不同年龄软骨组织多肽的定量分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0804

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
多肽：多肽类化合物广泛存在于自然界中，一般来自细胞的分泌或蛋白的分解。一般有3-50个氨基酸，相对分子质量小于10 000。这些内源多肽在生物体的各个系统内扮演了重要的角色。生命活动中的细胞分化、神经递质调节、肿瘤病变、免疫调节等均与活性多肽密切相关。
定量分析：定量分析是依据统计模型，建立数学模型，并用数学模型计算出分析对象的各项指标及其数值的一种方法。本实验通过液相色谱-串联质谱定量分析两组软骨多肽的数值，以此来判断差异多肽的高表达。

摘要
背景：大分子量蛋白质在软骨组织的生理作用已经研究很多，但小分子量的多肽却很少涉及。
目的：定量分析低年龄组和高年龄组软骨组织多肽，从差异多肽中筛选出可能跟软骨发育有关的活性多肽。
方法：收集6例低年龄组(小于3岁)和8例高年龄组(6-8岁)髂前上棘下端软骨组织标本，采用液相色谱-串联质谱定量分析不同年龄组软骨多肽，应用同位素二甲基标记法分析两组多肽组成的差异。
结果与结论：①鉴定了588个多肽在低年龄组和高年龄组软骨组织中差异表达，来源于428种蛋白质；②16个多肽在高年龄组中高表达(大于4倍)，6个多肽在低年龄组中高表达(大于4倍)；③通过差异多肽的分子质量、等电点和基因本体分析，初步了解了软骨组织多肽的分子学特征，为进一步寻找软骨组织活性多肽提供了信息。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-2401-0284(周志文)

关键词: 多肽, 质谱, 等电点, 软骨组织, 分子量, 细胞组成, 分子功能, 生物过程, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: There are many studies on the physiological roles of high-molecular-weight protein in cartilage tissue, but low-molecular-weight peptides are rarely investigated.
OBJECTIVE: To conduct a quantitative analysis of cartilage tissue peptide in low- and high-age population, and to screen active peptides related to cartilage development from the differential peptides.
METHODS: The cartilage tissue samples from six cases of low age (< 3 years old) and eight cases of high age (6-8 years old) population were collected, cartilage peptides analyzed quantitatively by liquid chromatography tandem mass spectrometry, and the differences in the peptide composition between two groups were analyzed by isotope dimethyl labeling method.
RESULTS AND CONCLUSION: We identified 588 differential peptides in the cartilage tissues of two groups, which were originated from 428 proteins. Sixteen peptides were present at higher levels in the high-age group (over 4-fold expression), and 6 were present at higher levels in the low-age group (over 4-fold expression). Through analyzing the molecular mass, isoelectric point and gene ontology of the differential peptides, we preliminarily understand the characteristics of cartilage peptides at molecular level, which provides a new perspective for searching more active cartilage peptides.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Cartilage, Peptides, Age Groups, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

周志文，鞠黎，楼跃. 不同年龄软骨组织多肽的定量分析[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(8): 1178-1183.

Zhou Zhi-wen, Ju Li, Lou Yue. Quantitative peptidomic analysis of the cartilage tissues of different ages[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(8): 1178-1183.

图/表（结果） 3

参考文献

[1] Usami Y, Gunawardena AT, Iwamoto M, et al.Wnt signaling in cartilage development and diseases: lessons from animal studies. Lab Invest.2016;96(2):186-196.

[2] Lotz M.Osteoarthritis year 2011 in review: biology. Osteoarthritis Cartilage.2012;20(3):192-196.

[3] Clouet J,Vinatier C,Merceron C,et al.From osteoarthritis treatments to future regenerative therapies for cartilage. Drug Discovery Today.2009;14(19-20):913-925.

[4] Qi H, Jin M, Duan Y,et al.FGFR3 induces degradation of BMP type I receptor to regulate skeletal development. Biochim Biophys Acta.2014;1843(7):1237-1247.

[5] Yuan H, Huang L, Hu X, et al.FGFR3 gene mutation plus GRB10 gene duplication in a patient with achondroplasia plus growth delay with prenatal onset. Orphanet J Rare Dis.2016; 11(1):89.

