miRNA-196a-5p调控Smad4表达对胃癌干细胞特性的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0907

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (21): 3310-3315.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0907

• 肿瘤干细胞 cancer stem cells • 上一篇下一篇

miRNA-196a-5p调控Smad4表达对胃癌干细胞特性的影响

郭睿¹，戴建峰²，罗玉明¹，赵海明¹，唐鹏¹

¹四川省医学科学院•四川省人民医院东院消化内科，四川省成都市 610000；²四川广播电视大学农林卫生学院，四川省成都市 610000

修回日期:2018-05-14 出版日期:2018-07-28 发布日期:2018-07-28
通讯作者: 戴建峰，硕士，讲师，四川广播电视大学农林卫生学院，四川省成都市 610000
作者简介:郭睿，女，1981年生，四川省乐山市人，汉族，2009年泸州医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事胃肠道疾病方面的研究。
基金资助:
2017年四川省卫生和计划生育委员会科研课题、普及应用项目(17PJ041)

Regulation of Smad4 by miRNA-196a-5p influences gastric cancer stem cell characteristics

Guo Rui¹, Dai Jian-feng², Luo Yu-ming¹, Zhao Hai-ming¹, Tang Peng¹

¹Department of Gastroenterology, the East Branch of Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610000, Sichuan Province, China; ²College of Forestry and Health, Sichuan Radio and TV University, Chengdu 610000, Sichuan Province, China

Revised:2018-05-14 Online:2018-07-28 Published:2018-07-28
Contact: Dai Jian-feng, Master, Lecturer, College of Forestry and Health, Sichuan Radio and TV University, Chengdu 610000, Sichuan Province, China
About author:Guo Rui, Master, Attending physician, Department of Gastroenterology, the East Branch of Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610000, Sichuan Province, China
Supported by:
the Scientific Research Project of Sichuan Provincial Health and Family Planning Committee in 2017, No. 17PJ041

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
肿瘤干细胞：是一类未分化的肿瘤细胞，能够进行自我更新和多向分化，具有高度致瘤性，是促进肿瘤侵袭转移的原动力，在肿瘤发生、发展、侵袭、转移、耐药及复发等过程中，均发挥重要作用，提示治愈肿瘤的关键可能在于根除肿瘤干细胞。
Smad4：TGF-β/Smads信号通路在多种细胞生理过程中发挥作用，近年来，越来越多的研究关注其在肿瘤中的作用。Smad4作为Smads的重要成员，Smad4表达缺失与乳腺癌、胃癌等多种恶性肿瘤相关，尤其是在肿瘤细胞的上皮-间质转化及侵袭过程中发挥至关重要的调节作用。

摘要
背景：miRNA-196a是新近发现的与乳腺癌、宫颈癌等多种肿瘤相关的microRNAs生物靶分子。研究证实，miRNA-196a-5p在胃癌细胞株和胃癌组织中均表达增加，然而，关于miRNA-196a-5p在胃癌干细胞中的功能和机制研究甚少。
目的：分析miRNA-196a-5p在胃癌干细胞侵袭中的作用及机制。
方法：流式细胞术分选胃癌BGC-823细胞株中的CD44+细胞(即胃癌干细胞)，qRT-PCR检测miRNA-196a-5p表达，Transwell实验检测细胞侵袭能力；参照Lipofectamine 2000转染试剂说明书的操作步骤，将miRNA-196a-5p inhibitor(即miRNA-196a-5p INH)转染至细胞中；双荧光素酶报告基因实验验证miRNA-196a-5p对Smad4基因的调控作用；Western blotting实验检测上皮-间质转化相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin和Vimentin)和Smad4蛋白表达。
结果与结论：①miRNA-196a-5p在胃癌干细胞中表达增加(P < 0.05)；②抑制miRNA-196a-5p表达后，能够降低胃癌干细胞的侵袭能力(P < 0.05)，增加E-cadherin蛋白表达(P < 0.05)，降低N-cadherin和Vimentin蛋白表达(P均< 0.05)，增加Smad4蛋白表达(P < 0.05)；③结果表明，miRNA-196a-5p通过调控Smad4表达在胃癌干细胞上皮-间质转化和侵袭过程中发挥重要作用，miRNA-196a-5p具有作为胃癌治疗靶标的潜能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-6350-5394(郭睿)

