单味药鹿茸调节骨关节炎模型兔软骨细胞外基质主要成分ADAMTS-4/TIMP-3基因的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0366

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (32): 5133-5138.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0366

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单味药鹿茸调节骨关节炎模型兔软骨细胞外基质主要成分ADAMTS-4/TIMP-3基因的表达

孙志涛1，冯华龙2，何升华1，赖居易1，黄飞强2，王业广1

1深圳市中医院，广东省深圳市 518033；2广州中医药大学第四临床医学院，广东省深圳市 518033

收稿日期:2018-05-20 出版日期:2018-11-18 发布日期:2018-11-18
通讯作者: 何升华，硕士，主任医师，深圳市中医院，广东省深圳市 518033
作者简介:孙志涛，男，1978年生，安徽省淮南市人，汉族，2013年广州中医药大学毕业，博士，主治医师，主要从事脊柱、髋膝关节退行性变研究。
基金资助:
深圳市卫生计生系统科研项目(201505016)

Pilose antler regulates the expression of ADAMTS-4/TIMP-3 gene in the extracellular matrix in a rabbit model of osteoarthritis

Sun Zhi-tao1, Feng Hua-long2, He Sheng-hua1, Lai Ju-yi1, Huang Fei-qiang2, Wang Ye-guang1

1Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital, Shenzhen 518033, Guangdong Province, China; 2Fourth Clinical Medical College, Guangzhou University of Chinese Medicine, Shenzhen 518033, Guangdong Province, China

Received:2018-05-20 Online:2018-11-18 Published:2018-11-18
Contact: He Sheng-hua, Master, Chief physician, Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital, Shenzhen 518033, Guangdong Province, China
About author:Sun Zhi-tao, MD, Attending physician, Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital, Shenzhen 518033, Guangdong Province, China
Supported by:
the Shenzhen Health and Family Planning System Research Project, No. 201505016

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
羟脯氨酸：是亚氨基酸之一，人体胶原蛋白中含量最高，关节软骨主要由细胞外基质组成，细胞外基质中Ⅱ型胶原是含量最高的有机成分，为特征性蛋白，其主要成分为羟脯氨酸，是软骨中特征性氨基酸，细胞外基质中Ⅱ型胶原的降解促进羟脯氨酸释放，故膝关节软骨中羟脯氨酸的含量反映了膝关节退变程度。
蛋白聚糖：是细胞外基质的重要成分之一。可与细胞外基质中的胶原、纤粘连蛋白、层粘连及弹性蛋白结合，构成具有组织特性的细胞外基质。不同组织的细胞外基质中含有不同类型、不同含量蛋白聚糖，并与其功能相适应。

摘要
背景：大量研究证实鹿茸对于治疗骨关节炎有效，但是其与软骨细胞外基质主要成分ADAMTS-4/TIMP-3基因的相关性却报道较少。
目的：探讨鹿茸对兔骨关节炎模型ADAMTS-4/TIMP-3基因表达的影响，进一步阐明鹿茸防治骨关节炎的作用机制。
方法：选择健康雌性新西兰大白兔42只，采用前交叉韧带离断法建立兔骨关节炎模型，随机分为3组：对照组(生理盐水)、低剂量鹿茸组(0.21 g/kg)和高剂量鹿茸组(0.84 g/kg)。干预9周后，检测双膝关节中的羟脯氨酸含量，采用RT-PCR检测各组软骨靶基因mRNA的表达，采用Western blot测量蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的表达。
结果与结论：①低剂量鹿茸组和高剂量鹿茸组软骨羟脯氨酸含量显著高于对照组，且高剂量鹿茸组显著高于低剂量鹿茸组(P < 0.05)；②高剂量鹿茸组和低剂量鹿茸组ADAMTS-4 mRNA表达较对照组明显降低，且高剂量显著组低于低剂量鹿茸组(P < 0.05)，而TIMP-3、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白mRNA表达较对照组明显增加，且高剂量鹿茸组显著高于低剂量鹿茸组(P < 0.05)；③高剂量鹿茸组和低剂量鹿茸组蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白表达较对照组明显增高，且高剂量鹿茸组显著高于低剂量鹿茸组(P < 0.05)；④结果提示，鹿茸通过抑制ADAMTS-4的分泌，促进保护因子TIMP-3的分泌，阻止蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白蛋白的降解，起到修复软骨的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-2435-0227(何升华)