[6] Müller C, Khabut A, Dudhia J, et al.Quantitative proteomics at different depths in human articular cartilage reveals unique patterns of protein distribution. Matrix Biol.2014;40:34-45.

[7] Önnerfjord P, Khabut A, Reinholt FP, et al.Quantitative Proteomic Analysis of Eight Cartilaginous Tissues Reveals Characteristic Differences as well as Similarities between Subgroups. J Biol Chem. 2012;287(23):18913-18924.

[8] Brodsky B, Persikov AV.Molecular structure of the collagen triple helix. Adv Protein Chem.2005;70:301-339.

[9] Bäcklund J, Treschow A, Bockermann R, et al.Glycosylation of type II collagen is of major importance for T cell tolerance and pathology in collagen-induced arthritis. Eur J Immunol. 2002;32(12):3776-3784.

[10] Ota KG, Kuratani S.Expression pattern of two collagen type 2 alpha1 genes in the Japanese inshore hagfish (Eptatretus burgeri) with special reference to the evolution of cartilaginous tissue. J Exp Zool B Mol Dev Evol.2010;314(2):157-165.

[11] Yeung Tsang K, Wa Tsang S, Chan D, et al.The chondrocytic journey in endochondral bone growth and skeletal dysplasia. Birth Defects Res C Embryo Today. 2014;102(1):52-73.

[12] Nishimura R, Hata K, Ono K, et al.Regulation of endochondral ossification by transcription factors. Front Biosci (Landmark Ed).2012;17: 2657-2666.

[13] Ballock RT, O'Keefe RJ.Physiology and pathophysiology of the growth plate. Birth Defects Res C Embryo Today.2003; 69(2):123-143.

[14] Long F, Ornitz DM.Development of the Endochondral Skeleton. Cold Spring Harb Perspect Biol.2013;5(1):a008334.

[15] Hayakawa E, Menschaert G, De Bock PJ, et al.Improving the Identification Rate of Endogenous Peptides Using Electron Transfer Dissociation and Collision-Induced Dissociation. J Proteome Res.2013;12(12):5410-5421.

[16] Geho DH, Liotta LA, Petricoin EF, et al.The amplified peptidome: the new treasure chest of candidate biomarkers. Curr Opin Chem Biol.2006;10(1):50-55.

[17] Soloviev M, Finch P. Bridging the gap between proteome and metabolome. Proteomics.2006;6(3):744-747.

[18] Adermann K, John H, Ständker L, et al.Exploiting natural peptide diversity: novel research tools and drug leads. Curr Opin Biotechnol.2004;15(6):599-606.

[19] Shores KS, Knapp DR. Assessment Approach for Evaluating High Abundance Protein Depletion Methods for Cerebrospinal Fluid (CSF) Proteomic Analysis. J Proteome Res. 2007;6(9): 3739-3751.

[20] Srinivasan M, Patel MS. Metabolic programming in the immediate postnatal period. Trends Endocrinol Metab.2008; 19(4):146-152.

[21] Wallin E, von Heijne G. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms.Protein Sci. Protein Sci. 1998;7(4): 1029-1038.

[22] Mao Y, Kuta A, Crespo-Enriquez I, et al. Dchs1-Fat4 regulation of polarized cell behaviours during skeletal morphogenesis. Nat Commun.2016;7:11469.

[23] Kuta A, Mao Y, Martin T, et al. Fat4-Dchs1 signalling controls cell proliferation in developing vertebrae. Development. 2016;143(13):2367-2375.

[24] Juarranz Y, Gutierrez-Canas I, Santiago B, et al.Differential expression of vasoactive intestinal peptide and its functional receptors in human osteoarthritic and rheumatoid synovial fibroblasts. Arthritis Rheum.2008;58(4):1086-1095.

[25] Jiang W, Gao SG, Chen XG, et al. Expression of synovial fluid and articular cartilage VIP in human osteoarthritic knee: a new indicator of disease severity?. Clin Biochem.2012; 45(18): 1607-1612.

