绝经后骨质疏松髋关节置换者骨组织中组蛋白去甲基化酶JMJD2和雌激素受体的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0382

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (31): 4921-4925.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0382

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绝经后骨质疏松髋关节置换者骨组织中组蛋白去甲基化酶JMJD2和雌激素受体的表达

郭承¹，唐宏宇^2，3，霍少川¹，周驰²，董路珏¹，陈建发²，刘勇¹，王海彬^2，3

¹广州中医药大学，广东省广州市 510405；²广州中医药大学第一附属医院骨科中心，广东省广州市 510405；³广州中医药大学国家重点骨科实验室，广东省广州市 510405

出版日期:2018-11-08 发布日期:2018-11-08
通讯作者: 王海彬，博士，主任医师，教授，博士生导师，广州中医药大学第一附属医院骨科中心，广东省广州市 510405；广州中医药大学国家重点骨科实验室，广东省广州市 510405
作者简介:郭承，男，1988年生，河南省商丘市人，汉族，硕士，主要从事骨质疏松、股骨头坏死等骨科疾病的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81373655)；广东省省级科技计划项目(2013B021800226)

Expression of histone demethylase jumonji domain-containing protein 2 and estrogen receptor in bones of postmenopausal osteoporosis patients undergoing hip arthroplasty

Guo Cheng¹, Tang Hong-yu^{2, 3}, Huo Shao-chuan¹, Zhou Chi², Dong Lu-jue¹, Chen Jian-fa², Liu Yong¹, Wang Hai-bin^{2, 3}

¹Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; ²Orthopedics Center, the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; ³the National Key Research Laboratory of Orthopedics, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China

Online:2018-11-08 Published:2018-11-08
Contact: Wang Hai-bin, M.D., Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Orthopedics Center, the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; the National Key Research Laboratory of Orthopedics, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
About author:Guo Cheng, Master, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81373655; the Guangdong Provincial Science and Technology Program, No. 2013B021800226

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

组蛋白去甲基化酶JMJD2蛋白家族：JMJD2蛋白家族的蛋白质序列中含有组蛋白去甲基化酶标志性结构域Jumonji C(JmjC)，该结构域通过氧化反应能催化单、双和三甲基化的赖氨酸残基的去甲基化，从而发挥生物学功能，包含JMJD2A、JMJD2B、JMJD2C、JMJD2D等多个成员。

雌激素受体：雌激素通过骨细胞上的雌激素受体介导调节骨代谢，其受体分为ERα与ERβ两种亚型，都属于核受体类转录因子，主要功能是调控靶基因表达。

摘要

背景：研究发现组蛋白去甲基化酶具有促进成骨细胞分化的作用，然而绝经后骨质疏松症组蛋白去甲基化酶表达以及与雌激素受体的相关性未见报道。

目的：观察绝经后骨质疏松症患者组蛋白去甲基化酶JMJD2家族的表达变化，以及与雌激素受体的相关性。

方法：选择年龄50-70 岁因髋关节骨性关节炎行髋关节置换的绝经后患者30例，通过检测股骨颈骨密度，分为绝经后骨质疏松组15例(实验组)和骨量正常组15例(对照组)，术中收集股骨颈松质骨标本，荧光实时定量PCR、Western blot法检测骨组织中组蛋白去甲基化酶(JMJD2A、JMJD2B)和雌激素受体(ERα、ERβ)的表达水平。

结果与结论：绝经后骨质疏松组JMJD2A、JMJD2B、ERα和ERβ表达水平均低于骨量正常组，组间差异有显著性意义(P 均< 0.01)；相关性分析显示JMJD2A、JMJD2B的表达与ERα和ERβ表达均呈显著正相关(P 均< 0.01)。结果表明，绝经后骨质疏松症患者骨组织中JMJD2A、JMJD2B基因和蛋白表达均降低，JMJD2A、JMJD2B的低表达与雌激素受体表达降低密切相关；组蛋白去甲基化酶JMJD2可能参与了绝经后骨质疏松症的发病机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程
ORCID: 0000-0001-9911-0346(郭承)

关键词: 绝经后骨质疏松症, 表观遗传学, 组蛋白去甲基化酶JMJD2, 雌激素受体, 聚合酶链式反应, 蛋白质印迹, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Histone demethylase has been shown to promote osteoblast differentiation. However, little is reported on the association between postmenopausal osteoporosis and histone demethylase and estrogen receptor.

