骨性关节炎患者软骨岩藻糖基化表达的升高

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0803

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (20): 3136-3143.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0803

• 软骨组织构建 cartilage tissue construction • 上一篇下一篇

骨性关节炎患者软骨岩藻糖基化表达的升高

赵炼1，刘韶1，李毅2，于汉杰3，赵宏谋2，梁晓军2，杨杰2，姬维娜2

1陕西中医药大学，陕西省咸阳市 712046；2西安交通大学医学院附属红会医院足踝外科，陕西省西安市 710000；3西北大学生命科学学院功能糖组学实验室，陕西省西安市 710000

收稿日期:2017-10-30 出版日期:2018-07-18 发布日期:2018-07-18
通讯作者: 通讯作者：李毅，博士，主任医师，西安交通大学医学院附属红会医院足踝外科，陕西省西安市 710000
作者简介:赵炼，男，1983年生，湖南省长沙市人，汉族，2015级陕西中医药大学在读硕士，医师，主要从事足踝外科及骨性关节炎的临床及研究。
基金资助:
陕西省自然科学基础研究计划(2013JM4059)；陕西省科学技术研究发展计划项目(2016SF-333)；西安市红会医院博士基金(YJ2012008)

Alterations of fucosylation in human osteoarthritis cartilage

Zhao Lian1, Liu Shao1, Li Yi2, Yu Han-jie3, Zhao Hong-mou2, Liang Xiao-jun2, Yang Jie2, Ji Wei-na2

1Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, Shaanxi Province, China; 2Department of Foot and Ankle Surgery, Xi’an Honghui Hospital, Xi’an Jiaotong University College of Medicine, Xi’an 710000, Shaanxi Province, China; 3Laboratory of Functional Glycomics, College of Life Sciences, Northwest University, Xi’an 710000, Shaanxi Province, China

Received:2017-10-30 Online:2018-07-18 Published:2018-07-18
Contact: Corresponding author: Li Yi, M.D., Chief physician, Department of Foot and Ankle Surgery, Xi’an Honghui Hospital, Xi’an Jiaotong University College of Medicine, Xi’an 710000, Shaanxi Province, China
About author:Zhao Lian, Studying for master’s degree, Physician, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, Shaanxi Province, China
Supported by:
the Natural Science Research Program of Shaanxi Province, No. 2013JM4059; the Scientific Research and Development Project of Shaanxi Province, No. 2016SF-333; the Doctoral Foundation of Xi’an Honghui Hospital, No. YJ 2012008

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
糖基化：糖基化是蛋白质的一种翻译后修饰，主要发生在细胞的内质网和高尔基体中。蛋白质的糖基化修饰主要有三个类型：N-连接，O-连接以及GPI锚定。其中N-连接和O-连接糖基化在生命活动中扮演重要角色。现有的研究表明糖基化修饰的改变不仅伴随着某些疾病的发生发展，而且对疾病的发展进程具有重要作用。
岩藻糖基化：岩藻糖基化是糖基化的类型之一，是指在岩藻糖基转移酶的作用下将岩藻糖转移到糖蛋白的N或O-聚糖中，形成岩藻糖基化聚糖。已有研究表明岩藻糖基化水平升高是炎性巨噬细胞的重要特征，而抑制岩藻糖基化能够减轻炎症。

摘要
背景：膝关节骨性关节炎关节软骨的退行性病变和炎症是其主要特征，而有关其软骨异常糖基化修饰的研究尚不完全清楚。
目的：分析与骨性关节炎相关的异常糖基化修饰。
方法：利用凝集素芯片技术分析8例膝关节骨性关节炎患者和10例健康志愿者关节软骨组织以及体外培养的膝关节骨性关节炎软骨细胞和正常软骨细胞糖蛋白糖链谱，并利用RT-PCR以及Western blot分析相关糖基转移酶表达水平变化。
结果与结论：①结果显示4种凝集素(PSA，LTL，WGA和NPA)识别的Fucα-1，3/6GlcNAc岩藻糖，Multivalent Sia结构以及Manα1-6Man结构在膝关节骨性关节炎软骨组织和细胞中的丰度明显较高，而凝集素Con A和PHA-E+L识别的高甘露糖型N-聚糖以及多天线结构N-聚糖在正常软骨组织及细胞中的丰度明显较高；②膝关节骨性关节炎软骨组织基因表达数据，RT-PCR以及Western blot结果显示参与α-1，3岩藻糖基化的糖基转移酶FUT9在膝关节骨性关节炎患者的软骨组织中表达升高；③推测在膝关节骨性关节炎发病过程中引起FUT9表达升高进而促进软骨细胞的α-1，3岩藻糖基化水平升高，这种变化可能与骨性关节炎的炎症微环境相关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-9401-7166(李毅)