关键词: miRNA-196a-5p, 胃癌干细胞, 上皮-间质转化, 侵袭, Smad4

Abstract:

BACKGROUND: miRNA-196a is a recently discovered microRNAs biotarget molecule associated with various tumors such as breast cancer and cervical cancer. Studies have confirmed that miRNA-196a-5p is upregulated in both gastric cancer cell line and gastric cancer tissues. However, little is known about the function and mechanism of miRNA-196a-5p in gastric cancer stem cells.
OBJECTIVE: To analyze the function of miRNA-196a-5p in the invasion of gastric cancer stem cells and to investigate the possible mechanism.
METHODS: CD44⁺ gastric cancer stem cells were sorted from the gastric cancer BGC-823 cell line using flow cytometry. The expression of miRNA-196a-5p was detected by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and the cell invasion was determined by Transwell assay. With reference to the specification of Lipofectamine 2000m kit, miRNA-196a-5p inhibitor (miRNA-196a-5p INH) was transferred into the sorted cells. Regulation of Smad4 gene by the miRNA-196a-5p was validated by dual-luciferase reporter gene assay. Expression of epithelial-mesenchymal transition-associated proteins (E-cadherin, N-cadherin and Vimentin) and Smad4 protein was evaluated by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: The miRNA-196a-5p was up-regulated in the gastric cancer stem cells (P < 0.05). Inhibiting the miRNA-196a-5p expression could reduce the invasion ability of gastric cancer stem cells (P < 0.05), increase the E-cadherin protein expression (P < 0.05), decrease the N-cadherin and Vimentin protein expression (P < 0.05), and enhance the Smad4 protein expression (P < 0.05). Therefore, miR-196a-5p has a key role in epithelial-mesenchymal transition and invasion by targeting Smad4 in the gastric cancer stem cells. miR-196a-5p may serve as a potential target for gastric cancer therapy.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stomach Neoplasms, Neoplasm Invasiveness, Neoplastic Stem Cells, MicroRNAs, Smad4 Protein, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

郭睿，戴建峰，罗玉明，赵海明，唐鹏. miRNA-196a-5p调控Smad4表达对胃癌干细胞特性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(21): 3310-3315.

Guo Rui, Dai Jian-feng, Luo Yu-ming, Zhao Hai-ming, Tang Peng. Regulation of Smad4 by miRNA-196a-5p influences gastric cancer stem cell characteristics[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(21): 3310-3315.

图/表（结果） 1

2.1 胃癌干细胞的分选 采用流式细胞术分选胃癌BGC-823细胞系中的肿瘤干细胞，分选前后CD44⁺细胞百分比分别为(3.58±0.95)%和(94.65±6.47)%，差异有显著性意义(t=-24.121，P=0.000)，成功分选得到胃癌干细胞。

2.2 胃癌干细胞的侵袭能力增强 Transwell实验结果显示，CD44⁺细胞的侵袭细胞数为(169.54±17.24)个，显著高于CD44^-细胞(86.49±9.37)个，差异有显著性意义(t=7.331，P=0.001)，见图1。

2.3 miRNA-196a-5p调节胃癌干细胞的侵袭能力 Real-time PCR结果显示，CD44⁺细胞中miRNA-196a-5p相对表达量(4.28±0.59)显著高于CD44^-细胞(1.13±0.43)，差异有显著性意义(t=7.473，P=0.001)。

Transwell实验结果显示，CD44⁺+miRNA-196a-5p INH组的侵袭细胞数(75.36±9.24)个，明显低于CD44⁺+NC组(175.64±14.26)个，差异有显著性意义(t=11.385，P=0.000)，而CD44⁺+miRNA-196a-5p INH组与CD44^-+NC组[(71.65±6.85)个]之间的侵袭细胞数差异无显著性意义(t=0.559，P=0.303)，见图2。