OBJECTIVE: To study the changes in the histone demethylase jumonji domain-containing protein 2 (JMJD2) family expression in patients with postmenopausal osteoporosis, and its correlation with estrogen receptor.

METHODS: Postmenopausal patients with hip osteoarthritis undergoing total hip arthroplasty, aged 50-70 years, were enrolled, including 15 postmenopausal osteoporosis patients (experimental group) and 15 patients with no postmenopausal osteoporosis (control group). During the arthroplasty, the cancellous bone specimens from the femoral neck were collected. Then, the expression levels of JMJD2A, JMJD2B, estrogen receptor α and estrogen receptor β were detected by real-time quantitative PCR, and western blot assay.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the relative expression of JMJD2A, JMJD2B, estrogen receptor α and estrogen receptor β in the experimental group were significantly decreased (P < 0.01). JMJD2A and JMJD2B were positively correlated with estrogen receptor α and estrogen receptor β (P < 0.01). These findings indicate that there is a decrease in the expression levels of JMJD2A and JMJD2B in postmenopausal osteoporosis patients. The decreased JMJD2A and JMJD2B expression is closely related to the decrease of estrogen receptor α and estrogen receptor β. Thereafter, JMJD2 may be involved in the pathogenesis of postmenopausal osteoporosis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

Key words: Osteoporosis, Postmenopausal, Histone Demethylases, Receptors, Estrogen, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

郭承，唐宏宇，霍少川，周驰，董路珏，陈建发，刘勇，王海彬. 绝经后骨质疏松髋关节置换者骨组织中组蛋白去甲基化酶JMJD2和雌激素受体的表达[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(31): 4921-4925.

Guo Cheng, Tang Hong-yu, Huo Shao-chuan, Zhou Chi, Dong Lu-jue, Chen Jian-fa, Liu Yong, Wang Hai-bin. Expression of histone demethylase jumonji domain-containing protein 2 and estrogen receptor in bones of postmenopausal osteoporosis patients undergoing hip arthroplasty [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(31): 4921-4925.

图/表（结果） 1

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计 病例-对照分析。

1.2 时间及地点 于2015年2月至2016年1月在广州中医药大学国家重点骨科实验室完成。

1.3 对象 选择2014年10月至2015年6月广州中医药大学第一附属医院骨科收治的因髋关节骨性关节炎行全髋关节置换的绝经后女性患者30例。术前采用法国MEDILINK公司双能X射线骨密度仪测量术侧股骨颈骨密度，根据《原发性骨质疏松症诊治指南》(2011年版)^[10]发布的诊断标准，分为骨量正常组15例(对照组)(T值>-1.0)和骨质疏松组15例(实验组)(T值≤-2.5)。该研究通过广州中医药大学第一附属医院医学伦理委员会审查，所有入组受试者均签署书面知情同意书。

纳入标准：①年龄50-70岁；②女性自然绝经，停经1年以上；③符合《骨关节炎诊治指南》(2007年版)^[11]中的髋关节骨关节炎诊断标准；④符合《原发性骨质疏松症诊治指南》(2011年版)^[10]中的绝经后骨质疏松症诊断标准。

排除标准：①不符合纳入标准者；②合并严重心脑血管疾病、糖尿病以及肝肾功能不全者；③合并甲状腺功能亢进、类风湿性关节炎等可引起的继发性骨质疏松症者；④糖皮质类激素应用史；⑤半年内服用可能影响骨代谢药物者。符合以上任意1条排除试验。