关键词: 糖蛋白糖链, 岩藻糖基化, 骨性关节炎, 退行性病变, 炎症, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: Knee osteoarthritis is characterized as cartilage degeneration and inflammation. However, the mechanism related to abnormal glycosylation modification of the cartilage remains unclear.
OBJECTIVE: To study the abnormal glycosylation modification associated with osteoarthritis.
METHODS: The lectin microarray was employed to investigate the glycan profile of the articular cartilage from 8 patients with knee osteoarthritis and 10 healthy volunteers. The alterations of glycopatterns of osteoarthritic and normal chondrocytes in vitro were evaluated by lectin microarray. In addition, RT-PCR and western blotting were used to analyze the expression levels of related glycosylation enzymes.
RESULTS AND CONCLUSION: The glycopatterns of Fucα-1, 3/6GlcNAc, multivalent Sia and Manα1-6Man which identified by lectins of PSA, LTL, WGA and NPA increased in the osteoarthritic cartilage tissues and chondrocytes compared with the controls. In contrast, high mannose type of N-glycan and bi/tri/tetr-antennary N-glycans which recognized by Con A and PHA-E+L exhibited a decrease in osteoarthritic cartilage tissues and chondrocytes. According to the results of RT-PCR and western blot, glycosyltransferase FUT9 up-regulated in osteoarthritic cartilage tissues and chondrocytes, which may contribute to the alteration of α-1,3-fucosylation in osteoarthritic cartilage. We concluded that the high level of α-1,3-fucosylation may be related with inflammatory microenvironment in osteoarthritic cartilage.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Osteoarthritis, Glycosylation, Inflammation, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

赵炼，刘韶，李毅，于汉杰，赵宏谋，梁晓军，杨杰，姬维娜. 骨性关节炎患者软骨岩藻糖基化表达的升高[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(20): 3136-3143.

Zhao Lian1, Liu Shao1, Li Yi2, Yu Han-jie3, Zhao Hong-mou2, Liang Xiao-jun2, Yang Jie2, Ji Wei-na2. Alterations of fucosylation in human osteoarthritis cartilage[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(20): 3136-3143.

图/表（结果） 4

2.1 参与者数量分析纳入膝骨关节炎患者8例，对照患者10例，全部进入结果分析(见图1)。

2.2 两组基线资料比较见表2。

2.3 凝集素芯片分析骨性关节炎相关异常糖基化研究中，利用凝集素芯片技术比较8例膝关节骨性关节炎患者以及10例正常关节软骨糖蛋白糖链谱，结果显示：①凝集素PSA识别的Fucα-1,6GlcNAc结构，LTL识别的Fucα1-3Galβ1-4GlcNAc结构，BPL、PNA、MAL-I以及MPL识别的Galβ1-3GalNAc结构，SJA和DBA识别的Terminal in GalNAc，WGA识别的Multivalent Sia结构以及NPA识别的Manα1-6Man结构在膝骨关节炎组中的丰度明显高于健康对照组(图2A)；②凝集素STL识别的trimers and tetramers of GlcNAc, core (GlcNAc) of N-glycan结构，ACA识别的T antigen结构，RCA120识别的β-Gal结构，Con A识别的high-Mannose结构以及PHA-E+L识别的Bisecting GlcNAc, bi-antennary N-glycans, tri-and tetra- antennary complex-type N-glycan糖链结构在健康对照组中的丰度明显高于膝骨关节炎组(图2B)；③HCE聚类分析结果显示，膝骨关节炎组与健康对照组之间糖蛋白糖链的种类和丰度存在差异，Fucα-1,3/6GlcNAc岩藻糖基化以及较短的O-聚糖Galβ1-3GalNAc糖链结构在膝骨关节炎组中的丰度较高，而在健康对照组中，STL，Con A以及PHA-E+L识别的N-聚糖结构明显高于膝骨关节炎组(图2C)。软骨组织之间差异凝集素识别的糖链结构以及差异倍数见表3。

另外，分别分离膝关节骨性关节炎患者软骨以及正常关节软骨进行体外培养，待细胞融合度达到80%左右时提取总蛋白，利用凝集素芯片比较体外培养的关节软骨细胞糖蛋白糖链谱的差异。结果显示，①凝集素PSA识别的Fucα-1,6GlcNAc结构，LTL识别的Fucα1-3Galβ1- 4GlcNAc结构，RCA120识别的β-Gal结构，NPA识别的Manα1-6Man结构，BS-I识别的α-Gal结构以及WGA识别的Multivalent Sia结构在骨性关节炎软骨细胞中的丰度明显高于正常软骨细胞(图3A)；②在正常软骨细胞中，凝集素PWM识别的(GlcNAc)n结构，EEL识别的Galα1-3 (Fucα1-2)Gal结构，Con A识别的high-Mannose结构，PHA-E+L识别的Bisecting GlcNAc, bi-antennary N-glycans, tri-and tetra-antennary complex-type N- glycan结构以及UEA-I识别的Fucα1-2Galβ1-4Glc(NAc)这些糖链结构的丰度明显高于骨性关节炎软骨细胞(图3B)；③HCE聚类分析结果显示骨性关节炎软骨细胞与正常软骨细胞在糖链分布上也存在差异(图3C)。软骨细胞之间差异凝集素识别的糖链结构以及差异倍数见表4。