Western blotting实验结果显示，CD44⁺+miRNA- 196a-5p INH组E-cadherin蛋白相对表达量(0.41±0.05)高于CD44⁺+NC细胞(0.11±0.02)，差异有显著性意义(t=9.649，P=0.003)，CD44⁺+miRNA-196a-5p INH组与CD44^-+NC组(0.43±0.07)之间差异无显著性意义(t=-0.643，P=0.278)，见图3；CD44⁺+miRNA-196a-5p INH组N-cadherin蛋白相对表达量(0.09±0.02)低于CD44⁺+NC组(0.22±0.04)，差异有显著性意义(t=-5.422，P=0.003)，CD44⁺+miRNA-196a-5p INH组与CD44^-+NC组(0.09± 0.03)之间差异无显著性意义(t=-0.480，P=0.328)，见图3；CD44⁺+miRNA-196a-5p INH组中Vimentin蛋白相对表达量(0.13±0.04)低于CD44⁺+NC组(0.89±0.19)，差异有显著性意义(t=-6.780，P=0.001)，CD44⁺+miRNA-196a-5p INH组与CD44^-+NC组(0.12±0.03)之间差异无显著性意义(t=0.346，P=0.373)，见图3。

2.4 Smad4是miRNA-196a-5p靶基因 生物信息学软件(www.targetscan.org，www.microrna.org)分析结果显示，miRNA-196a-5p与Smad4 mRNA 3’-UTR区域具有潜在结合位点，见图4。Western blotting实验结果显示，CD44⁺+miRNA-196a-5p INH组Smad4蛋白相对表达量(2.06±0.29)高于CD44⁺+NC组(0.38±0.06)，差异有显著性意义(t=9.826，P=0.000)，CD44⁺+miRNA-196a-5p INH组与CD44^-+NC组(1.98±0.34)之间差异无显著性意义(t=0.310，P=0.386)，见图5。
双荧光素酶实验结果显示，miRNA-196a-5p mimics+psicheck-Smad4-wt细胞的相对荧光强度(0.46±0.12)显著低于NC+psicheck-Smad4-wt细胞(1.06±0.14) (t=-5.636，P=0.002)，而miRNA-196a-5p mimics+psicheck-Smad4- mut细胞的相对荧光强度(1.02±0.13)与NC+psicheck- Smad4-wt细胞(1.01±0.15)之间差异无显著性意义(t=0.087，P=0.467)。

参考文献

[1] Chen W, Zheng R, Zhang S, et al. Report of incidence and mortality in China cancer registries, 2009. Chin J Cancer Res. 2013;25(1):10-21.

[2] Kim TH, Shivdasani RA. Stomach development, stem cells and disease. Development. 2016;143(4):554-565.

[3] Miller KD, Siegel RL, Lin CC, et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 2016;66(4): 271-289.

[4] Zhang X, Hua R, Wang X, et al. Identification of stem-like cells and clinical significance of candidate stem cell markers in gastric cancer. Oncotarget. 2016;7(9):9815-9831.

[5] Zhang WJ, Zhou ZH, Guo M, et al. High Infiltration of Polarized CD163+ Tumor-Associated Macrophages Correlates with Aberrant Expressions of CSCs Markers, and Predicts Prognosis in Patients with Recurrent Gastric Cancer. J Cancer. 2017;8(3):363-370.

[6] Liu S, Clouthier SG, Wicha MS. Role of microRNAs in the regulation of breast cancer stem cells. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 2012;17(1):15-21.

[7] Liu N, Zhong L, Zeng J, et al. Upregulation of microRNA-200a associates with tumor proliferation, CSCs phenotype and chemosensitivity in ovarian cancer. Neoplasma. 2015;62(4): 550-559.

[8] Lee SJ, Seo JW, Chae YS, et al. Genetic polymorphism of miR-196a as a prognostic biomarker for early breast cancer. Anticancer Res. 2014;34(6):2943-2949.

[9] Gocze K, Gombos K, Juhasz K, et al. Unique microRNA expression profiles in cervical cancer. Anticancer Res. 2013; 33(6):2561-2567.

[10] Sun M, Liu XH, Li JH, et al. MiR-196a is upregulated in gastric cancer and promotes cell proliferation by downregulating p27(kip1). Mol Cancer Ther. 2012;11(4):842-852.

[11] Tsai MM, Wang CS, Tsai CY, et al. MicroRNA-196a/-196b promote cell metastasis via negative regulation of radixin in human gastric cancer. Cancer Lett. 2014;351(2):222-231.

