几种常用针具局部松解部位骨骼肌的损伤和修复过程及病理变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0086

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (4): 535-541.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0086

• 肌肉肌腱韧带组织构建 tissue construction of the muscle, tendon and ligament • 上一篇下一篇

几种常用针具局部松解部位骨骼肌的损伤和修复过程及病理变化

景亚军1，张磊1，张少群1，廖立青1，袁仕国2，李义凯1

1南方医科大学中医药学院，广东省广州市 510515；2海南省中医院，海南省海口市 570203

收稿日期:2017-12-25 出版日期:2018-02-08 发布日期:2018-02-08
通讯作者: 李义凯，教授，博士生导师。南方医科大学中医药学院，广东省广州市 510515
作者简介:景亚军，男，汉族，1990年生，甘肃省陇南市人，南方医科大学中医药学院在读硕士，主要从事骨伤科解剖及生物力学的基础研究。
基金资助:
广东省中医药管理局项目(20172098)；海南省科协青年科技英才创新计划项目(201519)；海南省自然科学基金项目(817340)

Pathological changes of the skeletal muscle after local loosening therapies

Jing Ya-jun 1, Zhang Lei1, Zhang Shao-qun1, Liao Li-qing1, Yuan Shi-guo2, Li Yi-kai1

1School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China; 2Hainan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Haikou 570203, Hainan Province, China

Received:2017-12-25 Online:2018-02-08 Published:2018-02-08
Contact: Li Yi-kai, Professor, Doctoral supervisor, School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
About author:Jing Ya-jun, Studying for master’s degree, School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
Supported by:
the Project of Traditional Chinese Medicine Administration of Guangdong Province, No. 20172098; the Youth Science and Technology Innovation Program of Hainan Association for Science and Technology, No. 201519; the Natural Science Foundation of Hainan Province, No. 817340

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
软组织松解：是基于古代采用粗大针具针刺治疗经筋痹症的一种方法，是使用特定针具通过对局部病变软组织直接切开、横向剥离、密集针刺、透拨及上挑针体等手法而达到松解局部软组织的作用。
增生性瘢痕：是以成纤维细胞为主的细胞增殖、活性增强，产生大量的胶原蛋白，使包括Ⅰ，Ⅲ型胶原为主的细胞外基质成分在组织中大量沉积，而难以被机体吸收或重塑的病理状态。

摘要
背景：局部软组织松解疗法被广泛应用于慢性软组织损伤类疾病的康复治疗，并取得一定的临床疗效。然而局部软组织松解作为一种侵入性、有创性治疗方法，鲜有研究探讨和观察松解治疗后局部组织病理变化过程及转归。
目的：观察几种临床常用针具局部肌肉松解后松解部位肌组织的修复过程及其病理变化。
方法：选用松筋针、银质针、长圆针、小针刀、刃针及铍针分别刺入大鼠腓肠肌肌腹中部0.5-1.0 cm，局部松解两三次。分别于干预后第3，7，14，21，30天处死大鼠，取针刺部组织多聚甲醛固定后进行苏木精-伊红及免疫组织化学染色，光学显微镜下观察局部肌肉的组织形态与病理变化；采用 Cell Sens-Entry 1.15 软件采集图像并进行微血管密度及成纤维细胞计数；采用 Image Proplus 6.0 图像分析软件测量 Ⅰ型胶原纤维的积分吸光度值。
结果与结论：①苏木精-伊红染色：干预后第 3天，可见有不同程度的肌纤维溶解、坏死及炎性细胞浸润；干预后第7天，炎性细胞减少，成纤维细胞活化、增殖，肉芽组织增生；干预后第14天，局部胶原堆积伴肉芽组织大量形成；干预后第21天，胶原减少，肉芽组织机化；干预后第30天，局部组织瘢痕化；②免疫组织化学染色：干预后各时期松解局部均可见Ⅰ型胶原纤维。干预后同一时间，同类针具不同直径间微血管密度、成纤维细胞计数及积分吸光度值均为先增后减趋势，其各组间比较差异均有显著性意义(P < 0.01)，同类型针具直径越大其损伤效应越大；③结果证实，实验中几种新型针具局部肌肉松解对腓肠肌组织有一定的损伤效应，松解干预后局部组织炎性变，肉芽组织机化最终导致局部组织瘢痕化修复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-1291-4104(景亚军)