[26] von Rechenberg B, Mcilwraith CW, Akens MK, et al. Spontaneous production of nitric oxide (NO), prostaglandin (PGE2) and neutral metalloproteinases (NMPs) in media of explant cultures of equine synovial membrane and articular cartilage from normal and osteoarthritic joints. Equine Vet J.2000;32(2):140-150.

[27] Hernanz A, Medina S, de Miguel E, et al. Effect of calcitonin gene-related peptide, neuropeptide Y, substance P, and vasoactive intestinal peptide on interleukin-1beta, interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha production by peripheral whole blood cells from rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients. Regul Pept.2003;115(1):19-24.

[28] Matsukawa N, Grzesik W J, Takahashi N, et al. The natriuretic peptide clearance receptor locally modulates the physiological effects of the natriuretic peptide system. Proc Natl Acad Sci U S A.1999;96(13):7403-7408.

[29] Yasoda A, Komatsu Y, Chusho H, et al. Overexpression of CNP in chondrocytes rescues achondroplasia through a MAPK-dependent pathway. Nat Med.2004;10(1):80-86.

[30] Krejci P, Masri B, Fontaine V, et al. Interaction of fibroblast growth factor and C-natriuretic peptide signaling in regulation of chondrocyte proliferation and extracellular matrix homeostasis. J Cell Sci.2005;118(Pt 21):5089-5100.

[31] Amizuka N, Henderson JE, Hoshi K, et al. Programmed cell death of chondrocytes and aberrant chondrogenesis in mice homozygous for parathyroid hormone-related peptide gene deletion. Endocrinology.1996;137(11):5055-5067.

[32] Fan Y, Jianying F, Chenyan L, et al. Influence on Indian hedgehog-parathyroid hormone-like related protein pathway induced by altered masticatory loading in the condylar cartilage of growing rabbits.Hua Xi Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 2017;35(2):127-132.

[33] Kong L, Zhao Y P, Tian Q Y, et al. Extracellular matrix protein 1, a direct targeting molecule of parathyroid hormone-related peptide, negatively regulates chondrogenesis and endochondral ossification via associating with progranulin growth factor. The FASEB Journal.2016;30(8):2741-2754.

[34] Zhang H, Wang H, Zeng C, et al. mTORC1 activation downregulates FGFR3 and PTH/PTHrP receptor in articular chondrocytes to initiate osteoarthritis.Osteoarthritis Cartilage. 2017;25(6):952-963.

[35] Fischer J, Ortel M, Hagmann S, et al. Role of PTHrP(1-34) Pulse Frequency Versus Pulse Duration to Enhance Mesenchymal Stromal Cell Chondrogenesis.J Cell Physiol. 2016;231(12):2673-2681.

[36] Moore ER, Jacobs CR. The primary cilium as a signaling nexus for growth plate function and subsequent skeletal development. J Orthop Res. 2017 Sep 13. doi: 10.1002/jor.23732.

引言

软骨组织不仅在骨骼发育过程中起重要作用，而且出生后为骨骼提供平稳的运动^[1]。然而软骨的功能不良和破坏会引起许多骨骼疾病，例如骨关节炎和软骨发育不全等^[2-5]。这些疾病都会导致软骨组织退化和损坏，而且成年后的软骨组织无血管和神经支配，不能依靠自身来修复，造成大量的残疾，给人们带来了极大的痛苦。

软骨主要是由软骨细胞和细胞基质蛋白组成，包括高度硫酸化的高分子多糖、小蛋白多糖和各种胶原蛋白包括2，6，9，10，和11等^[6-7]。软骨中含有丰富的胶原蛋白，不同类型的胶原含有相同或不同的链，在其整个结构中可出现重复的典型的分子模式Gly-X-Y^[8]。Ⅱ型胶原是软骨细胞外基质中最丰富的，其含有重复甘氨酸胶原域，在许多生物学相关的功能蛋白如补体或脂联素都发现此特征^[9-10]。软骨组织的发育和骨化是高度管制的过程，涉及一系列的系统和局部因素、转录因子、细胞外基质蛋白等，包括增长激素、性激素、甲状腺激素、维生素、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors，IGF)，甲状旁腺激素相关蛋白(parathyroid hormone related protein，PTHrP)，成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGFs)、转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)，骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)家族等^[11-14]。