[12] Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2018. CA Cancer J Clin. 2018;68(1):7-30.

[13] Zhang J, Gan L, Xu MD, et al. The prognostic value of age in non-metastatic gastric cancer after gastrectomy: a retrospective study in the U.S. and China. J Cancer. 2018; 9(7):1188-1199.

[14] Yin J, Song JN, Bai ZG, et al. Gastric Cancer Mortality Trends in China (2006-2013) Reveal Increasing Mortality in Young Subjects. Anticancer Res. 2017;37(8):4671-4679.

[15] 邹文斌,杨帆,李兆申.中国胃癌诊治关键在于提高早期诊断率[J].浙江大学学报:医学版,2015,44(1):9-14,53.

[16] Mitra A, Mishra L, Li S. EMT, CTCs and CSCs in tumor relapse and drug-resistance. Oncotarget. 2015;6(13): 10697-10711.

[17] Jeong YJ, Oh HK, Park SH, et al. Association between inflammation and cancer stem cell phenotype in breast cancer. Oncol Lett. 2018;15(2):2380-2386.

[18] Carmon KS, Gong X, Yi J, et al. LGR5 receptor promotes cell-cell adhesion in stem cells and colon cancer cells via the IQGAP1-Rac1 pathway. J Biol Chem. 2017;292(36): 14989-15001.

[19] Wang M, Yang F, Qiu R, et al. The role of mmu-miR-155-5p-NF-κB signaling in the education of bone marrow-derived mesenchymal stem cells by gastric cancer cells. Cancer Med. 2018;7(3):856-868.

[20] Takaishi S, Okumura T, Tu S, et al. Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44. Stem Cells. 2009;27(5):1006-1020.

[21] Han S, Guo J, Liu Y, et al. Knock out CD44 in reprogrammed liver cancer cell C3A increases CSCs stemness and promotes differentiation. Oncotarget. 2015;6(42): 44452-44465.

[22] Senel F, Kökenek Unal TD, Karaman H, et al. Prognostic Value of Cancer Stem Cell Markers CD44 and ALDH1/2 in Gastric Cancer Cases. Asian Pac J Cancer Prev. 2017;18(9): 2527-2531.

[23] Zhang C, Li C, He F, et al. Identification of CD44+CD24+ gastric cancer stem cells. J Cancer Res Clin Oncol. 2011; 137(11):1679-1686.

[24] Song Z, Yue W, Wei B, et al. Sonic hedgehog pathway is essential for maintenance of cancer stem-like cells in human gastric cancer. PLoS One. 2011;6(3):e17687.

[25] Shitara K, Doi T, Nagano O, et al. Dose-escalation study for the targeting of CD44v+ cancer stem cells by sulfasalazine in patients with advanced gastric cancer (EPOC1205). Gastric Cancer. 2017;20(2):341-349.

[26] Kulkarni M, Tan TZ, Syed Sulaiman NB, et al. RUNX1 and RUNX3 protect against YAP-mediated EMT, stem-ness and shorter survival outcomes in breast cancer. Oncotarget. 2018; 9(18):14175-14192.

[27] Brabletz T, Kalluri R, Nieto MA, et al. EMT in cancer. Nat Rev Cancer. 2018;18(2):128-134.

[28] Suarez-Carmona M, Lesage J, Cataldo D, et al. EMT and inflammation: inseparable actors of cancer progression. Mol Oncol. 2017;11(7):805-823.

[29] Wang J, Wang X, Liu F, et al. microRNA-335 inhibits colorectal cancer HCT116 cells growth and epithelial- mesenchymal transition (EMT) process by targeting Twist1. Pharmazie. 2017;72(8):475-481.

[30] Tang CP, Zhou HJ, Qin J, et al. MicroRNA-520c-3p negatively regulates EMT by targeting IL-8 to suppress the invasion and migration of breast cancer. Oncol Rep. 2017;38(5): 3144-3152.

[31] Lu Z, Nian Z, Jingjing Z, et al. MicroRNA-424/E2F6 feedback loop modulates cell invasion, migration and EMT in endometrial carcinoma. Oncotarget. 2017;8(69): 114281-114291.

