趋磁细菌磁小体靶向输送pHSP70-shPLK1/阿霉素复合物治疗骨肉瘤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.18.019

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (18): 2906-2912.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.18.019

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趋磁细菌磁小体靶向输送pHSP70-shPLK1/阿霉素复合物治疗骨肉瘤

余水生，程里，许新忠，柯友群，荆珏华

安徽医科大学第二附属医院骨科，安徽省合肥市 230601

收稿日期:2017-04-26 出版日期:2017-06-28 发布日期:2017-07-07
通讯作者: 荆珏华，主任医师，硕士生导师，安徽医科大学第二附属医院骨科，安徽省合肥市 230601
作者简介:余水生，男，1991年生，安徽省合肥市人，汉族，硕士，主要从事脊柱、骨肿瘤研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81441068)

Treatment of osteosarcoma by targeting transportation of pHSP70-shPLK1/DOX compounds with bacterial magnetosomes

Yu Shui-sheng, Cheng Li, Xu Xin-zhong, Ke You-qun, Jing Jue-hua

Department of Orthopaedics, the Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230601, Anhui Province, China

Received:2017-04-26 Online:2017-06-28 Published:2017-07-07
Contact: Jing Jue-hua, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Orthopaedics, the Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230601, Anhui Province, China
About author:Yu Shui-sheng, Master, Department of Orthopaedics, the Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230601, Anhui Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81441068

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

磁小体：是由趋磁细菌通过生物矿化作用在自身体内合成，化学合成方法有添加磁小体膜特异性蛋白质和低温碱性水溶液中空气氧化铁及基因工程法。磁小体在外加交变磁场的作用下可侵入肿瘤细胞，抑制其增殖，并能够发生磁致产热效应，将肿瘤组织加热到42 ℃左右而杀灭肿瘤细胞，实现磁靶向热疗。

pHSP70-shPLK1/阿霉素复合物：是包含阿霉素化疗药物和热休克蛋白-Polo样激酶1沉默基因序列的双重靶向药物。

背景：在外加变化磁场作用下，磁小体可侵入肿瘤细胞，抑制其增殖。

目的：研究趋磁细菌磁小体靶向输送pHSP70-shPLK1/阿霉素复合物治疗骨肉瘤的效果。

方法：将人源骨肉瘤细胞株U2OS分4组培养，A组加入趋磁细菌磁小体载pHSP70-shPLK1/阿霉素复合物系统；B组加入趋磁细菌磁小体载pHSP-shNC/阿霉素复合物系统；C组加入趋磁细菌磁小体载pHSP70-shPLK1/阿霉素复合物系统，同时给予磁场干预；D组加入趋磁细菌磁小体载pHSP-shNC/阿霉素复合物系统，同时给予磁场干预；pHSP-shNC为pHSP70-shPLK1的空白对照。培养12，24，48，72 h，观察骨肉瘤细胞对复合物的摄取率，流式细胞术观察细胞周期，RT-PCR法和Western blot法检测细胞中PLK1 mRNA和蛋白表达水平，MTT法检测细胞增殖，黏附实验和Transwell小室检测细胞黏附性和侵袭能力，凋亡试剂盒检测细胞凋亡率。

结果与结论：①培养12，24 h，D组摄取率最高；培养48，72 h，B组摄取率最高；②A组、C组和D组G₂/M期比率逐渐降低，G₀/G₁期比率逐渐增加，C组G₂/M期比率各时间点最低，其次为D组，A组最高；B组G₂/M期比率逐渐增加；③培养12，24 h，B组、D组PLK1表达高于A组、C组(P < 0.05)；培养48，72 h，B组PLK1表达高于其余3组(P < 0.05)，D组高于A组、C组(P < 0.05)；④B组不同时间点的细胞增殖、黏附率及侵袭能力最高，细胞凋亡率最低；C组不同时间点的细胞增殖、黏附率及侵袭能力最低，细胞凋亡率最高；⑤结果表明，趋磁细菌磁小体靶向输送pHSP70-shPLK1/阿霉素复合物能够增强骨肉瘤细胞凋亡的发生，抑制其增殖和侵袭。

ORCID: 0000-0003-3550-8528(荆珏华)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 控释材料, 趋磁细菌, 磁小体, 骨肉瘤, pHSP70-shPLK1/阿霉素复合物, 增殖, 黏附, 侵袭, 凋亡, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: In an additional changing magnetic field, magnetosomes can invade the tumor cells and inhibit their proliferation.