关键词: 针具, 骨骼肌, 局部松解, 病理, 组织形态, 瘢痕, 损伤, 腓肠肌, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: Local soft tissue lysis has been widely used in clinical rehabilitation treatment of chronic soft tissue injuries, and has achieved certain clinical outcomes. However, it is an invasive treatment, and there is little information about the pathological changes and prognosis of the local tissues post-treatment.
OBJECTIVE: To observe the repair process and pathologic changes of the muscles after local soft tissue lysis with several needles.
METHOD: Songjin-needle, Yinzhi-needle, Changyuan-needle, Xiaozhen-needle, Ren-needle and Pi-needle were inserted into the belly of rat gastrocnemius gastrocnemius with a depth of 0.5-1.0 cm, twice or thrice. Then the rats were killed at 3, 7, 14, 21 and 30 days after acupuncture. The corresponding parts of tissues were removed and fixed with paraformaldehyde, and stained with hematoxylin and eosin and immunohistochemistry to observe the histomorphological features and pathological changes under light microscope. The CellSens-Entry 1.15 software was used for image acquisition, and the number of fibroblast cells and microvessel density were calculated. The integral absorbance values of collagen type I were calculated by Image Pro plus 6 software.
RESULTS AND CONCLUSION: On day 3 after intervention, muscle fiber dissolution, necrosis and inflammatory cell infiltration were visible. On day 7, there was a reduction in inflammatory cells, fibroblast activation and proliferation, and granulation tissue hyperplasia. On day 14, there was local accumulation of collagen with substantial granulation tissues. On day 21, collagen fibers decreased and granulation tissues organized. On day 30, there was local scar formation. Immunohistochemical staining results showed that there was collagen type I in the surgical area after intervention. The microvessel density, fibroblast count and integral absorbance value increased firstly and then decreased, which showed significant differences among groups (P < 0.01). These findings imply that the new types of needles for local soft tissue lysis do certain damage to the gastrocnemius muscle, and the inflammatory changes of the local tissue and granulation tissue organized will result in local scar formation after loosening therapies.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Muscle, Skeletal, Cicatrix

中图分类号:

R318

景亚军，张磊，张少群，廖立青，袁仕国，李义凯 . 几种常用针具局部松解部位骨骼肌的损伤和修复过程及病理变化[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(4): 535-541.

Jing Ya-jun 1, Zhang Lei1, Zhang Shao-qun1, Liao Li-qing1, Yuan Shi-guo2, Li Yi-kai1. Pathological changes of the skeletal muscle after local loosening therapies[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(4): 535-541.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析纳入大鼠108只，均进入结果分析，无死亡和感染等。

2.2 干预后局部组织苏木精-伊红染色观察松解干预后第3天，各组松解局部均可见不同程度的肌纤维排列紊乱、溶解、坏死，大量炎性细胞聚集；干预后第7天，炎性反应减弱，成纤维细胞活化、向创区迁移并大量增殖，不同程度的新生毛细血管形成，肉芽组织形成并开始增生；干预后第14天，成纤维细胞向纤维细胞转化，局部大量胶原纤维堆积、无序排列并伴有肉芽组织大量形成，干预后第21天，胶原纤维及新生毛细血管逐渐减少，肉芽组织开始机化；干预后第30天，局部胶原纤维束状排列，间质中存在大量胶原沉积，新生毛细血管减少，局部组织瘢痕但尚未稳定(图1)。

2.3 不同时间、不同直径及类型针具干预部位组织微血管密度比较所选6种针具松解干预后，不同时间各组微血管密度比较见表1，2：同一针具不同时间点间微血管密度比较差异有显著性意义(P < 0.01)，两类针具干预后，微血管密度变化呈现先增加后逐渐下降趋势，干预后第7天，微血管密度达到峰值(均值：带刃型为13.17，圆钝型为17.42)，其后逐渐下降。相同时间，同类型针具不同直径间微血管密度比较差异有显著性意义(P < 0.01)，同类型针具其直径越大则微血管密度值越大；3种带刃针具组间微血管密度两两比较差异有显著性意义(P < 0.01)，相同时间小针刀组微血管密度值最大，铍针组最小；3 种圆钝型针具组间微血管密度两两比较，松筋针组与银质针组、长圆针组间微血管密度比较差异有显著性意义(P < 0.05)，松筋针组微血管密度值最大，长圆针组最小。