[32] Pereira-da-Silva T, Coutinho Cruz M, Carrusca C, et al. Circulating microRNA profiles in different arterial territories of stable atherosclerotic disease: a systematic review. Am J Cardiovasc Dis. 2018;8(1):1-13.

[33] Deng Z, He Y, Yang X, et al. MicroRNA-29: A Crucial Player in Fibrotic Disease. Mol Diagn Ther. 2017;21(3):285-294.

[34] Ma C, Huang T, Ding YC, et al. MicroRNA-200c overexpression inhibits chemoresistance, invasion and colony formation of human pancreatic cancer stem cells. Int J Clin Exp Pathol. 2015;8(6):6533-6539.

[35] Yu D, Shin HS, Lee YS, et al. miR-106b modulates cancer stem cell characteristics through TGF-β/Smad signaling in CD44-positive gastric cancer cells. Lab Invest. 2014;94(12): 1370-1381.

[36] Yang JP, Yang JK, Li C, et al. Downregulation of ZMYND11 induced by miR-196a-5p promotes the progression and growth of GBM. Biochem Biophys Res Commun. 2017;494 (3-4):674-680.

[37] Maruyama T, Nishihara K, Umikawa M, et al. MicroRNA-196a-5p is a potential prognostic marker of delayed lymph node metastasis in early-stage tongue squamous cell carcinoma. Oncol Lett. 2018;15(2):2349-2363.

[38] Zhang W, Li Y. miR-148a downregulates the expression of transforming growth factor-β2 and SMAD2 in gastric cancer. Int J Oncol. 2016;48(5):1877-1885.

[39] Wang XH, Liu MN, Sun X, et al. TGF-β1 pathway affects the protein expression of many signaling pathways, markers of liver cancer stem cells, cytokeratins, and TERT in liver cancer HepG2 cells. Tumour Biol. 2016;37(3):3675-3681.

[40] Liu TJ, Guo JL, Wang HK, et al. Semaphorin-7A contributes to growth, migration and invasion of oral tongue squamous cell carcinoma through TGF-β-mediated EMT signaling pathway.Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2018;22(4):1035-1043.

[41] Goto M, Osada S, Imagawa M, et al. FAD104, a regulator of adipogenesis, is a novel suppressor of TGF-β-mediated EMT in cervical cancer cells. Sci Rep. 2017;7(1):16365.

[42] Yang H, Zhan L Yang T, et al. Ski prevents TGF-β-induced EMT and cell invasion by repressing SMAD-dependent signaling in non-small cell lung cancer. Oncol Rep. 2015; 34(1):87-94.

引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外实验。

1.2 时间及地点 于2015年8月至2017年12月在四川省人民医院器官移植转化医学四川省重点实验室完成。

1.3 材料 人胃癌细胞株BGC-823、HEK-293T细胞(美国ATCC细胞库)；细胞培养基及添加试剂(美国Gibco公司)；CD44-FITC抗体(美国Abcam公司)；miRNA提取试剂盒(mirVana^TM，AM1560)；miRNA qRT-PCR引物试剂盒(Bulge Loop^TM，MQP-0101)；引物序列(上海生工生物工程技术服务有限公司)；Lipofectamine 2000转染试剂(美国Thermo公司)；双荧光素酶检测试剂盒(广州赛哲生物科技股份有限公司)；E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Smad4和GAPDH抗体(美国Abcam公司)；流式细胞仪(FACSCalibur，美国BD公司)；定量PCR仪(7500，美国ABI公司)；显微镜(CKX41，日本OLYMPUS公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养 人胃癌细胞株BGC-823培养于DH培养基(含体积分数为10%胎牛血清、1% L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素)，HEK-293T细胞培养于DMEM培养基(含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素)，均置于37 ℃、体积分数为5% CO₂饱和湿度的培养箱中。

1.4.2 流式细胞术分选胃癌干细胞 取对数生长期的BGC-823细胞，0.25%胰蛋白酶消化后，采用无血清培养基(DMEM/F12、20 mg/L B27、20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、10 μg/L表皮细胞生长因子和10 μg/L白血病抑制因子)制备细胞悬液，加入CD44-FITC抗体(稀释比例1∶400)，4 ℃孵育1 h，PBS洗涤后，采用流式细胞仪进行分选，CD44阳性(CD44⁺)细胞即为胃癌干细胞。流式细胞仪检测分选前后胃癌细胞中CD44⁺细胞百分比。

