oteoarthritis

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