结合膝关节骨性关节炎软骨组织以及软骨细胞糖蛋白糖链谱结果，发现4种凝集素(PSA，LTL，WGA和NPA)识别的Fucα-1，3/6GlcNAc岩藻糖，Multivalent Sia结构以及Manα1-6Man结构在膝关节骨性关节炎软骨组织和细胞中的丰度明显较高，而凝集素Con A和PHA-E+L识别的高甘露糖型N-聚糖以及多天线结构N-聚糖在正常软骨组织及细胞中的丰度明显较高(图4A，B)。这一结果也提示骨性关节炎软骨中Fucα-1，3/6GlcNAc岩藻糖岩藻糖基化水平以及多家唾液酸结构增加，而经典结构的N-聚糖特别是高甘露糖型N-聚糖以及多天线结构N-聚糖丰度降低。

2.4 膝关节骨性关节炎软骨组织基因表达分析利用NCBI的GEO数据库中的相关数据分析在膝关节骨性关节

炎中差异表达基因。下载膝关节骨性关节炎软骨组织与正

常对照软骨组织基因表达数据GSE51588，利用基因芯片分析软件EXPANDER6.0分析筛选在膝关节骨性关节炎中差异表达基因。分析结果显示，膝关节骨性关节炎软骨与正常对照之间基因表达存在明显差异。以foldchange >1.5或< 0.6且P < 0.05为筛选条件，结果表明，1 614个基因在膝骨关节炎组中表达升高，而2 211个基因表达降低(图5A)。结合散点图及HCE聚类分析发现骨性关节炎软骨基因表达较正常对照有降低的趋势(图5B, C)。

2.5 膝关节骨性关节炎相关异常糖基化合成通路分析从上述异常表达基因中筛选参与糖基化修饰的相关基因，发现负责α-1，3岩藻糖基化的糖基转移酶FUT9在膝关节

骨性关节炎患者的软骨组织中表达升高(图6A)。随后分别从收集的15例膝关节骨性关节炎患者及正常健康志愿者软骨组织以及体外培养的膝关节骨性关节炎软骨细胞及正常

软骨细胞提取总RNA，经反转录后使用Real Time-PCR比

较FUT9基因在膝骨关节炎组及正常对照之间的表达差异。RT-PCR结果显示，糖基转移酶FTU9在膝骨性关节炎软骨组织及细胞中的转录水平明显高于正常对照(图6B，C)。

随后，利用Western blot进一步分析FUT9在膝骨关节炎组与正常对照之间的表达差异，结果显示(图6D，E)，糖基转移酶FUT9在膝关节骨性关节炎软骨组织以及细胞中的表达明显高于正常对照，这与基因芯片以及RT-PCR结果一致。结合凝集素芯片筛选的与膝关节骨性关节炎相关的异常表达糖蛋白糖链结构，作者推断α-1，3岩藻糖基化的糖基转移酶FUT9在膝关节骨性关节炎患者的软骨组织及体外培养的膝关节骨性关节炎软骨细胞中的表达升高，进而引起α-1，3岩藻糖基化合成增加导致在膝骨性关节炎软骨组织及细胞中含α-1，3岩藻糖的糖蛋白糖链丰度明显高于正常对照。在膝关节骨性关节炎软骨中α-1，3岩藻糖

基化水平升高可能与慢性炎症反应相关，作者也将在后续研究中进一步分析引起α-1，3岩藻糖基化水平升高的分子机制。

参考文献

[1] 孙永生,娄思权.骨性关节炎发病分子机制研进展[J].中国骨与关节损伤杂志, 2005, 20(8): 571-573.

[2] Goldring MB, Otero M.Inflammation in osteoarthritis. Curr Opin Rheumatol. 2011;23(5):471-478.

[3] Wong C H. Protein glycosylation: new challenges and opportunities. J Org Chem.2005;70(11): 4219-4225

[4] Shental-Bechor D,Levy Y.Folding of glycoproteins: toward understanding the biophysics of the glycosylation code. Curr Opin Struct Biol.2009;19:524-533

[5] Mitra N, Sinha S, Ramya TN, et al. N-linked oligosaccharides as outfitters for glycoprotein folding, form and function. Trends Biochem Sci.2006;31:156-163.

[6] Chou CT.Binding of rheumatoid and lupus synovial ?uids and sera-derived human IgG rheumatoid factor to degalactosylated IgG. Arch Med Res.2002;33:541-544.

[7] Watson M, Rudd P M, Bland M, et al. Sugar printing rheumatic diseases: a potential method for disease differentiation using immunoglobulin G oligosaccharides. Arthritis Rheum.1999;42: 1682-1690.

[8] Parekh RB, Dwek RA, Sutton BJ, et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature.1985;316: 452-457.

[9] Fukuda I,Ishihara T,Ohmachi S,et al.Potential plasma biomarkers for progression of knee osteoarthritis using glycoproteomic analysis coupled with a 2D-LC-MALDI system. PROTEOME SCI.2012;10(1):10-36

[10] Liu W, Cui Z, Wang Y, et al. Elevated expression of β1,4-galactosyltransferase-I in cartilage and synovial tissue of patients with osteoarthritis. Inflammation. 2012; 35(2): 647-655.