OBJECTIVE: To study the effect of targeted delivery of pHSP70-shPLK1/DOX compounds with magnetosome of magnetotactic bacteria on the treatment of osteosarcoma.

METHODS: Human osteosarcoma cell U2OS was divided into four groups: group A: magnetosomes of magnetotactic bacteria+pHSP70-shPLK1/DOX complex; group B: magnetosomes of magnetotactic bacteria; group C: magnetosomes of magnetotactic bacteria+pHSP70-shPLK1/DOX complex, combined with magnetic intervention; group D: magnetosomes of magnetotactic bacteria, combined with magnetic intervention. After 12, 24, 48 and 72 hours of culture, the uptake rate of osteosarcoma cells was observed; cell cycle was evaluated by flow cytometry; PLK1 mRNA and protein expression levels were detected by RT-PCR and western blot, respectively; cell proliferation was explored by MTT assay; cell adhesion and invasion were checked by adhesion assay and Transwell chamber assay, respectively; and the apoptosis rate was measured by apoptosis detection Kit.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) After culture of 12 and 24 hours, the uptake rate was the highest in group D; meanwhile, the uptake rate was the highest in group B after 48 and 72 hours of culture. (2) The ratio of G₂/M phase decreased and the ratio of G₀/G₁ increased gradually in group A, group C and group D; the G₂/M phase ratio of C group was the lowest at each time point, followed by group D, and that of group A was the highest; and the G₂/M phase ratio increased gradually in group B. (3) Following 12 and 24 hours of culture, the expression of PLK1 in group B and group D was higher than that in group A and group C (P < 0.05); in addition, the expression of PLK1 in group B was higher than that in the other three groups after 48 and 72 hours of culture (P < 0.05), and the PLK1 level in group D was higher than that in group A and group C (P < 0.05). (4) The proliferation, adhesion and invasion ability in group B were the highest at different time points, but the apoptosis rate was the lowest. Furthermore, the proliferation, adhesion and invasion abilities in group C were the lowest at different time points, and the apoptosis rate was the highest. To conclude, our experimental results show that the targeted delivery of pHSP70-shPLK1/DOX complex by magnetosomes of magnetotactic bacteria can enhance the apoptosis of osteosarcoma cells and inhibit their proliferation and invasion.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Magnetosomes, Osteosarcoma, Cell Proliferation, Apoptosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

余水生，程里，许新忠，柯友群，荆珏华. 趋磁细菌磁小体靶向输送pHSP70-shPLK1/阿霉素复合物治疗骨肉瘤[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(18): 2906-2912.

Yu Shui-sheng, Cheng Li, Xu Xin-zhong, Ke You-qun, Jing Jue-hua.

Treatment of osteosarcoma by targeting transportation of pHSP70-shPLK1/DOX compounds with bacterial magnetosomes [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(18): 2906-2912.

图/表（结果） 6

2.1 各组细胞对复合物的摄取率及形态学变化

对复合物的摄取率：B组摄取率随时间延长逐渐增加；D组24 h达峰值，48 h逐渐回落；A组和C组12 h达峰值，24 h逐渐回落。培养12 h时，D组摄取率最高，其次为C组，B组和A组最少；培养24 h时，D组最高，其次为B组，A组和C组最少；培养48，72 h时，B组最高，其次为D组，A组和C组最少，见表1。

细胞形态变化：①A组、C组：培养12 h时，细胞形态不完整，细胞质浓缩，染色质凝集，细胞膜表面微绒毛消失，胞质内许多空泡样变，凋亡小体形成，凋亡较多，荧光较强；培养24，48，72 h时，细胞形态不完整，凋亡逐渐减少，荧光逐渐减弱；②B组：培养12 h时，细胞形态相对较完整，内可见多个细胞核，核仁大明显，微绒毛和内质网丰富，染色质分布较均匀，凋亡相对较少，荧光较强；培养24，48，72 h时，细胞形态较完整，荧光逐渐增强；③D组：培养12，24 h时，细胞形态不完整，凋亡较多，荧光较强；培养48，72 h时，细胞形态不完整，凋亡逐渐减少，荧光逐渐减弱。