关键词: 鹿茸, 兔模型, 骨关节炎, ADAMTS-4, TIMP-3, 羟脯胺酸, 蛋白聚糖, Ⅱ型胶原蛋白, 软骨修复

Abstract:

BACKGROUND: Pilose antler has been shown to be effective for osteoarthritis, but its association with ADAMTS-4/TIMP-3 gene (main composition of extracellular matrix) is rarely reported.
OBJECTIVE: To investigate the effect of pilose antler on the expression of ADAMTS-4/TIMP-3 gene in rabbit models of osteoarthritis, and to further elucidate the mechanism of pilose antler in the prevention and treatment of osteoarthritis.
METHODS: Forty-two healthy female New Zealand white rabbits were selected and used for establishing the models of osteoarthritis by anterior cruciate ligament rupture. The rabbit models were then randomized into three groups: control group (normal saline), low-dose (0.21 g/kg) and high-dose (0.84 g/kg) pilose antler groups. After intervention for 9 weeks, the content of hydroxyproline in both knees was detected. The expression levels of mRNA of cartilage target genes in each group were detected by RT-PCR. Protein expression levels of aggrecan and collagen type II were determined by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the content of hydroxyproline in cartilage in the low-dose and high-dose pilose antler groups was significantly increased, and the content in the high-dose pilose antler group was significantly higher than that in the low-dose pilose antler group (P < 0.05). The order of mRNA expression level of ADAMTS-4 was as follows: high-dose pilose antler group < low-dose pilose antler group < control group (P < 0.05). The order of mRNA expression levels of metallopeptidase inhibitor 3, aggrecan and collagen type II was as follows: high-dose pilose antler group > low-dose pilose antler group > control group (P < 0.05). The expression levels of aggrecan and collagen type II were the highest in the high-dose pilose antler group, followed by the low-dose pilose antler group, and the lowest in the control group (P < 0.05). Our findings indicate that pilose antler can repair the injured cartilage by inhibiting the secretion of ADAMTS-4, increasing the secretion of metallopeptidase inhibitor 3 and preventing the degradation of aggrecan and collagen type II.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Drugs, Chinese Herbal, Osteoarthritis, Extracellular Matrix, Cartilage, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

孙志涛，冯华龙，何升华，赖居易，黄飞强，王业广. 单味药鹿茸调节骨关节炎模型兔软骨细胞外基质主要成分ADAMTS-4/TIMP-3基因的表达[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(32): 5133-5138.

Sun Zhi-tao1, Feng Hua-long2, He Sheng-hua1, Lai Ju-yi1, Huang Fei-qiang2, Wang Ye-guang1. Pilose antler regulates the expression of ADAMTS-4/TIMP-3 gene in the extracellular matrix in a rabbit model of osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(32): 5133-5138.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 42只新西兰大白兔全部进入结果分析，无脱落。

2.2 造模后兔软骨形态变化及病理改变鹿茸干预2疗程后高剂量鹿茸组可见关节面不平整，平台边缘可见较浅的软骨溃瘍，软骨表面有毛糙；低剂量鹿茸组软骨显示关节面有较深廉烂，软骨下骨隐约可见，关节边缘软组织增生明显；对照组关节面软骨全层剥脱，软骨下骨显露，关节边缘软组织增生明显(图1)。

高剂量鹿茸组光镜下可见表层软骨细胞肿胀变圆，扁平的软骨细胞减少，软骨细胞簇集；低剂量鹿茸组表层及中层细胞收缩，细胞数量弥漫性增多，出现大量簇集细胞团；对照组大部分软骨的表层细胞消失，软骨表面出现溃烂缺损，软骨细胞数量减少，可见坏死崩解细胞，潮线紊乱甚至消失(图2)。

2.3 各组羟脯氨酸含量的比较高剂量鹿茸组湿质量和干质量组羟脯氨酸的含量显著高于低剂量鹿茸组(t=3.41，P=0.00；t=2.73，P=0.02)。高剂量鹿茸组湿质量和干质量组羟脯氨酸的含量显著高于对照组 (t=6.56，P=0.00；t=6.97，P=0.00)。低剂量鹿茸组湿质量和干质量组的羟脯氨酸含量显著高于对照组 (t=3.15，P=0.01；t=4.24，P=0.00)，表1。