[11] Tardio L, Andrés-Bergós J, Zachara NE, et al.O-linked N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) protein modification is increased in the cartilage of patients with knee osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2014;22(2):259-263.

[12] Otero M, Favero M, Dragomir C, et al. Human chondrocyte cultures as models of cartilage-specific gene regulation. Methods Mol Biol. 2012; 806:301-36.

[13] 简强,于汉杰,陈超,等. 凝集素芯片技术检测糖蛋白方法的建立及初步应用[J]. 生物化学与生物物理进展,2009,36(2):254-259

[14] Yu H, Zhu M, Qin Y, et al. Analysis of glycan-related genes expression and glycan profiles in mice with liver fibrosis. J Proteome Res.2012;11(11): 5277-85.

[15] Zhong Y, Qin Y, Yu H, et al. Avian influenza virus infection risk in humans with chronic diseases.Sci Rep.2015;5:8971.

[16] Chou CH, Wu CC,Song IW,et al. Genome-wide expression profiles of subchondral bone in osteoarthritis. Arthritis Res Ther.2013;15(6):R190.

[17] Pinho SS, Reis CA. Glycosylation in cancer: mechanisms and clinical implications. Nat Rev Cancer. 2015; 15(9): 540-555.

[18] Hakomori S.Glycosylation defining cancer malignancy: new wine in an old bottle. Proc Natl Acad Sci U S A.2002; 99(16): 10231-10233.

[19] Angata T,Fujinawa R,Kurimoto A,et al. Integrated approach toward the discovery of glyco-biomarkers of inflammation-related diseases. Ann N Y Acad Sci.2012; 1253: 159-169.

[20] 阚鹏,刘璠,徐华,等.α1,3-岩藻糖基转移酶-Ⅴ在类风湿性关节炎滑膜组织中的表达及意义[J].江苏医药, 2015; 41(16): 1923-1925.

[21] Li J,Hsu HC,Ding Y,et al.Inhibition of fucosylation reshapes inflammatory macrophages and suppresses type II collagen-induced arthritis. Arthritis Rheumatol.2014; 66(9): 2368-2379.

[22] Jin C, Ekwall AK, Bylund J, et al. Human synovial lubricin expresses sialyl Lewis x determinant and has L-selectin ligand activity. J Biol Chem. 2012; 287(43): 35922-35933.

[23] Takeshita M, Kuno A, Suzuki K, et al. Alteration of matrix metalloproteinase-3 O-glycan structure as a biomarker for disease activity of rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther. 2016; 18(1): 112.

[24] Büll C, Stoel MA, den Brok MH, et al. Sialic acids sweeten a tumor's life. Cancer Res. 2014;74(12):3199-204.

[25] Vajaria BN, Patel KR, Begum R, et al. Sialylation: an Avenue to Target Cancer Cells. Pathol Oncol Res. 2016; 22(3): 443-447.

[26] de Visser KE, Coussens LM. The inflammatory tumor microenvironment and its impact on cancer development. Contrib Microbiol. 2006; 13: 118-137.

[27] Bassagañas S,Allende H,Cobler L,et al.Inflammatory cytokines regulate the expression of glycosyltransferases involved in the biosynthesis of tumor-associated sialylated glycans in pancreatic cancer cell lines. Cytokine. 2015;75(1):197-206.

[28] Briggs MT, Kuliwaba JS, Muratovic D, et al. MALDI mass spectrometry imaging of N-glycans on tibial cartilage and subchondral bone proteins in knee osteoarthritis. Proteomics. 2016;16(11-12):1736-1741.

[29] Svala E, Jin C, Rüetschi U, et al. Characterisation of lubricin in synovial fluid from horses with osteoarthritis. Equine Vet J. 2017; 49(1):116-123.

[30] Carpintero-Fernandez P, Gago-Fuentes R, Varela-Eirin M, et al. Targeting sialic acid modified receptors as a potential therapy for osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage.2016;24: S334.

[31] Toegel S, Weinmann D, André S, et al. Galectin-1 Couples Glycobiology to Inflammation in Osteoarthritis through the Activation of an NF-κB-Regulated Gene Network.J Immunol.2016; 196(4):1910-1921.

引言

骨性关节炎是一种常见的关节软骨退行性病变，主要特点是关节软骨退行性病变、细胞外基质的减少、软骨下骨的改变和滑膜的炎症反应等。骨性关节炎的发病机制目前还不清楚，性别、肥胖以及糖尿病等因素被认为可能与骨性关节炎的发生相关。已有研究报道金属基质蛋白酶(MMP1，3，9，13等)以及细胞因子(如肿瘤坏死因子，白细胞介素1和白细胞介素10等)在骨性关节炎软骨组织的表达出现异常，并在骨性关节炎的发病过程中扮演重要角色^[1]。越来越多的证据表明炎症与骨性关节炎的发生具有密切联系，一些促炎症因子能激活NF-κB和MAPK等信号通路，进而促进骨性关节炎的发生^[2]。越来越多的证据表明，骨性关节炎是一种多因素诱发疾病，而目前由于对其发病的机制尚不完全清楚，因此治疗也多以缓解症状为主，少数情况下进行手术治疗，总体而言尚缺乏有效的治疗手段。