2.2 各组细胞周期的比较 A组、C组和D组G₂/M期比率逐渐降低，G₀/G₁期比率逐渐增加；C组G₂/M期比率各时间点最低，其次为D组，A组最高；B组G_2/M期比率逐渐增加，见图1。培养12 h时，G₂/M期比率除了A组与D组、B组与D组比较无差异外，其余组间两两比较差异均有显著性意义(P < 0.05)；G₀/G₁期比率除了A组与D组比较无差异外，其余组间两两比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。培养24，48，72 h时，G₂/M期、G₀/G₁期比率组间两两比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。

2.3 各组细胞中PLK1 mRNA和蛋白表达水平的比较 B组PLK1 mRNA和蛋白表达水平随时间延长逐渐增加；D组24 h达峰值，48 h逐渐回落；A组和C组12 h达峰值，24 h逐渐回落。培养12 h时，B组、D组PLK1 mRNA和蛋白表达高于A组、C组(P < 0.05)，A组高于C组(P < 0.05)，B组与D组比较无差异。培养24 h时，B组、D组PLK1 mRNA和蛋白表达高于A组、C组(P < 0.05)，B组与D组比较无差异，A组高于C组(P < 0.05)。培养48，72 h时，B组PLK1 mRNA和蛋白表达高于D组、A组、C组(P < 0.05)，D组高于A组、C组(P < 0.05)，A组高于C组(P < 0.05)，见表2。

2.4 各组细胞增殖的比较 B组增殖随时间延长逐渐增加；D组24 h达峰值，48 h逐渐回落；A组和C组12 h达峰值，24 h逐渐回落。培养12 h时，A组、B组、D组细胞增殖高于C组(P < 0.05)，A组、B组、D组间比较无差异。培养24，48，72 h时，B组细胞增殖高于D组、A组、C组(P < 0.05)，D组高于A组、C组(P＜0.05)，A组高于C组(P< 0.05)，见表3。

2.5 各组细胞黏附率和侵袭能力的比较 B组细胞黏附率和侵袭能力随时间延长逐渐增加；D组黏附率和侵袭能力24 h达峰值，48 h逐渐回落；A组和C组黏附率和侵袭能力12 h达峰值，24 h逐渐回落，见表4。

2.6 各组细胞凋亡率的比较 B组凋亡率无改变且始终最低，其余3组随时间延长逐渐增加；C组各时间点凋亡率均高于A组、D组(P < 0.05)；A组和D组各时间点凋亡率比较均无差异，见表5。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学观察实验。

1.2 时间及地点实验于2015至2016年在安徽医科大学第二附属医院中心实验室完成。

1.3 材料人源骨肉瘤细胞株U2OS(上海生工细胞中心)；趋磁细菌AMB-1(中国科学院电工研究所提供)；pHSP70-shPLK1/阿霉素复合物(安徽医科大学第二附属医院中心实验室)；DMEM高糖培养基(Hyclone公司)；胎牛血清(四季青公司)；激光共聚焦显微镜(Media Cybernetics 公司，Washington，USA)；FACS Caliber型流式细胞仪(BD公司，New Jersey state，USA)；PCR扩增仪(北京六一厂)；电泳仪(Bio-Rad公司)；鼠抗人PLK1单克隆抗体、兔抗鼠IgG多克隆抗体(sigma 公司，St. Louis，MO，USA)；MTT、DMSO(北京碧云天科技有限公司)；Transwell小室(北京中杉金桥生物有限公司)；凋亡试剂盒(Invitrogen公司，Carlsbad， California，USA)。