1.4 材料 MAGNET Total RNA Kit(Solar公司)；PrimeScript^TM RT Master Mix(TaKaRa公司)；SYBR^®Premix Ex Taq^TM Ⅱ(TaKaRa公司)；PCR引物设计及合成(上海英潍捷基公司)；JMJD2A、JMJD2B一抗(CST公司)；ERα、ERβ一抗(Santa公司)；总蛋白提取试剂盒(上海碧云天公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(Thermo公司)；Simple Western试剂套装(Protein Simple公司)；King FisherDuo全自动磁珠纯化提取仪(Thermo公司)；T100^TM Thermal Cycler(BIO-RAD公司)；CFX96^TMRT- PCR仪、微型垂直电泳仪(BIO-RAD公司)；全波长酶标仪(Thermo公司)；ChemiDoc^TM MP凝胶成像系统(BIO-RAD公司)；Simon全自动蛋白质表达分析系统(Protein Simple公司)。

1.5 方法

1.5.1 骨组织标本采集在全髋关节置换术中用无菌咬骨钳咬取股骨颈处松质骨装入冻存管中，并立即将冻存管放入小型液氮罐中，转运至-80 ℃冰箱保存备用，以待分子生物学检测。

1.5.2 荧光实时定量PCR检测JMJD2A、JMJD2B、ERα和Erβ的基因表达

标本处理：将在-80 ℃冰箱冻存的骨组织样品取出 50 mg，迅速转移至液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，直至研磨成粉末状；将粉末状样品加入到含有1 mL Trizol的1.5 mL灭菌EP管中，用移液器反复吹打；室温静置 5 min，12 000×g，4 ℃离心5 min，弃沉淀；加入200 μL氯仿，充分振荡15 s；室温静置5 min，12 000×g，4 ℃离心15 min，吸取上清至新离心管中。按照MAGNET Total RNA Kit试剂盒说明将500 μL上清，250 μL异丙醇，20 μL磁珠加入到1个孔中，其余孔依次加入MPW缓冲液，RW2缓冲液；加样完毕后，将加样板放入磁珠纯化提取仪中运行，约30 min后运行结束，即为提取的总RNA。取总RNA 2 μL于全波长酶标仪读取260，280 nm处的吸光度值，计算总RNA样品A₂₆₀/A₂₈₀比值，比值要求在1.85-2.0，并用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。

实验步骤：以总RNA为模板，按照PrimeScript ^TM RT Master Mix试剂盒说明书反转录成cDNA。从Genebank中获取基因序列，由上海英潍捷基公司采用Primer Premier 5.0软件设计合成PCR引物，以β-actin为内参，引物序列见表1。根据SYBR^®Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒说明书采用两步法PCR扩增反应程序进行检测。应用CFX96^TM RT-PCR仪进行荧光定量PCR扩增反应，反应体系25 μL：SYBR^®Premix Ex TaqⅡ12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板cDNA 2.5 μL以及去离子水8 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。根据制作的标准曲线显示目标基因和参照基因扩增效率均接近100%且相互间效率偏差在5%以内，目的基因相对表达量用2^-^??Ct法计算。

1.5.3 Western blot检测JMJD2A、JMJD2B、ERα和ERβ蛋白的表达

标本处理：将-80 ℃冰箱保存的骨组织标本取出，在液氮中研磨成粉末后，采用总蛋白提取试剂盒提取总蛋白样品，并用BCA法测定蛋白浓度，分装于-20 ℃冰箱保存备用。

实验步骤：蛋白样品检测根据Simple Western试剂套装操作说明进行，将一抗及内参β-actin抗体按1∶50稀释，将蛋白样品浓度稀释成1.5 g/L，小心地将各样品及试剂依次加入384微孔板中，上样完成后，在Simon全自动蛋白质表达分析系统上按照软件操作指南上机运行，机器自动完成样品跑胶、抗体孵育及染色成像，约5 h后，机器运行结束，生成结果。结果判定根据Graph view下的Peaks表格中目的蛋白“峰面积”数值来计算蛋白表达量。