2.4 各组软骨中靶基因mRNA的表达高剂量鹿茸组ADAMTS-4 mRNA的表达显著低于低剂量鹿茸组和对照组(t=3.05，P=0.01；t=7.24，P=0.00)；低剂量鹿茸组ADAMTS-4 mRNA的表达显著低于对照组(t=4.19，P=0.00)。而高剂量鹿茸组TIMP-3、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白mRNA的表达显著高于低剂量鹿茸组和对照组(t=2.45，P=0.03；t=2.57，P=0.02；t=3.76，P=0.00；t=6.02，P=0.00；t=6.36，P=0.00；t=6.74，P=0.00)；低剂量鹿茸组TIMP-3、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白mRNA的表达显著高于对照组(t=3.57，P=0.00；t=3.79，P=0.00；t=2.97，P=0.01)，见表2。

2.5 各组软骨中蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的表达高剂量鹿茸组蛋白聚糖的表达显著高于低剂量鹿茸组和对照组(t=2.15，P=0.048；t=7.28，P=0.00)；低剂量鹿茸组蛋白聚糖的表达显著高于对照组(t=5.13，P=0.00)。高剂量鹿茸组Ⅱ型胶原蛋白的表达显著高于低剂量鹿茸组和对照组(t=6.29，P=0.00；t=8.72，P=0.00)；低剂量鹿茸组Ⅱ型胶原蛋白的表达显著高于对照组(t=2.43，P=0.03)，见表3，图3。

2.1 实验动物数量分析 42只新西兰大白兔全部进入结果分析，无脱落。

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引言

骨关节炎是由内在和外在因素的共同作用下导致软骨细胞、细胞外基质、软骨下骨代谢失衡的一种慢性、进展性关节疾病。骨关节炎是引起膝关节疼痛、活动不适的主要原因之一，发病人群以中老年和下肢运动量较大者多见，在全球的发病率占世界人口的4%-13%，中国老年人发病率约60%^[1]。骨关节炎严重者出现双下肢畸形，活动受限，严重影响日常生活和工作。但目前骨关节炎的发病机制仍未明确^[2-3]。

为明确骨关节炎的发病机制，增加对骨关节炎的早期诊断及治疗针对性，研究者做了一系列相关研究。总结出骨关节炎发病机制是由多种因素所致，包括基因遗传性；软骨营养、代谢异常；生物力学因素；软骨细胞凋亡等^[4]。其中软骨的营养及代谢一直被临床关注。带有血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解整链蛋白金属蛋白酶4(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4，ADAMTS-4)在关节软骨中对蛋白聚糖有降解作用，软骨蛋白聚糖的丢失是由于蛋白聚糖中的核心蛋白被水解，研究证实ADAMTS-4基因敲除可以有效阻止蛋白聚糖的水解，减缓骨关节炎的退变程度^[5-6]。

研究认为基质金属蛋白酶组织抑制剂3(tissue inhibitor of metalloproteinase-3，TIMP-3)是基质金属蛋白酶特异性抑制剂，不仅可以抑制基质金属蛋白酶的活性，同时也可以抑制ADAMTS-4的活性^[7-9]。已有研究证实，ADAMTS-4/ TIMP-3系统调控椎间盘退变进程，且椎间盘的退变程度与TIMP-3的表达呈负相关，与ADAMTS-4的表达则相反^[10]。

椎间盘组织主要由胶原和蛋白多糖构成，和关节软骨极为相似。且椎间盘退变和关节软骨退变非常相似，都包括蛋白多糖、胶原蛋白和水分的丢失。在此基础上，课题组假设关节软骨的退变机制也与此密切相关，及软骨退变过程中ADAMTS-4/TIMP-3系统失衡。因此设计当前研究，探讨ADAMTS-4/TIMP-3系统和骨关节炎的相关性以及鹿茸对于ADAMTS-4/TIMP-3系统的调控作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2016年9月至2017年2月在深圳北京大学香港科技大学医学中心完成。

1.3 材料

1.3.1 动物 42只3月龄雌性新西兰大白兔，体质量(2.8±0.6) kg，由广东省医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(粤)2015-0002。购置后于深圳市中医院动物房饲养管理。实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》的要求。研究已通过深圳市中医院医学动物伦理委员会批准，批准号：SYXK(粤)2010-0106。