1.4 实验方法

1.4.1 制备磁小体将AMB-1接种入强化培养基EMSGM中，28 ℃温箱中培养5 d，4 ℃ 11 000 r/min离心8 min，收集AMB-1细胞，将其悬浮于pH=7.4的0.1 mol/L PBS中，用超声波细胞破碎机(300 W，4 s，间隔8 s，重复80次)，趋磁细菌磁小体被吸附在烧杯底部的磁铁吸收，细胞碎片被去除，再重悬浮于pH=7.4的0.1 mol/L PBS中并收集趋磁细菌磁小体沉淀物，用超声波清洗(45 W，持续4 s，间隔 8 s，重复40次)处理，所有过程重复15次，将纯化的趋磁细菌磁小体通过⁶⁰Co照射(15 kGy)灭菌，重悬于pH=7.4的0.1 mol/L PBS中。

1.4.2 制备磁小体与pHSP70-shPLK1/阿霉素复合物系统将所需量的1 g/L阿霉素溶液(溶于蒸馏水)加入到200 mg/L趋磁细菌磁小体悬浮液中，并用超声波洗浴处理10 min，以均匀分布趋磁细菌磁小体；然后，在蒸馏水中制备聚乙烯亚胺和pHSP70-shPLK1载体复合物，并用超声波洗浴处理5 min，最后，加入趋磁细菌磁小体/阿霉素复合物，混合物用超声波洗浴处理，直到阿霉素和趋磁细菌磁小体均匀分布。混合溶液在37 ℃下孵育6 h后，形成趋磁细菌磁小体递送的阿霉素和pHSP70-shPLK1系统。

1.4.3 实验分组将人源骨肉瘤细胞株U2OS接种于96孔板上，分4组培养，A组加入20 μL趋磁细菌磁小体载pHSP70-shPLK1/阿霉素复合物系统；B组加入20 μL趋磁细菌磁小体载pHSP-shNC/阿霉素复合物系统；C组加入 20 μL趋磁细菌磁小体载pHSP70-shPLK1/阿霉素复合物系统，同时给予磁场干预30 min；D组加入20 μL趋磁细菌磁小体载pHSP-shNC/阿霉素复合物系统，同时给予磁场干预30 min；pHSP-shNC为pHSP70-shPLK1的空白对照。体外升温实验(磁场频率为198 kHz，平均磁感应强度为20-30 mT)确定磁场强度为25 mT。于12，24，48，72 h，激光共聚焦显微镜下观察骨肉瘤细胞对复合物的摄取率及细胞形态学变化，流式细胞术观察细胞周期，RT-PCR法和Western blot法检测细胞中PLK1 mRNA和蛋白表达水平，MTT法检测细胞增殖，黏附实验和Transwell小室检测细胞黏附性和侵袭能力，凋亡试剂盒检测细胞凋亡率。

1.5 主要观察指标

骨肉瘤细胞对复合物的摄取率及细胞形态学变化：利用Hoechst33258与细胞DNA结合后发出明亮蓝色荧光，显示细胞核形态；Hoechst33258染色后，在荧光显微镜下正常的骨肉瘤细胞呈浅蓝色荧光，凋亡的骨肉瘤细胞呈亮蓝色荧光，且随摄取药物的增加，骨肉瘤细胞凋亡增多。摄取率就是通过镜下荧光的细胞的变化计算的。阿霉素为蒽环类药物，具有内在红色荧光，在激光共聚焦显微镜下观察骨肉瘤细胞摄取复合物及细胞形态学变化。

流式细胞术观察细胞周期：收集细胞，2 000×g离心10 min，加Buffer洗涤细胞2次，调整细胞浓度为1×10⁹L^-1；体积分数70%乙醇固定，1×Buffer A洗涤、离心，加500 μL 1×Buffer A，然后加入10 mg/L RNase A，终质量浓度为0.25 g/L，37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度培养箱中反应30 min；加入5 μL 50 mg/L PI染液，室温避光孵育30 min后上机观察。

RT-PCR法检测细胞中PLK1 mRNA表达水平：常规Trizol试剂提取细胞中总RNA，紫外分光光度计测定浓度和纯度，反转录试剂盒合成cDNA，合成PLK1引物序列，F：5’- GAT TCC ACG GCT TTT TCG AG-3’，R:5’-CCC ACA CAG GGT CTT CTT CC-3’，296 bp；内参β-actin，F：5’-CGC GAG AAG ATG ACC CAG AT-3’，R：5’-GCA CTG TGT TGG CGT ACA GG-3’，550 bp。反应体系为cDNA 2 μL+上下引物各3 μL+Taq 聚合酶0.5 μL+dNTPs 1 μL+MgCl₂ 3 μL+10×Buffer 5 μL+ddH₂O₂ 2.5 μL，反应条件为95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，共30个循环，72 ℃ 10 min结束。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物，凝胶成像分析系统紫外分光成像，数码照相行灰度值分析(Gel-Pro Analyzer4.0 分析软件)，结果以2^-^??Ct法表示。