2.4 不同时间、不同直径及类型针具干预部位组织成纤维细胞计数比较松解干预后，不同时间各组成纤维细胞计数比较见表3， 4，同一针具不同时间点间成纤维细胞计数比较差异有显著性意义(P < 0.01)，两类针具干预后，成纤维细胞计数变化呈现先增加后逐渐下降趋势，干预后第7天，成纤维细胞计数达到峰值(均值：带刃型为59.80，圆钝型为75.07)，其后逐渐下降。相同时间，同类型针具不同直径间成纤维细胞计数比较差异有显著性意义(P < 0.01)，同类型针具直径越大则其成纤维细胞数目越多。3 种带刃针具组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.01)，其中小针刀组成纤维细胞数目最多，铍针组最少；3种圆钝型针具组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.01)，其中松筋针组最多，长圆针组最少。成纤维细胞计数变化趋势与MVD变化趋势一致。

2.5 干预部位组织Ⅰ型胶原纤维免疫组织化学染色观察及积分吸光度值比较免疫组织化学染色图2显示，干预后伴随成纤维细胞活化，细胞外基质分泌及胶原蛋白合成，Ⅰ型胶原沉积区被染色为棕黄色。不同时间各组积分吸光度值比较见表5，6，同一针具不同时间点间积分吸光度值比较差异有显著性意义(P < 0.01)，两类针具干预后，Ⅰ型胶原纤维积分吸光度值变化呈现先增加后逐渐下降趋势，干预后第7天，积分吸光度值达到峰值(均值：带刃型为 6 507.13，圆钝型为7 140.57)，其后逐渐下降。相同时间，同类型针具不同直径间Ⅰ型胶原纤维积分吸光度值比较差异有显著性意义(P < 0.01)，同类型针具其直径越大则其Ⅰ型胶原纤维积分吸光度值越大，3 种带刃针具组间积分吸光度值两两比较差异有显著性意义(P < 0.01)，其中小针刀组Ⅰ型胶原纤维积分吸光度值最大，铍针组最小；3 种圆钝型针具组间积分吸光度值两两比较差异有显著性意义(P < 0.05)，其中松筋针组Ⅰ型胶原纤维积分吸光度值最大，长圆针组最小。积分吸光度值变化趋势与微血管密度变化、成纤维细胞计数变化一致。干预第30天，可见Ⅰ型胶原尚未完全降解吸收，不同程度的沉积于创区(P < 0.01)，是瘢痕形成的主要因素之一，实验的免疫组织化学染色与苏木精-伊红染色结果基本一致。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2017年2月至7月在南方医科大学南方医院病理实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物健康8周龄雄性SD大鼠108只，体质量(285.5±18.3)g，由南方医科大动物实验中心提供，许可证号：SCXK(粤)20160041，动物正常饲养，恒温，恒湿，自由饮水。

1.3.2 针具松筋针(1.0 mm×40.0 mm，石家庄钱乙医疗器械科技有限公司)；银质针(0.9 mm×50.0 mm，重庆市健翔医疗器械有限公司)；长圆针(0.8 mm×50.0 mm，北京中太康针刀医疗器械有限公司)；小针刀(1.0 mm×50.0 mm，江苏华友医疗器械有限公司)；刃针(0.8 mm×40 mm，北京中太康针刀医疗器械有限公司)；铍针(0.6 mm× 40.0 mm，安徽马鞍山邦德医疗器械公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 分组与干预将大鼠随机分为6组，每组18只。每组各取3只作为补充备用，其余大鼠依照观察时间随机平均分配。适应性饲养1周后，腹腔注射体积分数3%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉后，仰卧位固定于操作台，备皮消毒。此6组分别参照松筋针、银质针、长圆针、小针刀、刃针及铍针人体局部松解操作方法进行干预^[11-14]，刺入深度0.5-1.0 cm，于大鼠两侧腓肠肌肌腹实施模拟松解两三次，操作时要求术者松解力度、范围及时间尽量保持相同，术毕用无菌棉球按压术区两三分钟，无菌创可贴包扎。

1.4.2 取材、制片与苏木精-伊红染色实验大鼠分别于干预后第3，7，14，21，30天处死，每个时间点取3只，解剖分离腓肠肌，取下1 cm³组织块经40 g/L多聚甲醛4 ℃固定过夜，常规脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，4 µm厚切片，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察腓肠肌组织形态及其病理变化。