1.3.2 实验仪器与试剂漩涡振荡机(北京卓信伟业科技有限公司)，Invitrogen™ E-Gel™ Imager凝胶成像仪(美国赛默飞世尔科技公司)，实时定量PCR(Applied Biosystems公司)，Power Pac Basic电泳仪(美国赛默飞世尔科技公司)，Leica倒置显微镜(苏州南光电子科技有限公司)，体积分数10%水合氯醛溶液(永丰化工股份有限公司)，2%琼脂糖凝胶(美国赛默飞世尔科技公司)，裂解液，Pierce BCA Protein Assay Kit，10%聚丙烯酰胺凝胶(广州赛美药业)，TBS-Tween-20，mi Script SYBR Green PCR 检测试剂盒凯杰 218073(上海玉博生物科技有限公司)，青霉素(上海蓓琅生物科技有限公司)，琼脂糖(美国赛默飞世尔科技公司)，Trizol试剂(美国Sigama)。引物蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白及内参由美国ABI公司合成，羟脯氨酸试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20161202)，PrimeScript^®RT reagent Kit WithgDNA Erase(TaKaRa公司，RR047A， 20 μL反应×100次)，Aggrecan检测试剂盒(96T/48T)。

1.4 方法

1.4.1 动物造模、分组及给药 42只新西兰大白兔采用前交叉韧带离断法建立兔骨关节炎模型，根据体质量经腹腔注射体积分数10%水合氯醛溶液(3.5 mL/kg)，麻醉成功后，仰卧位固定于操作台。双膝关节刮毛备皮，常规0.5%碘伏消毒，无菌条件下于膝关节内侧作约4 cm的纵形切口。将髌骨向外侧推至脱位使膝关节处于最大屈曲状态，暴露关节腔后直视下切断双膝前交叉韧带，注意保护关节软骨面，行抽屉试验确认前交叉韧带完全断裂后，生理盐水冲洗关节腔，逐层缝合，造模后不固定，分笼喂养。造模后连续 3 d每只新西兰大白兔每天肌肉注射青霉素40×10⁴ U预防感染。常规喂养4周。

造模4周后将模型兔按随机数字表随机分为3组：对照组、低剂量鹿茸组和高剂量鹿茸组，每组14只。

鹿茸片于深圳市中医院药房提供，用打粉机粉碎鹿茸片，再用120目的滤网筛过滤掉杂质及过粗药渣，取滤过的细鹿茸粉与生理盐水制成相应浓度的溶液，低剂量鹿茸组按0.21 g/kg药量给药，高剂量鹿茸组按0.84 g/kg药量给药，对照组每天予以相应量的生理盐水，2次/d，15 d为一个疗程，连续灌胃2个疗程，每个疗程间间隔2 d。2个疗程后处死并在无菌操作下取得兔双膝软骨组织置于液氮中保存。

1.4.2 造模后兔软骨形态变化及病理改变鹿茸干预2个疗程后处死新西兰大白兔获取双侧膝关节标本，大体观察并拍照记录膝关节形态。苏木精-伊红染色：固定、脱钙兔膝关节标本后，正中矢状面剖开，取内外侧半关节，经逐级乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡后关节切面紧贴包埋盒底部包埋，连续切片厚4.0-5.0 μm，切片常规脱蜡，自来水冲洗后行常规苏木素-伊红染色；切片入苏木素浸染5 min，水洗，再入伊红浸染5 min，水洗。二甲苯透明，中性树胶封固。光镜下观察染色的切片。

1.4.3 羟脯氨酸的测量每组各取4例(8膝)兔膝关节软骨组织(约80 mg)，超净台上刮下软骨并且称取湿质量，每组另取4只与前相对应同湿质量的软骨组织，经60 ℃烘箱干燥36 h后记录其干质量。干质量和湿质量均按照试剂说明操作测定羟脯氨酸含量。测量方法：根据羟脯氨酸试剂盒说明书(样本碱水解法)操作。取软骨组织湿质量或干质量0.08-0.10 g放入15 mL试管中，水解样本，调节pH值，取上清，加试剂充分混合后离心，取上清，在550 nm处、1 cm光径，测量吸光度值并计算羟脯氨酸的量。