Western blot法检测细胞中PLK1蛋白表达水平：常规蛋白裂解液提取总蛋白，BCA法测定浓度，制备SDS-PAGE凝胶，电转移至PVDF膜，PBST漂洗，脱脂奶粉封闭，PBST漂洗，加一抗(1∶2 000)4 ℃摇床孵育过夜；PBST漂洗，加二抗(1∶500)室温孵育2h，PBST漂洗，加Thermo Pierce ECL化学发光液显影，蛋白条带在Gel DoC 2 000凝胶成像系统中分析。

MTT法检测细胞增殖：每孔加40 μL MTT溶液，37 ℃、体积分数5%CO₂ 饱和湿度培养箱中培养4 h，弃上清，加入150 μL DMSO，摇动10 min，置于酶标仪中，测定490 nm波长的A值，630 nm为参考波长。重复3次，取平均值。

黏附实验：收集细胞，悬浮于体积分数10%胎牛血清的DMEM中，37 ℃孵育30 min，PBS洗涤，贴壁细胞用MTT染色，倒置相差显微镜下观察细胞黏附情况并照相。加入二甲基甲酰胺，37 ℃震荡孵育15 min，分光光度计490 nm波长下测量A值。

TransweⅡ小室检测细胞侵袭能力：将Matrigel基质胶放入4 ℃冰箱中24 h制备小室，50 μL Matrigel(1∶8)基质胶和400 μL Opti-MEMI 培养液加入1.5 mL EP 管中混匀，冰上操作，加入小室内，37 ℃、体积分数5%CO₂ 饱和湿度培养箱中培养1 h。用含体积分数1%胎牛血清的RPMI-1640培养液重悬细胞浓度为1×10⁹ L^-1，加细胞悬液50 μL于小室内，继续培养48 h，取出小室，PBS洗涤，乙醇固定5 min，加95%结晶紫溶液染色7 min，PBS洗涤，常温风干。取下小室膜放在载玻片上，中性树胶封固，光学显微镜下(×200)随机选择5个视野进行细胞计数，用 GraphPad Prism 5 软件分析。

凋亡试剂盒检测细胞凋亡率：收集细胞，PBS冲洗，加入荧光标记的共轭膜联蛋白及碘化丙啶，流式细胞仪检测细胞凋亡率。碘化丙啶阴性且共轭膜联蛋白阳性细胞为早期凋亡细胞，双阴性细胞为正常细胞。

1.6 统计学分析采用SPSS 20.0软件进行统计分析，计量资料以x(_)±s表示，组间比较采用单因素ANOVA分析，两两比较采用LSD-t 检验，组内比较采用重复测量数据的方差分析；P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

骨肉瘤是儿童最常见的恶性骨肿瘤，手术结合常规化疗是标准治疗，然而骨肉瘤患者的5年生存率仅为60%-70%^[18-19]，因此，需要为骨肉瘤患者开发新的合理诊断治疗方法。尽管最近在确定各种基因分子靶点方面取得了进展，并且已揭示了基于基因的靶向治疗是一种新颖的方法，但由于基因表达水平和有效区域的不足，治疗效果仍然存在不足^[20]。新的传递系统是克服上述问题的关键。