糖基化修饰是蛋白质一种重要的翻译后修饰，对蛋白折叠及功能具有重要作用。细胞表面的糖蛋白糖链在介导细胞-细胞相互作用及细胞-胞外基质相互作用方面发挥重要作用^[3-5]。现有的研究表明，糖基化修饰的改变与疾病的发生密切相关，对风湿性关节炎患者血清IgG糖基化的研究结果显示，风湿性关节炎患者血清IgG的N-聚糖结构发生改变，并促进了疾病的发展^[6-8]。

Fukuda及其同事^[9]对进展与非进展的骨性关节炎患者血浆N-糖蛋白质组分析，研究发现，丛生蛋白、血色素结合蛋白、α-1酸性糖蛋白2及巨噬细胞刺激蛋白这4种蛋白转录和表达水平在进展性骨性关节炎中均发生变化，而这4种糖蛋白可作为膝关节骨性关节炎潜在的标志物。研究显示，糖基转移酶β 1，4-GalT-I及E-选凝素在骨性关节炎患者软骨及滑膜组织中的表达明显高于正常对照，这也提示，异常表达的糖基转移酶β1，4-GalT-I在骨性关节炎软骨及滑膜组织的炎症进程当中发挥重要作用^[10]。对骨性关节炎软骨细胞的糖蛋白糖链谱的研究显示，O-GlcNAc糖基化在骨性关节炎软骨中的积累增加，骨性关节炎软骨中蛋白质O-GlcNAc糖基化水平升高可能与软骨退化相关^[11]。

上述的研究显示，软骨细胞表面糖蛋白糖链结构的改变及糖相关基因表达水平的变化与骨性关节炎发展密切相关。因此，实验以骨性关节炎软骨组织及细胞为研究对象，分析与骨性关节炎相关的异常糖基化修饰，为骨性关节炎发病的分子机制研究提供帮助。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1 对象和方法 Subjects and methods

1.1 设计分组对照观察。

1.2 时间及地点于2016年1月至2017年1月在西安市红会医院及西北大学生命科学学院功能糖组学实验室完成。

1.3 对象收集西安市红字会医院足踝外科及关节外科2016年3至10月就诊的经病史、体查、影像学检查符合膝骨性关节炎诊断标准的8例中国北方汉族患者(膝骨关节炎组)，其中男6例，女2例，平均年龄57.7(41-72)岁, 平均体质量指数23.9(16.8-35.6) kg/m²。

诊断标准：诊断均由参与研究的医师按骨性关节炎标准确诊。

纳入标准：①符合膝骨性关节炎诊断标准；②膝关节X射线片的Kellgren/Lawrence评分≥2分；③受试者对测试均知情同意。

排除标准：类风湿性关节炎、感染性关节炎、创伤性关节炎及其他免疫系统疾病的患者。

对照组为2例外伤截肢患者，8例胫骨平台及股骨远端粉碎骨折患者，无法复位固定的负重区游离软骨片，筛选条件为年龄与膝骨关节炎组相近，从未出现过膝关节疼痛症状，其中男6例，女4例，平均年龄58.1(41-70)岁，平均体质量指数24.5(16.5-30.8) kg/m²。

研究方法经西安市红会医院伦理委员会审定，并且每个研究对象均签署知情同意书。

1.4 材料凝集素购自美国Vectorlabs公司以及Sigma-Aldrich公司，蛋白提取试剂盒购自美国Thermo Fisher公司，实时荧光定量PCR仪购自BioRad公司，Cy3-monofunctional dye 购自美国 GE healthcare公司，SYBR Green实时荧光定量试剂盒购自大连宝生物公司，芯片点样仪Smart Arrayer-48购自北京博奥生物生物有限

公司，细胞培养液RPMI1640购自美国Thermo Fisher公司，激光共聚焦扫描仪购自美国AXON公司，时荧光定量试剂盒(宝生物公司)、Nano photometer购自德国IMPLEN公司，环氧化芯片片基实验室自制。

1.5 方法

1.5.1 原代软骨细胞分离培养参照Miguel等^[12]报道的方法分离培养软骨细胞。手术分离膝关节骨性关节炎患者病灶部位以及正常关节软骨组织，用无菌PBS冲洗软骨组织洗去残留的血液及杂质，随后将软骨切成1 mm×1 mm大小，加入0.25%的胰蛋白酶37 ℃振荡孵育1 h消化细胞。1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗去胰蛋白酶，随后加入Ⅱ型胶原酶37 ℃消化8 h。1 000 r/min离心5 min，弃上清。加胎牛血清终止消化，加1640培养液5-10 mL混匀；用100目金属网过滤，滤液1 000 r/min离心10 min，弃去上清，再加含体积分数10%胎牛血清的1640培养液进行孵育培养。