1.4.4 RNA提取^[11]　用Trizol法提取RNA。将保存于液氮中的6例(12膝)约120 mg兔关节软骨用无菌眼科剪剪碎后置入研钵，加入1.0 mL Trizol试剂，研磨并匀浆，将匀浆液移入EP管内，置于冰上5 min。在4 ℃条件下离心， 12 000 r/min，15 min，离心完成后转移上清液至新的EP管中。加入三氯甲烷0.2 mL，旋涡振荡30 s再次离心 10 min，取上清液，加入1/2体积的异丙醇、0.8 mmol/L柠檬酸钠和1.2 mmol/L氯化钠的混合液，混匀后放入-20 ℃冰箱静置30 min后取出，按上述转数及温度离心5min后弃上清。空气干燥5 min，各EP管加30 μL的DEP水以充分溶解RNA。溶解后的RNA经紫外分光光度计检测吸光度值，测得样本A₂₆₀/A₂₈₀比值，若比值介于1.8-2.0则说明RNA纯度符合试验要求。样品经2%琼脂糖凝胶进行电泳检测RNA的完整性。按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明书进行，合成单链cDNA作为模板，并选择β-actin作为内参，对ADAMTS-4、TIMP-3、蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白mRNA进行PCR扩增。

1.4.5 RT-PCR测定软骨中ADAMTS-4、TIMP-3、蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的mRNA表达采用mi Script SYBR Green PCR Kit (200)试剂，在实时定量PCR上按照说明书标准步骤进行反应。95 ℃下预变反应5 min，每个循环变性45 s 94 ℃，退火45 s 55 ℃，延伸45 s 72 ℃，行40个循环，最后72 ℃反应15 min。反应完成后根据结果计算2^-^??Ct值进行定量分析。采用Primer 5. 0软件设计引物。

引物序列：
名称	引物	产物片段(bp)
ADAMTS-4	上游：5'-GAT GCT ACG AGG CGC GT-3' 下游：5'-GTC CCT ACG AGT CAC GG-3'	296
TIMP-3	上游：5'-GAT CCT TCG TAG ACG AGG-3' 下游：5'-GTC AGC TAC TGA GAC ACG C-3'	256
蛋白聚糖	上游：5''-GAT GAC TGC ACG AGC AGC GC-3' 下游：5'-GTC GCT ACT AGT CAC AGC GT-3'	766
Ⅱ型胶原蛋白	上游：5'-GCT CGT ACG TAG AGG AGT-3' 下游：5'-GCC AGC TAC TCC GAC TCG C-3'	226

PCR反应体系如下：12.5 μL 2*Quantiect SYBR Green PCR，2.5 μL 10*miscript Universal Primer，2.5 μL 10*miscript Primer Assay 27a，5 μL RNase-free water，2.5 μL Template CDNA，总反应体积为25 μL。PCR扩增反应结束后，在体积分数2%琼脂糖凝胶电泳以进一步检测PCR反应的成功。

1.4.6 Western blot检测Ⅱ型胶原蛋白的表达将6例(12膝)约120 mg兔软骨置于2 mL匀浆器中球状部位，用干净的眼科剪将组织块尽量剪碎。加400 μL去污剂裂解液(含PMSF)于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。5 min后再碾一次再置于冰上，重复碾3次使组织尽量碾碎。裂解 30 min后，用移液器将裂解液移至1.5 mL离心管中，在4 ℃下12 000 r/min离心5 min，取上清液即为组织总蛋白。将提取的蛋白在参照试剂说明进行各种液体的配制，参照蛋白质定量试剂盒(BCA法)蛋白定量；按一定浓度进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)恒压电泳，浓缩胶80 V，20-30 min，离胶100 V电泳，电泳时间根据Marker的位置确定；恒流276 mA 转膜2.5 h；室温封闭2 h；加入一抗(Ⅱ型胶原蛋白 1∶400 稀释)，4 ℃过夜。加入二抗(1∶2 000稀释)室温孵育2 h；暗室曝光。利用电泳成像进行灰度测定，计算灰度值，进行半定量分析。