1.4.3 实时定量PCR(qRT-PCR) 参照miRNA提取试剂盒说明书的操作步骤，提取细胞内的总RNA，测定浓度和纯度后，参照miRNA qRT-PCR引物试剂盒和qRT-PCR Starter试剂盒说明书的反应体系和反应条件(95 ℃，20 s；95 ℃，10 s；60 ℃，20 s；97℃，10 s，共40个循环)，采用定量PCR仪进行实验，miRNA-196a-5p正向引物序列：5’-CTG GAG TAG GTA GTT TCA TGT TG-3’，miRNA-196a-5p反向引物序列：5’-GTG CAG GGT CCG AGG T-3’，U6正向引物序列：5’-CTG GCT TCG GCA GCA CAT ATA CT-3’，U6反向引物序列：5’-ACG CTT CAC GAA TTT GCG TGTC-3’，以U6为内参，计算miRNA-196a-5p相对表达量(2^-^??Ct)。

1.4.4 细胞侵袭实验 将Transwell小室(8.0 μm孔径)放置于24孔板中，PBS稀释Matrigel胶后，取100 μL至Transwell小室的上室，置于培养箱中，1 h后用无血清培养基制备细胞悬液，接种100 μL细胞悬液(约2×10⁵细胞)至Transwell小室的上室(避免产生气泡)，24孔板下室加入600 μL含体积分数为20%胎牛血清的培养基，置于培养箱常规培养24 h，棉签擦去上室细胞未侵袭细胞，将Transwell小室置于体积分数为100%甲醇中固定15 min，PBS洗涤3次，DAPI染色，显微镜下进行观察，随机选取5个视野，进行细胞计数。

1.4.5 细胞转染实验 取对数生长期的细胞，0.25%胰蛋白酶消化后，制备细胞悬液，接种于6孔板中(1×10⁵/孔)，置于培养箱中培养16-24 h，参照Lipofectamine 2000转染试剂说明书的操作步骤，分别将miRNA-196a-5p inhibitor (即miRNA-196a-5p INH)、阴性对照转染至细胞中(miRNA终浓度为60 nmol/L)，4 h后更换培养液，72 h后收集细胞，用于提取细胞RNA和蛋白质。

1.4.6 双荧光素酶报告基因实验 将Smad4信使RNA (mRNA)的3’-非编码区(3’-UTR)克隆至 psicheck-2载体，构建psicheck-SMAD4-wt报告基因质粒；将Smad4 mRNA 3’-UTR突变后克隆至psicheck-2载体，构建psicheck-Smad4-mut报告基因质粒。取对数生长期的HEK-293T细胞，0.25%胰蛋白酶消化后，制备细胞悬液，接种于24孔板中(5×10⁴/孔)，置于培养箱中培养16-24 h，参照Lipofectamine 2000转染试剂说明书的操作步骤，将miRNA-196a-5p mimics或阴性对照、psicheck-SMAD4-wt或psicheck-Smad4-mut及内参质粒SV40共转染至细胞中，置于培养箱中24 h，参照双荧光素酶检测试剂盒说明书的步骤进行操作，计算相对荧光强度。

1.4.7 Western blotting实验 收集细胞，预冷PBS洗涤2次，参照细胞蛋白提取试剂盒说明书，抽提细胞全蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取等量蛋白，加入适量SDS上样缓冲液(5×)，沸水煮沸变性5 min，置于-80 ℃保存。SDS-PAGE胶分离蛋白后，湿转法将蛋白转移至PVDF膜，5% BSA溶液(TBST溶液进行配制)室温孵育1 h，分别加入E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Smad4和GAPDH一抗工作液(TBST溶液进行稀释)，室温孵育1 h，TBST溶液洗涤3次，每次3 min，分别加入HRP标记的相应二抗工作液(TBST溶液进行稀释)，室温孵育1 h，TBST溶液洗涤5次，每次3 min，ECL化学发光液进行显影，以目的蛋白与内参GAPDH灰度比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.5 主要观察指标 ①qRT-PCR检测miRNA-196a-5p表达；②Transwell实验检测细胞侵袭能力；③双荧光素酶报告基因实验验证miRNA-196a-5p对Smad4基因的调控作用；④Western blotting实验检测上皮间质转化相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin和Vimentin)和Smad4蛋白表达。