内源多肽一般来自细胞的分泌或蛋白的分解，相对分子质量小于10 000^[15]。最近，一些被认为生物废料的小分子量多肽可能反映了某种生物事件或可以提供大量用于诊断的生物标记^[16-18]，现在认为这些内源多肽在生物体的各个系统内扮演了重要的角色。生命活动中的细胞分化、神经递质调节、肿瘤病变、免疫调节等均与活性多肽密切相关。但很少有文献去研究软骨组织多肽。本次研究的目的有2个：第一，通过液相色谱和串联质谱(LC-MS/MS)连用的方法对提取的两组软骨组织多肽进行基本的生物信息学分析；第二，通过比较低年龄组与高年龄组儿童软骨组织差异多肽，寻求可能跟软骨组织生理功能有关的活性多肽。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计分子生物学实验。

1.2 时间和地点实验于2015年6月至2016年8月在南京医科大学公共测试平台完成。

1.3 材料软骨组织来源于南京医科大学附属南京儿童医院。尿素，硫脲和蛋白酶抑制剂购自Sigma公司。

1.4 实验方法

1.4.1 样本收集 6例低年龄组(小于3岁)和8例高年龄组(6-8岁)髂前上棘下端软骨样本收集于南京儿童医院，所有捐赠者的监护人同意这些捐赠用于科学研究。这项研究已经被南京医科大学伦理委员会审核通过。所有样本放入冻存管中通过液氮运送到-80 ℃冰箱中保存。

1.4.2 多肽提取取出软骨组织，切成小块状，用PBS冲洗直至无血色。液氮研磨成粉末状，在光镜下检查是否合格，不合格样品继续研磨直至完全成粉末状后移入预冷的EP管，称质量(冰上操作)。加入萃取液(7 mol/L尿素和 2 mol/L硫脲和蛋白酶抑制剂10 μL)。于冰上均质化1 min后超声碎裂处理。4 ℃，14 000×g 30 min离心。取上清用10 ku超滤管(Millipore，USA)超滤(4 ℃，4 000×g 15 min)。超滤后用C18固相萃取去盐。冻干样本-80 ℃保存。

1.4.3 定量分析为了定量分析两组不同年龄组软骨多肽的差异，首先应用同位素二甲基标记法进行串联质谱标记，根据标记试剂的说明进行操作。将0.8 mg的串联质谱标记试剂和41 μL的无水乙腈混合加入标记管中震荡离心后收集混合液。每个多肽样品中分别加入41 μL收集好的混合标记试剂并等待1 h。再加入5%的羟胺8 μL到软骨多肽的样品中去。最后将软骨多肽样品等质量混合后放入 -80 ℃冰箱中保存。

1.4.4 液相色谱-串联质谱分析多肽的分析采用纳升级液相系统nanoflow LC (Easy-nLC, ThermoFisher)分离，并联合在线连接双压线性离子阱高分辨率组合型质谱仪(LTQ-OrbitrapVelos mass spectrometer,ThermoFisher)系统分析。色谱分析进行反相分离时，使用缓冲液A(2%乙腈，0.5%乙酸)和缓冲液B(98%乙腈，0.5%乙酸)。洗脱后的肽在电压为1.8 kV电喷雾进入质谱仪，这样的配置用以收集高分辨率(质荷比400，分辨率> 60 000)采集范围(质荷比375-1 800)，并对电喷雾过程中产生的生成二甲基环硅氧烷离子作为内标校正(M/Z 445.12002)。从一级质谱扫描动态确定的最丰富的20个多肽进入串联二级，能量选择为 35%的相对碰撞诱导解离(CID)。使用最大期望算法对用TMT标记的软骨多肽定量分析，在特征性数据库中对每个软骨多肽的样品进行对比分析。使用高效的保留时间对比算法对来自不同年龄组的软骨多肽样品中相同的多肽特征进行比对分析。鉴定多肽的标准是在软骨多肽样品的质谱分析中出现2次峰值，才认为是有意义的。把P < 0.05和Log2倍数大于2时，获得的差异软骨多肽的表达认为是有明显统计学意义的。只有当多肽的峰在每个样本质谱峰图中至少出现2次，才被认为鉴定到。