1.4.3 免疫组织化学染色组织切片进行免疫组织化学染色，观察创区Ⅰ型胶原蛋白表达。染色步骤：①切片常规脱蜡至水；②滴加体积分数3%H₂O₂灭活内源性过氧化酶10 min，微波炉加热至沸腾后断电，自然冷却至室温；③将切片置于0.1 mol/L枸橼酸钠缓冲液中(pH 7.4) 10 min，室温；④滴加5%BSA封固，37 ℃反应30 min；⑤滴加一抗(兔抗大鼠Ⅰ型胶原多克隆抗体，质量浓度为200 mg/L，美国abcam公司)，37 ℃反应2 h，PBS(pH 7.4)洗5 min×3 次；⑥滴加二抗(美国abcam公司，500 μg， 1∶100稀释)，37 ℃反应30 min，PBS(pH 7.4)洗5 min× 3次；⑦滴加SABC，37 ℃反应30 min，PBS(pH 7.4)洗 5 min×4次；⑧滴加DAB试剂，室温下显色，显微镜下控制反应时间15 min；⑨蒸馏水洗涤；⑩苏木精复染，脱水、透明、封固，光学显微镜下观察。

1.5 主要观察指标 ①各组苏木精-伊红染色组织形态及病理变化；②各组微血管密度(microvessel density，MVD)计数(参照Weidner等^[15]提出的微血管密度计数方法)分析；③各组成纤维细胞计数分析(参照Flanders等^[16]提出的成纤维细胞计数方法)；④各组Ⅰ型胶原积分吸光度(intensive optical density，IOD)分析(采用 cellSens-Entry1.15 软件采集图像(tiff格式)，使用Image Pro-Plus 6.0图像分析软件分析处理所有图片并计算Ⅰ型胶原积分吸光度)。

1.6 统计学分析应用SPSS 20.0软件进行统计分析，数据均用x(_)±s表示。方差齐时，相同时间不同直径的同类针具间比较及同一针具不同时间点间比较均采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q法比较；方差不齐时，同一针具不同时间间比较均采用Brown-Forsythe法和Welch法进行近似方差分析，组间两两比较采用Dunnett’s T3和Dunnett’s C法比较，P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

新型针具种类不断增加，应用广泛，但其治疗机制尚不明确，其有创性操作是否造成局部肌组织损伤尚无相关研究报道。近几十年来，新型针具发展十分迅速，各种针

具不断涌现。同时，其临床应用范围也不断扩大，据文献报道^[17]，仅用小针刀治疗的疾病病种多达145种之多，涉及全身各大系统疾病。然而，以往有关新型针具的研究主要集中于临床疗效观察，有关其临床治疗机制的基础研究相当缺乏。文献研究表明，有关针刀的文献报道中临床研究占比多达94.5%，基础研究尚不足3.9%^[18-19]；其次，有关临床试验研究的方法学质量偏低，治疗某些疾病的有效性及安全性有待于更多高质量临床研究的论证。此外，使用新型针具实施局部软组织松解治疗作为一种有创性和侵入性治疗方式，其局部有创性松解治后局部组织的病理变化与转归如何？目前尚无有关组织形态与病理变化研究。因此，明确使用这些新型针具局部松解治疗后的病理变化过程及转归对于探讨其治疗机制及临床应用十分必要。实验分别选用3种不同直径的圆钝形针具和带刃针具开展动物实验研究，以明确使用这几种针具局部松解治疗后局部组织的病理变化过程与转归，为这些新型针具的临床使用提供病理形态依据的支持。

瘢痕是创面修复过程的一种自然产物，创面过度修复则导致病理性瘢痕形成。研究表明病理性瘢痕除涉及免疫反应外，还与过度炎性反应有关^[20-21]。实验结果显示，局部松解后第1周，松解局部组织出现大量炎性细胞(包括中性粒细胞、淋巴细胞及巨噬细胞等)浸润，炎性反应持续约1周左右，其中直径较大针具松解部位炎性反应较强；随后炎性细胞减少，成纤维细胞活化、向创区迁移并大量增殖。研究表明，骨骼肌损伤后，肌纤维膜受损，细胞内Ca²⁺外溢，导致局部Ca²⁺浓度升高，激活Ca²⁺依赖的蛋白酶，抑制正常线粒体呼吸，激活补体，募集炎症细胞^[22]。另研究表明，适度的炎症反应是有利于创伤的修复，炎细胞一方面吞噬清除坏死的细胞碎片，另一方面通过分泌生长因子激活肌卫星细胞，使其增殖形成新的肌管细胞进而发育成肌纤维^[23-25]。然而，过度炎症反应时高浓度的细胞溶解物和细胞毒素可进一步损伤肌肉和相邻未损伤的肌肉组织^[26]。另外，大量炎性细胞浸润及其产生的促炎因子(如白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α及白细胞介素6等)不仅可加重炎症反应，还可导致细胞外基质过度沉积及组织纤维化^[27]。上述研究表明，使用上述新型针具局部松解治疗时对局部组织可产生损伤效应。