磁小体是由趋磁细菌通过生物矿化作用在自身体内合成，化学合成方法有添加磁小体膜特异性蛋白质和低温碱性水溶液中空气氧化铁及基因工程法^[21]。磁小体在外加交变磁场的作用下可侵入肿瘤细胞，抑制其增殖，并能够发生磁致产热效应，将肿瘤组织加热到42 ℃左右而杀灭肿瘤细胞，实现磁靶向热疗^[22-23]。增加磁小体浓度，提高磁小体在肿瘤细胞中的培育时间和磁场强度，增加磁热治疗次数，均可提高肿瘤细胞死亡率^[24-25]。此次研究D组就是利用磁小体和磁场共同作用抑制肿瘤增殖。磁小体表面包被生物膜，可携带抗体、酶、核酸及化疗药物。磁靶向抗肿瘤药物投递系统载药量和包封率高，具有缓释和定向给药优点^[26]。本研究一方面将趋磁细菌磁小体作为靶向给药系统的载体，另一方面利用交变磁场对趋磁细菌磁小体加热实现磁靶向热疗，增强对骨肉瘤的治疗效果。

pHSP70-shPLK1/阿霉素复合物在本课题组前期实验中已成功构建，是包含阿霉素化疗药物和HSP-PLK1沉默基因序列的双重靶向药物。PLK1在启动、维持和完成有丝分裂中发挥重要作用，是细胞周期事件的重要调控因子，可促进CDC2/cyclinB1活化、中心体成熟、双极纺锤体形成、染色体分离、调控后期促进因子复合物及执行胞质分裂等功能^[27]，同时也是DNA合成、损伤修复的重要调控因素^[28]。已证实，PLK1在卵巢癌、前列腺、食管癌、胃癌等多种恶性肿瘤中过表达，促进细胞有丝分裂持续进行，诱导基因突变，增加增殖和侵袭能力，降低凋亡率^[29]。PLK1可通过化学结合和磷酸化抑制p53功能，可能是其致癌的主要机制^[30]。将构建好的复合物利用磁小体在磁场作用下的携带复合物输送到骨肉瘤细胞中，让药物作用最大化。

磁小体由于磁产热效应而对肿瘤起到热疗作用的同时，肿瘤细胞内应激而合成一类保护性蛋白质——热休克蛋白^[31-32]。研究发现，热休克蛋白启动子可在临床上能够达到的温度下活化基因表达，使其表达升高数十倍甚至数千倍；应用热休克蛋白启动子可使下游的目的基因在肿瘤局部表达增高而在血清中表达极低，既提高局部疗效又避免全身不良反应^[33-34]。因此，研究选择热休克蛋白HSP70调控序列作为启动子，shPLK1为下游目的基因，构建重组质粒，利用磁感应加热诱导调控shPLK1的表达，使其在骨肉瘤局部表达增高而在血清或其他部位表达极低，高效地促进骨肉瘤细胞凋亡。

细胞的凋亡可通过检测细胞周期来评价。细胞周期调控紊乱是骨肉瘤的发病机制之一，而几乎所有的肿瘤都有一个根本的共同特征：细胞周期调控机制的破坏，导致细胞的失控性生长^[35-36]。研究通过流式细胞术检测细胞周期，发现C组各时间点的细胞周期G₀/G₁比率均最高，各时间点的G₂/M期比率均最低，其次为D组，A组最高，说明在复合物、磁小体和磁场的共同作用下，骨肉瘤细胞周期受到的阻滞最明显。通过凋亡试剂盒检测细胞凋亡率时也发现C组各时间点的细胞凋亡率均最高，说明在复合物、磁小体和磁场的共同作用下，骨肉瘤细胞凋亡最多。

通过此次研究得出，外加磁场增加肿瘤细胞对复合物的摄取率，但同时复合物可促使细胞凋亡，进而降低摄取率；C组G₂/M期比率各时间点最低，其次为D组，A组最高；添加药物组的PLK1 mRNA和蛋白表达水平明显降低；各时间点C组的增殖率、黏附率和侵袭能力最低，凋亡率最高。综上所述，趋磁细菌磁小体靶向输送pHSP70-shPLK1/阿霉素复合物能够增强骨肉瘤细胞的凋亡发生，抑制其增殖和侵袭；同时发挥磁小体的磁热作用，增加阿霉素化疗作用，PLK1抑制细胞有丝分裂，减少DNA损伤后的错误修复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

趋磁细菌磁小体靶向输送pHSP70-shPLK1/阿霉素复合物治疗骨肉瘤

Treatment of osteosarcoma by targeting transportation of pHSP70-shPLK1/DOX compounds with bacterial magnetosomes

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