1.4.5 生物信息学分析 ①每个差异多肽的等电点(pI)和分子质量采用pI/ Mw在线计算工具(http://web.expasy.org/ compute_pi/)获得；②进行基因本体(GO)分析http://geneontology.org，以确定潜在的生理功能。GO结果包括三大类：细胞成分、生物过程和分子功能。分析过程由P值和FDR共同决定是否具有统计学差异。

1.5 主要观察指标低年龄组与高年龄组差异多肽的定量结果。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件对实验数据进行分析。组间比较采用方差分析，当P < 0.05时，多肽的差异表达被认为是有显著的统计学意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

虽然人们通过蛋白质组学的方法来认识软骨组织的发育已经很多年了，但是对软骨组织发育的调控仍然不十分清楚。多肽组学是最近新出现的一种技术，它可以灵敏的探测只有几个氨基酸组成的小分子蛋白质。因此，这给了人们一种新的视角去研究软骨发育。

多肽类化合物广泛存在于自然界中，对其中具有一定生物学活性的多肽进行研究，一直是药物开发的一个主要方向。在实验中，为了让软骨细胞释放出更多的多肽，也为了使吸附在蛋白质的多肽分解开来，作者应用了裂解液(尿素和硫脲)，它可以有效提高多肽的提取率。需要注意的是去除软骨样品中大分子蛋白质和杂质可以有效的提高多肽样品的纯度，并且可以让质谱仪在最优的工作条件下完成多肽的测序。作者比较了有机溶剂沉淀法和分子截留法。有机溶剂沉淀法是利用化学方法去除大分子蛋白质，但费时耗力。而分子截留法则利用物理的原理来去除大分子蛋白质和杂质，达到了同样的效果并且简单方便。随着基因序列和表达数据的逐步完善，可以利用这些数据库来快速分析多肽。再根据尺寸排斥机制，利用精准分子量超滤离心截留法广泛收集多肽^[17^，^20]。10 ku的超滤器可以很好的去除干扰大分子蛋白质如胶原蛋白和蛋白聚糖，大多数多肽相对分子质量在3 000以下。实验所有鉴定的多肽的相对分子质量低于3 000，而大多数软骨多肽的相对分子质量在900-1 500之间(图1A)。等电点多位于碱性范围，酸性范围中5-6占据较大的比例(图1B)。根据分布的特点，差异多肽分布主要集中在pH 4，pH 6，pH 9和pH 11附近(图1C)。这些特点都为寻找软骨组织活性多肽提供信息。

多肽组学映射实验相关的挑战是处理和应用大量信息需要在特定生物背景下进行，可以通过识别多肽前体蛋白在生物体中的功能来推测多肽潜在的生理功能。作者预测了234个前体蛋白在软骨细胞中的分子功能(图2)，其中大多数起转运作用(169个)：转运活性47个，跨膜转运活性39个，主动跨膜转运有23个，次级主动跨膜转运有15个，特定底物转运有42个，钠葡萄糖转运体有3个。这些转运活性作用对细胞各系统之间传递信息是很重要的。结合RNA(44个)可能参与执行细胞的许多生理功能。此外还有15个前体蛋白参与细胞外基质结构成分，3个起α-淀粉酶活性和3个起结合珠蛋白作用。

确定了404个前体蛋白参与细胞的组成(图3)，他们几乎分布在每一个细胞室中。由于裂解液能有效的提取疏水性蛋白并使大蛋白分子变性，可以识别大量膜相关多肽。值得注意的是有45个前体蛋白位于膜区，这可能介导许多重要的细胞反应^[21]。此外，据图所示参与细胞外基质组成有89个，质膜区39个，细胞突出膜17个，胶原三聚体39个，胶原纤维6个，内质网内腔19个，基底膜10个，胶原网3个，内吞囊腔4个，原发性纤毛14个，核转录因子4个等。这些结果提供了不同亚细胞位置的多肽信息，也表明了这种方法可以广泛的用于多肽的提取。