1.5.2 凝集素芯片分析软骨组织及细胞糖蛋白糖链谱
(1)凝集素芯片制备：使用先前建立的凝集素芯片方法制备凝集素芯片^[13-15]。简要制备方法：首先将37种凝集素溶于指定的缓冲液中配置成终浓度为1 g/L溶液，并加入相应的单糖提高凝集素结合特异性。随后使用芯片点样仪Smart Arrayer-48将配制的凝集素溶液点至环氧化片基上，湿盒避光固定过夜，37 ℃真空干燥，4 ℃避光保存。

(2)蛋白提取及靶标制备：①组织蛋白提取：取软骨组织剪成1 mm×1 mm大小，使用灭菌的PBS冲洗软骨组织，弃PBS，加入1 mL预冷的蛋白提取试剂，匀浆2 min，冰上孵育1 h。10 000×g离心10 min，取上清，加入10 μL蛋白酶抑制剂，BCA蛋白定量，-80 ℃分装保存；②细胞蛋白提取：弃培养基，使用5 mL灭菌的PBS冲洗2次，洗去残留的培养基，向培养瓶中加入1 mL预冷的蛋白提取试剂，冰上孵育1 h。使用移液器吹打至溶液澄清。10 000×g离心10 min，取上清，加入10 μL蛋白酶抑制剂，BCA蛋白定量，-80 ℃分装保存。

(3)凝集素芯片孵育：取100 μg组织和细胞蛋白，加等体积0.1 mol/L NaHCO₃(pH 9.3)混匀，加入5 μL Cy3荧光，涡旋离心后避光孵育3 h。使用G25分离柱分离荧光标记的蛋白。Nano photometer测量标记后蛋白浓度。用含1% BSA的PBST缓冲液封闭凝集素芯片1 h，PBST清洗2次，PBS清洗2次后甩干。取5 μg荧光标记蛋白与凝集素芯片共孵育3 h。孵育完成后PBST清洗2次，PBS清洗2次后甩干。

(4)凝集素芯片扫描和分析：用激光共聚焦芯片扫描仪GenePix4000B扫描凝集素芯片，GenePix 6.0软件读取凝集素芯片上的结合信号强度。为消除非特异性吸附的影响，每个点的荧光信号读数减去背景荧光读数之后所得的值纳入后续统计学分析。将归一化后数据导入EXPANDER软件进行聚类分析。使用Global归一化对芯片数据进行归一化处理，消除不同芯片之间荧光偏差。比较各组数据，当foldchange>1.5或< 0.66倍，且P < 0.05认为存在显著差异。

1.5.3 骨性关节炎软骨组织糖基因表达在GEO数据库中查询骨性关节炎软骨基因表达数据(GSE51588)^[16]。分析10例膝关节骨性关节炎患者膝关节外侧平台软骨组织(knee lateral plateau)及5例健康志愿者同部位软骨组织。数据经归一化处理后以差异倍数在1.5倍以上(即比值≥ 1.5，或≤0.66倍)并且P < 0.05为标准，筛选差异表达基因。

1.5.4 RT-PCR验证使用Trizol试剂分别提取膝关节骨性关节炎及健康志愿者膝关节软骨以及培养的软骨细胞的总RNA。总RNA经琼脂糖凝胶电泳确认无降解后使用PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa)合成cDNA，随后使用SYBR^® Premix Ex Taq^TM Ⅱ试剂盒进行Real-time PCR实验，以GAPDH为内参基因，2^-^ΔΔ^Ct验证FUT9基因在膝关节骨性关节炎患者与正常关节软骨中的表达差异。引物序列见表1。

表1 Real-time PCR引物序列

Table 1 Primer sequences for real-time PCR

基因名	引物序列(5'→3')	引物长度	扩增产物大小(bp)
FUT9	F: CCA TTT GGG CAG ACC TTT GAC	21	107
	R:AGA ACT GCA TGG GAT TTG TTG T	22
GAPDH	F:CTG GGC TAC ACT GAG CAC C	19	101
	R:AAG TGG TCG TTG AGG GCA ATG	21

1.5.5 Western blot验证分别提取软骨组织及细胞总蛋白，BCA定量后取40 μg使用10% SDS-PAGE分离。电泳结束后使用半干转膜仪转膜1 h，将胶内蛋白转入0.45 μm PVDF膜上。使用含3%BSA的TBST缓冲液封闭PVDF膜1 h，封闭结束后使用一抗孵育PVDF膜4 ℃避光过夜(FUT9多克隆抗体ab176794购自Abcam公司，β-actin单克隆抗体AA132购自碧云天公司)。孵育完成后TBST缓冲液清洗3次，每次10 min，随后使用HRP标记二抗孵育PVDF膜1 h，孵育完成后重复上步清洗步骤，蛋白成像仪成像分析。

1.6 主要观察指标关节软骨组织和软骨细胞糖蛋白糖链谱，及相关糖基转移酶表达水平。

1.7 统计学分析由第四作者应用Graphpad prism 6软件采用单因素方差分析。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰，在机体的生命活动中扮演重要角色。现有的研究表明，在疾病的发生发展过程伴随着异常糖基化的发生，如某些糖链结构丰度发生改变和出现一些新的糖链结构^[17]。与此同时，已有研究证明异常糖基化对某些疾病(如肿瘤)的发展具有促进作用^[18]。因此，研究与疾病相关的异常糖基化对疾病的诊断及揭示疾病产生的分子机制具有重要作用，这也是近些年来糖生物学研究的热点之一。