1.6 主要观察指标 实验组和对照组骨组织中JMJD2A、JMJD2B、ERα和ERβ表达差异。

1.7 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件处理数据，计量资料以x(_)±s表示，组间比较采用独立样本t 检验；相关性分析采用Pearson相关性分析法，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

讨论

骨质疏松症是以骨组织骨密度下降，微结构紊乱以及骨折风险增加为表现的骨代谢疾病，由于在绝经后妇女中发病率较高，而成为显著的全球性健康问题^[12]。近几十年来对绝经后骨质疏松发病机制进行了大量的研究，但确切机制尚未十分明确^[13]。

组蛋白甲基化是表观遗传中重要的修饰方式之一，对基因表达的影响具有位点特异性，主要发生在组蛋白H3或H4的赖氨酸和精氨酸残基上，又以H3的赖氨酸甲基化最常见，其K4、K9、K27、K36和H4的K20等位点均可被甲基化^[6^，^14]。组蛋白H3第9位赖氨酸的甲基化与基因的失活相关联；组蛋白H3第4位赖氨酸和第36位赖氨酸的甲基化与基因的激活有关；组蛋白H3第27位赖氨酸的甲基化与同源基因沉默、X染色体失活、基因印记等基因沉默现象有关；组蛋白H3第79位赖氨酸的甲基化与防止基因失活和DNA修复有关^[5-6^，^15]。

组蛋白去甲基化酶JMJD2蛋白家族的蛋白序列中均含有组蛋白去甲基化酶标志性结构域JmjC，该结构域通过氧化反应能催化单、双和三甲基化的赖氨酸残基的去甲基化，从而发挥生物学功能^[9]。作者前期的研究证实绝经后骨质疏松症患者骨组织中组蛋白H3K9、H3K36位点呈高甲基化状态^[16]，而JMJD2 蛋白可以使H3K9、H3K36位点去甲基化，并且具有转录激活和抑制因子的功能^[17-18]。

目前，关于JMJD2蛋白家族是否参与绝经后骨质疏松女性异常骨代谢的发展过程未见明确报道。因此，试验采用荧光实时定量PCR法和Western blot法分别检测骨量正常者和绝经后骨质疏松受试者骨组织中JMJD2A、JMJD2B、ERα和ERβ基因及蛋白表达。结果显示，绝经后骨质疏松组JMJD2A、JMJD2B、ERα和ERβ表达水平较骨量正常组均降低；通过相关性分析发现JMJD2A、JMJD2B的表达与ERα、ERβ表达均呈显著正相关，然而它们之间是否存在分子机制的关联，其相互间具体信号交通机制如何，目前尚不十分清楚。Berry等^[19]研究表明，JMJD2A可以通过激活ER而促进乳腺癌细胞的增殖。Kawazu等^[20]研究发现，JMJD2A和JMJD2B通过与ER形成复合物，刺激ER的目标基因转录，在乳腺肿瘤中，ER表达阳性的患者其JMJD2B相对高表达。Shi等^[21]和Gaughan等^[22]进行了类似的研究，发现JMJD2B的表达不仅受到ER和雌激素的调控，还可以与H3的K4位点甲基化酶MLL2结合形成复合物，作为ER的共激活因子发挥功能。JMJD2B首先将ER靶基因启动子H3K9me3去甲基化，之后MLL2启动H3的K4位点甲基化，增加ER靶基因的表达，从而发挥作用。因此，作者推测JMJD2A和JMJD2B可能通过调控雌激素-ER信号通路调节骨代谢，但是还需进一步研究证实。

总之，此次研究表明组蛋白去甲基化酶JMJD2可能参与了绝经后骨质疏松症的发病机制，这为从表观遗传学角度探明绝经后骨质疏松症的发病机制提供了新的思路，但JMJD2A和JMJD2B在骨代谢中的功能和调控机制尚不明确，仍需进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

绝经后骨质疏松髋关节置换者骨组织中组蛋白去甲基化酶JMJD2和雌激素受体的表达

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