在生物过程中，有186个前体蛋白被鉴定出来(图4)。最大的一类是参与转运过程(69个)。其中参与跨膜转运有52个，参与负离子跨膜转运有17个。第二类是代谢过程(59)：胶原分解代谢10个，胶原合成代谢13个。多细胞生物大分子合成代谢13个，多细胞生物分解代谢10个，多细胞生物合成代谢13个。此外，还有14个前体蛋白参与黏附作用，22个参与细胞外基质组成，22个参与细胞外结构组成等。这些都表明了多肽在软骨细胞各个系统中扮演了重要的角色。

为了研究不同年龄组软骨多肽组学的变化，应用同位素二甲基标记法分析低年龄组和高年龄组软骨多肽组成的差异。比较出了588个差异多肽。当P值< 0.05，log2倍数大于4时，认为这种多肽高表达，当P值< 0.05，log2倍数小于-4时，认为这种多肽低表达。如表1所示，有22多肽有统计学意义，其中6个多肽在低年龄组中高表达，16个多肽在高年龄组中高表达。通过文献发现FAT4-Dchs1信号通路参与调节许多老鼠和人的骨骼的生长发育。例如FAT4-Dchs1可以调节早期软骨前间质细胞的细胞极性，影响骨骼形态的走向，并且也有文献记载FAT4-Dchs1信号通路调节椎体细胞的增殖^[22-23]。因此可以假设在低年龄组高表达，来自FAT4前体蛋白的ELTEIGSKVTQVFATD PDEGSNGQ多肽参与了FAT4-Dchs1信号通路的调节，与软骨的发育有密切相关。

在动物的研究中已经发现一些活性多肽在软骨的作用。例如在骨关节炎患者的关节软骨和滑液中^[24-26]，血管活性肠肽(VIP)表达下调，低表达的血管活性肠肽刺激炎症因子的释放，从而改变软骨基质的分解或合成的平衡，导致软骨损伤和骨关节炎的发生。因此可以应用血管活性肠肽来预防软骨的损伤。但也有文献表明高表达的血管活性肠肽通过刺激腺苷酸环化酶来诱导滑膜充血并使传导疼痛更加敏感^[27]。

C-利钠肽(CNP)在调节软骨生长的过程中也扮演的重要角色。当抑制C-利钠肽信号表达时，小鼠软骨细胞的增殖同时被抑制，当过量表达C-利钠肽信号时，小鼠的骨骼也过度生长^[28-29]。Krejci等^[30]的研究也发现C-利钠肽可以治疗成纤维因子受体3相关软骨发育不良的能力。另外软骨细胞中核内甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)可以直接作用于核仁来调节软骨的增殖，分化和凋亡^[31-36]。

总之，定量质谱分析使分子生物研究达到了一个新的水平，也为研究其他组学提供了新的途径。随着技术的成熟，可以从基础的研究转向实用性更大的研究如诊断疾病的标记物或多肽药物。在大自然环境中，各个生物体产生了大量的具有功能性的活性多肽，进一步研究其功能是未来需要去做的事情。

研究通过差异多肽的相对分子质量、等电点和基因本体分析，初步了解软骨组织多肽的分子学特征，这给了研究者新的视角来研究软骨组织的生理功能。在未来的研究中，可以依据多肽蛋白前体的功能，也可以根据新发现的多肽与以往报道功能多肽的序列同源性，或者在线预测多肽可能结合的蛋白质和核酸分子，来筛选出可能跟软骨发育有关的活性多肽。当然，对于筛选出来的多肽也要看多肽是否在前体蛋白的二级结构或功能域中。这些方法都可以帮助准确的选择可能跟软骨发育相关的多肽。

可以设想一下：进一步深入研究筛选的小分子多肽，运用实验手段合成多肽并深入研究其在软骨细胞中增殖、成熟、分化等生理作用的可能性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程