在本实验中，利用凝集素芯片技术比较膝关节骨性关节炎软骨组织及细胞与正常软骨组织及细胞的糖蛋白糖链谱。结果显示，有10种凝集素(如PSA，BPL和PNA等)在膝关节骨性关节炎软骨组织中的结合信号明显高于正常软骨组织。结合凝集素识别的糖蛋白糖链结构，作者发现α-1，3/6岩藻糖，较短的O-聚糖结构(T抗原，Tn 抗原)以及多价唾液酸在膝关节骨性关节炎软骨组织中的表达较高。与之相反的是，凝集素STL，Con A和PHA-E+L识别的高甘露糖型N-聚糖，平分型以及多天线结构N-聚糖等在膝关节骨性关节炎软骨组织中的表达较低。

为进一步研究膝关节骨性关节炎相关异常糖基化，手术分离膝关节骨性关节炎及正常软骨，分离软骨细胞体外培养，随后利用凝集素芯片分析体外培养的膝关节骨性关节炎及正常软骨细胞糖蛋白糖链谱，结果显示，6种凝集素(如PSA，RCA20和LTL等)识别的糖链结构在膝关节骨性关节炎软骨细胞中的表达高于正常软骨细胞，而5种凝集素(如EEL，Con A和PHA-E+L)识别的糖链结构在膝关节骨性关节炎软骨细胞中的表达较低。

结合膝关节骨性关节炎软骨组织及细胞的糖蛋白糖链谱，结果显示，PSA，WGA，LTL和NPA识别的糖链结构在膝关节骨性关节炎软骨组织及细胞的表达均高于正常对照，这一结果表明，在膝关节骨性关节炎发展过程中，软骨细胞糖基化发生了改变表现为α-1，3/6岩藻糖基化，多价唾液酸升高以及N-聚糖降低。

结合骨性关节炎软骨组织及细胞的糖蛋白糖链谱，结果显示4种凝集素PSA，LTL，WGA和NPA识别的糖链结构表达升高，而Con A和PHA-E+L识别的糖链表达降低。值得注意的是PSA识别的Fucα-1,6GlcNAc结构在骨性关节炎软骨组织和细胞的表达均显著高于正常对照(foldchange > 4.05，P < 0.001)，而且凝集素LTL识别Fucα-1，3GlcNAc糖链也在骨性关节炎软骨和细胞中的表达较高，这也表明α-1，3/6岩藻糖基化水平升高是骨性关节炎的重要特征。

研究还存在一定的局限性：首先，纳入研究的临床样本例数较少；其次，岩藻糖基化水平升高对骨性关节炎的作用机制尚未完全清楚。因此，作者也将针对这两点展开后续研究。收集更多临床样本，进一步分析岩藻糖基化水平升高与骨性关节炎的相关性。针对表达上调的Fut-9进行RNA干扰，以及加入岩藻糖配体等方法分析岩藻糖基化水平改变对骨性关节炎软骨以及炎症微环境的影响。

慢性的炎症反应在骨性关节炎的发病过程中具有重要作用，已有研究表明，岩藻糖基化水平与炎症相关^[19]。阚鹏等^[20]的研究显示，类风湿性关节炎患者膝关节滑膜组织FucT-V的表达高于对照组，高表达的FucT-V可能参与炎症反应过程。Li等^[21]对类风湿性关节炎及骨性关节炎患者滑膜组织的分析结果显示，糖链末端的岩藻糖基化与滑膜组织的炎性巨噬细胞相关。Sialyl Lewisx抗原是一个由唾液酸，半乳糖，N-乙酰葡糖胺以及岩藻糖组成的四糖结构。

蛋白多糖4(proteoglycan 4)是关节液中的一种高丰度糖蛋白，Jin等^[22]的研究显示，在类风湿性关节炎患者关节液中蛋白多糖4糖基化修饰发生改变，Sialyl Lewisx抗原表达增加，导致与其配体L-选凝素的相互作用增加最终促进多核粒细胞介导的炎症反应(PMN-mediated inflammation)。

2-脱氧D-半乳糖(2-deoxy-d-galactose，2-d-gal)是岩藻糖基化的合成抑制剂，在小鼠关节炎模型中加入2-D-gal能够抑制M1巨噬细胞的抗原递呈功能，进而缓解关节炎的炎症反应^[21]。Takeshita等^[23]的研究表明类风湿性关节炎患者血清中金属基质蛋白酶3的O-聚糖唾液酸化修饰可以用以评估类风湿性关节炎发展进程。