1.4.7 软骨内蛋白聚糖含量的测定将6例(12膝)约 120 mg兔软骨置于1.0-2.0 mL匀浆器中球状部位，用干净的眼科剪将组织块尽量剪碎，用研钵重复碾3次使组织尽量碾碎。按照蛋白聚糖检测试剂盒说明书方法操作，应用双抗体夹心法测定，用纯化的蛋白聚糖抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入蛋白聚糖组织，再与HRP标记的软骨抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的待测物质呈正相关。用酶标仪在 450 nm波长下测定吸光度值，通过标准曲线计算软骨中蛋白聚糖浓度。

1.5 主要观察指标 ①羟脯氨酸的含量；②ADAMTS-4、TIMP-3、蛋白聚糖及Ⅱ型胶原蛋白mRNA的表达量；③蛋白聚糖及Ⅱ型胶原蛋白的蛋白表达量。

1.6 统计学分析采用SPSS 20.0统计分析。计量资料实验数据结果以x(_)±s表示，组间比较，正态性数据且方差齐者采用配对t 检验，方差不齐者采用Dunnett T3分析；非正态性数据采用非参数检验。a=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

随着社会老龄化，膝骨关节炎的发病率较前明显上升，不仅降低了中老年人的生活质量，同时也为社会和家庭带来了沉重的负担。关于骨关节炎的研究很早就有报道，1996年娄思权^[12]就提出骨关节炎的发病可能与遗传因素、环境因素、慢性损伤、肥胖、饮食等有关，生物学研究表明，其发病因素与免疫因素、生长因子、细胞因子密切相关。但是谷艳超^[13]提出目前骨关节炎发病机制共识是异常的生物力学因素破坏软骨细胞、细胞外基质和软骨下骨的之间的相互作用而引起。但是骨关节炎具体发病机制目前尚不明确^[14-15]。骨关节炎以软骨细胞、细胞外基质、软骨下骨中合成与分解代谢偶联失衡为主要病理特征^[16-17]。而软骨内羟脯氨酸、蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白蛋白的含量是软骨是否退变的重要指标^[18-19]。关节软骨主要由细胞外基质组成，细胞外基质中Ⅱ型胶原是含量最高的有机成分，为特征性蛋白，其主要成分为羟脯氨酸，是软骨中特征性氨基酸，细胞外基质中Ⅱ型胶原的降解促进羟脯氨酸释放，故膝关节软骨中羟脯氨酸的含量反映了膝关节退变程度^[20-22]。研究表明膝骨关节炎的进展与Ⅱ型胶原蛋白及蛋白多糖的代谢水平有关，通过检测羟脯氨酸浓度来间接反映Ⅱ型胶原生成情况^[23-26]。既往骨关节炎研究中虽然大部分以上述指标作为主要观察指标，但是各指标与ADAMTS-4、TIMP-3的关系均未见描述^[13]。

当前研究结果显示各组中羟脯氨酸、蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的含量高剂量鹿茸组均为最高，表明鹿茸能够抑制侵袭因子ADAMTS-4的分泌，促进保护因子TIMP-3的表达，从而阻止细胞外基质主要成分蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的降解，达到减缓关节退变的目的。课题组前期实验研究对鹿茸归经靶向作用于骨关节炎早期软骨形成的相关机制进行了探讨，发现TGF-β/Smads信号转导通路只是软骨细胞内生物分子网络的一部分，其它包括炎性因子、MAPK等介导的信号通路在骨关节炎的发生、发展中也起到重要的作用^[27-29]。而ADAMTS-4/TIMP-3系统可能就是TGF-β/Smads信号转导通路之外的又一个重要通路。根据研究结果及前期实验研究，推断，ADAMTS-4/TIMP-3系统失衡可能是骨关节炎形成的重要机制之一。

当前研究结果显示ADAMTS-4/TIMP-3系统软骨修复具有紧密联系，鹿茸通过调控ADAMTS-4/TIMP-3系统，对软骨起到修复作用。为骨关节炎的研究提供了新的方向。但是该系统是否还有其他因子涉及，鹿茸是否通过其他通路修复了软骨，有待进一步的实验研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

单味药鹿茸调节骨关节炎模型兔软骨细胞外基质主要成分ADAMTS-4/TIMP-3基因的表达

Pilose antler regulates the expression of ADAMTS-4/TIMP-3 gene in the extracellular matrix in a rabbit model of osteoarthritis

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