1.6 统计学分析 所有实验均独立重复至少3次，计量资料以x(_)±s形式表示，统计分析采用SPSS 20.0软件。两组间差异采用Student’s t 检验，多细胞间差异采用单因素方差分析(ANOVA)，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，具有高发病率、早期诊断率低及高死亡率等恶性特征，其早期诊断率仅约10%，5年总生存率仅约30%，严重影响人类的生存质量和生命健康^[12]。流行病学调查结果显示，中国是胃癌高发国家，胃癌发病率位居所有恶性肿瘤首位^[13-14]，每年新发病例数约占全球新发病例数的50%，死亡率也远高于其他国家，每年约有17万死亡病例^[15]。因此，寻找能够提高胃癌早期诊断率和治疗疗效的方案仍是肿瘤研究领域的热点。

近年来的研究证实，肿瘤干细胞在肿瘤恶性进展(如侵袭、复发和化疗耐药等)过程中占有重要地位^[16]，目前，已成功从乳腺癌、结肠癌以及胃癌等肿瘤细胞织中分离鉴定出肿瘤干细胞^[17-19]，同时，多种靶向肿瘤干细胞的治疗方案也应运而生，其中以肿瘤干细胞表面过表达的靶分子为靶标的靶向治疗是较为有效的治疗策略。Takaishi等^[20]首次分离出胃癌干细胞，并对其病理学意义进行了初步探究。CD44是一种跨膜糖蛋白，是多种肿瘤干细胞的表面标志物^[21-22]，Zhang等^[23]研究结果表明，CD44阳性表达的胃癌细胞具有干细胞特性，如自我更新、多向分化和高致瘤性等，Song等^[24]也证实，胃癌细胞中CD44阳性表达的细胞具有干细胞特性，故CD44可用于分离胃癌等肿瘤组织或细胞中的肿瘤干细胞^[25]。实验采用流式细胞术，成功从胃癌BGC-823细胞系中分选出CD44阳性表达的胃癌干细胞。

上皮-间质转化不仅在肿瘤侵袭中发挥关键性作用，在肿瘤复发中也扮演重要角色^[26]。上皮-间质细胞转化过程中，上皮分子E-cadherin表达降低，而间质分子N-cadherin和Vimentin表达增加^[27-28]。研究证实，microRNAs可参与调节肿瘤上皮-间质细胞转化过程^[29-31]，microRNAs属于非编码RNA，通过调控靶基因表达，参与多种生理病理过程^[32-33]，如miR-200c过表达可抑制胰腺癌干细胞侵袭^[34]，而miR-106b参与调节胃癌干细胞特性，尤其可通过转化生长因子β信号通路调控肿瘤上皮-间质细胞转化过程^[35]。研究发现，miRNA-196a-5p在胶质母细胞瘤组织、早期舌鳞状细胞癌组织中表达均增加^[36-37]，且与患者病情恶性进展关系紧密。研究结果显示，胃癌干细胞的侵袭能力显著高于胃癌非干细胞，且miRNA-196a-5p在胃癌干细胞中的相对表达量增加，提示miRNA-196a-5p高表达可能参与并促进了胃癌干细胞的侵袭过程。

实验采用细胞转染方法，抑制胃癌干细胞中miRNA- 196a-5p表达后，发现细胞侵袭能力被明显抑制，且上皮-间质细胞转化相关蛋白表达水平也发生变化，如上皮分子E-cadherin表达增加，间质分子N-cadherin和Vimentin表达降低，提示降低miRNA-196a-5p表达后，能显著阻碍胃癌干细胞上皮-间质细胞转化过程，进而抑制侵袭发生。紧接着，双荧光素酶实验结果初步揭示了miRNA-196a-5p促进胃癌干细胞侵袭的作用机制，miRNA-196a-5p可特异性与Smad4 mRNA 3’-UTR结合，抑制Smad4基因表达，Western blotting实验结果也证实，抑制miRNA-196a-5p表达能显著增加Smad4蛋白表达水平。Smad4是转化生长因子β/Smad信号通路的关键作用分子，转化生长因子β1与受体结合后，诱导Smad2/3蛋白磷酸化后，进而与Smad4结合形成多聚体，并转移至细胞核中，调控多种靶基因的表达^[38-39]。大量研究证实，转化生长因子β信号通路参与调控肿瘤上皮-间质转化过程^[40-41]，在肿瘤侵袭和复发中发挥关键性作用^[42]。实验并未对Smad4调控胃癌干细胞上皮-间质转化过程的作用机制进行探究，后续研究中将进行探讨。