成纤维细胞作为主要修复细胞，创伤后在一些因子的作用下，由创周向创面移位，并分泌细胞外基质，在某些细胞因子作用下，成纤维细胞过度增殖，导致细胞外基质异常沉积，则形成瘢痕组织^[28-29]。实验显示，局部松解后第2周，松解局部炎性细胞逐渐减少，成纤维细胞活化、向创面迁移并大量增殖，并伴有大量新生毛细血管形成，肉芽组织增生。实验结果表明，相同时间同类针具不同直径间比较，差异有显著性意义，直径较大者松解后成纤维细胞数目较多、微血管密度较大。研究表明，成纤维细胞是参与组织修复的主要功能细胞，成纤维细胞的活化是肉芽组织形成的关键^[30-31]。另有研究认为，成纤维细胞发生增殖、迁移，并合成、分泌胶原和细胞外基质成分，参与肉芽组织形成、创口收缩及组织重建的过程，其数量变化会对创伤愈合产生巨大影响^[32]。然而，近年来多数学者认为^[33-35]，成纤维细胞在增生性瘢痕的形成过程中至关重要，成纤维细胞异常增殖并大量合成胶原蛋白是增生性瘢痕形成的主要原因。上述表明，使用上述新型针具实施局部松解治疗具有一定的创伤性，可导致成纤维细胞活化、向创面迁移并大量增殖，分泌细胞外基质成分，参与肉芽组织形成。

瘢痕组织在组织水平上主要表现为成纤维细胞增殖，纤维连接蛋白、层连蛋白及胶原蛋白大量沉积。其中胶原蛋白以Ⅰ型和Ⅱ型胶原为主^[36]。实验显示，局部松解后第4周，苏木精-伊红染色，光学显微镜下可见松解局部肉芽组织机化，局部组织瘢痕化但尚未稳定；免疫组织化学染色可见，松解局部组织间隙沉积大量Ⅰ型胶原蛋白。研究表明，胶原具有良好的生物相容性和促进伤口愈合的能力，使胶原在伤口愈合中扮演重要角色^[37-38]，Ⅰ型胶原作为生物性支架载体在半月板、骨、皮肤、肌腱、血管等结缔组织修复中被广泛应用。然而，在严重的肌肉创伤中，成纤维细胞的大量增生将会导致局部组织过度纤维化，瘢痕组织的大量形成^[39]。研究发现，在骨骼肌损伤后修复过程中，早期肉芽组织中富含Ⅲ型胶原蛋白，而Ⅰ型胶原蛋白含量较少；后期疤痕组织中则以Ⅰ型胶原蛋白为主^[40]。同时，也有研究表明，Ⅰ型胶原蛋白的过度沉积是导致骨骼肌瘢痕形成的主要原因^[41-43]。上述研究表明，使用上述新型针具局部实施松解治疗可造成松解局部肌组织损伤且最终瘢痕化修复。因此，在临床使用这些新型针具治疗时，应避免使用直径较大针具同一部位反复实施松解治疗，以免造成松解局部过度组织纤维化。

实验的局限性：①同一类型针具纳入较少，尚未对针具类型、直径的安全范围作出界定；②观察时间相对较短，损伤后局部组织修复尚未稳定。进一步研究应纳入同类型多种针具，长时间观察，以便界定针具规格的安全范围。

综上所述，使用这些新型针具局部松解治疗具有一定的创伤性，这些针具松解干预后，局部组织未完全修复而产生瘢痕。因此，在临床治疗时，应避免使用直径较大的针具同一部位反复松解治疗，以免造成局部组织持续性炎性反应、成纤维细胞持续活化、增殖及细胞外基质过度分泌，从而导致局部组织瘢痕化修复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

几种常用针具局部松解部位骨骼肌的损伤和修复过程及病理变化

Pathological changes of the skeletal muscle after local loosening therapies

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