唾液酸化修饰是糖基化修饰的一种，发生在糖链末端，现有的研究证明唾液酸化水平升高与肿瘤的转移以及炎症微环境相关^[24-27]。唾液酸化水平失调与骨性关节炎和类风湿性关节炎相关，有研究表明，唾液酸化N-聚糖在骨性关节炎软骨组织中的丰度高于未损伤的软骨组织^[28]。此外，Svala等^[29]对骨性关节炎关节滑液的研究结果显示，单唾液酸化O-聚糖核心结构-1(monosialylated Core 1 O-glycans)在骨性关节炎关节滑液中的丰度明显高于正常。

上述结果也显示骨性关节炎软骨唾液酸化可能与炎症相关。在软骨细胞细胞体外培养中加入唾液酸受体能够抑制有ROS诱导引起的软骨降解^[30]。另外，通过提高α2，6-唾液酸表达，可以与半乳凝集素1竞争性结合进而抑制骨性关节炎炎症^[31]。这些研究结果也提示异常改变的糖蛋白糖链不仅是骨性关节炎软骨的特征，而且在骨性关节炎的治疗中潜在的临床应用价值。

研究结果显示，在膝关节骨性关节炎软骨组织及细胞中，凝集素PSA，LTL，WGA和NPA识别的Fucα-1, 3/6GlcNAc岩藻糖，Multivalent Sia结构以及Manα1-6Man结构在膝关节骨性关节炎软骨组织和细胞中的丰度明显较高，而凝集素Con A和PHA-E+L识别的高甘露糖型N-聚糖以及多天线结构N-聚糖在正常软骨组织及细胞中的丰度明显较高。

另外，RT-PCR以及Western blot结果也显示膝关节骨性关节炎软骨组织和细胞中参与α-1，3岩藻糖基化的糖基转移酶FUT9在膝关节骨性关节炎软骨组织以及细胞中的表达升高，这可能促进膝关节骨性关节炎软骨细胞中α-1，3岩藻糖基化水平升高。结合本研究以及文献报道推测膝关节骨性关节炎软骨中α-1，3岩藻糖基化合成的增加可能与骨性关节炎的炎症微环境相关。

研究通过对骨性关节炎软骨组织以及细胞的糖蛋白糖链谱分析发现岩藻糖以及唾液酸糖基化水平在骨性关节炎软骨中升高，这一发现也表明关节软骨蛋白糖基化修饰改变是骨性关节炎的一个重要特征。结合作者的发现和文献报道，关节软骨蛋白糖基化修饰的改变可能促进炎症因子的释放，加剧软骨损伤，而改变某些糖基化(如唾液酸化)在软骨中的表达已被证明能够有效的缓解炎症，减轻软骨的退行性病变。这也提示异常糖基化在骨性关节炎的治疗中具有潜在的应用价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

骨性关节炎患者软骨岩藻糖基化表达的升高

Alterations of fucosylation in human osteoarthritis cartilage

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 4

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	顾霞, 赵敏, 王平义, 李一梅, 李文华. 低氧诱导因子1α与低氧相关疾病信号通路的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1284-1289.
[2]	柴乐, 吕建兰, 胡劲涛, 胡华辉, 许庆军, 余进伟, 全仁夫. 诱导急性脊髓损伤模型大鼠炎症反应信号通路的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1218-1223.
[3]	耿秋东, 葛海雅, 王和鸣, 李楠. 基于网络药理学探讨龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1229-1236.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[6]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.
[7]	段丽芸, 曹晓沧. 人胎盘间充质干细胞来源细胞外囊泡调节肠炎小鼠肠黏膜胶原的沉积[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1026-1031.
[8]	杨洋, 姚羽, 沈孝天, 刘佳佳, 薛建华. 退变腰椎间盘中白细胞介素21的表达及意义[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 690-694.
[9]	马斌祥, 何万庆, 周广超, 关永林. 雷公藤内酯醇改善大鼠脊髓损伤后的运动障碍[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 701-706.
[10]	黎永华, 冯强, 谭仁霆, 黄世福, 邱金龙, 尹恒. 杜仲活性成分抗膝骨关节炎滑膜炎病变分子机制的网络药理学阐述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 765-771.
[11]	宋珊, 胡方媛, 乔军, 王佳, 张升校, 李小峰. 基于生物信息学途径认识骨关节炎滑膜的生物学标志物[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 785-790.
[12]	赵祥, 魏翠兰, 张业廷. 神经发生和炎性环境在运动条件下的改变与调节[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 813-820.
[13]	吕家兴, 白磊鹏, 杨朝昕, 苗岳松, 金宇, 李哲宏, 孙广普, 徐莹, 张擎柱. 膝关节骨性关节炎老年股骨转子间骨折行股骨近端防旋髓内钉内固定评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 391-396.
[14]	徐晓明, 陈艳, 宋倩, 袁露, 顾加明, 张丽娟, 耿洁, 董坚. 人胎盘间充质干细胞凝胶促进SD大鼠放射性皮肤损伤的愈合[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3976-3980.
[15]	阮光萍, 姚翔, 刘高米洋, 蔡学敏, 李自安, 庞荣清, 王金祥, 潘兴华. 脐带间充质干细胞移植治疗树鼩创伤性全身炎症反应综合征[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3994-4000.