综上所述，实验成功分选出胃癌干细胞，并发现胃癌干细胞的高侵袭性可能与miRNA-196a-5p高表达相关，抑制miRNA-196a-5p表达则可降低胃癌干细胞的侵袭能力，且细胞中上皮-间质转化相关蛋白也发生了相应变化，双荧光素酶实验结果进一步证实，miRNA-196a-5p可调控Smad4基因表达，这可能是miRNA-196a-5p促进胃癌干细胞侵袭的作用机制之一，miRNA-196a-5p具有作为胃癌治疗靶标的潜能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

miRNA-196a-5p调控Smad4表达对胃癌干细胞特性的影响

Regulation of Smad4 by miRNA-196a-5p influences gastric cancer stem cell characteristics

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 1

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	张莹莹，王英磊，孟琳，肖琳，李忠海，赵战魁，吴厚苛. RNA干扰Id2基因表达抑制PC-3前列腺肿瘤干细胞的增殖及侵袭能力[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(9): 1342-1348.
[2]	查璐琴，韩本高，张超杰. 二甲双胍通过Akt通路调控胃癌干细胞的增殖与凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(5): 657-662.
[3]	张斌，杨微，贺宝霞，杜娟，于卫江，林晓贞，田锋奇. 依维莫司增强阿霉素抑制骨肉瘤干细胞的作用[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(5): 663-667.
[4]	张馨予，王珠慧，徐竹青，郑建金. 脐血间充质干细胞在舌鳞癌治疗中的相关研究与效应[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(33): 5392-5395.
[5]	杜锐玲. 叶黄素通过PI3K/AKT信号通路调控胃癌干细胞增殖与凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(29): 4593-4598.
[6]	夏荣钧，欧英富，邢维山，郑琳琳，于生金，林黎娟. 长链非编码RNA H19促进胃癌干细胞的增殖和转移[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(13): 2022-2027.
[7]	赵伟，唐辉，邵川，谯飞. 胰岛素样生长因子结合蛋白2促进神经胶质瘤干细胞的增殖与迁移侵袭[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(29): 4631-4636.
[8]	何新制，卢冠铭，浦涧，韦忠恒，马燕飞，陈永诚，覃强，黄前方，罗志斋. 甲状腺乳头状癌肿瘤干细胞增殖、凋亡、侵袭与miR-93的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(25): 3987-3992.
[9]	姚彬，张庆华. Wnt/β-catenin信号通路在卵巢癌干细胞增殖、迁移和侵袭中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(25): 4001-4006.
[10]	蔡尚党，蔡满地，娄宁，郭艳萍，殷涛. miR-15家族促进CD133⁺胰腺癌干样细胞的迁移和侵袭[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(21): 3316-3321.
[11]	李晓雷，徐俊，胡欣，何文武，郑银彬. SATB1基因沉默抑制食管鳞状细胞癌TE-1中肿瘤干细胞样细胞侵袭及迁移能力[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(17): 2674-2679.
[12]	李合，李军，陈兴超. miR-34a调节SIRT1表达抑制结肠癌干细胞增殖和侵袭[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(17): 2680-2685.
[13]	张宝芹. 干细胞表面标志CD133在肝癌中的表达及其阳性亚群增殖特性[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(9): 1319-1323.
[14]	胡君，汤自征，张育，沈维干，柳桂萍，王雯雯，刘家欢. 正常和类风湿关节炎关节成纤维样滑膜细胞迁移、侵袭能力的差异[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(24): 3870-3874.
[15]	余水生，程里，许新忠，柯友群，荆珏华. 趋磁细菌磁小体靶向输送pHSP70-shPLK1/阿霉素复合物治疗骨肉瘤[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(18): 2906-2912.