制低钾右旋糖苷改良液用于保存犬肺移植离体肺的最长时间

doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.53.001

摘要/Abstract

摘要：

背景：低钾右旋糖苷液用于肺移植，灌注保存效果较好，但有效供肺保存时间仍较短，价格较昂贵。
目的：观察改良自制低钾右旋糖苷液保存供肺不同时间供肺变化，评价改良自制低钾右旋糖苷液的供肺保存期限。
方法：成年家犬32只，随机分成对照、实验两组。对照组采用低钾右旋糖苷液作为供肺灌注保存液，实验组采用改良自制低钾右旋糖苷液。比较两组供肺组织灌注前、灌注后、保存4，8，12，24 h的髓过氧化物酶、丙二醛、湿干比、病理光镜检查、透射电镜检查结果。
结果与结论：两组离体肺组织的髓过氧化物酶、丙二醛和湿干比值随着保存时间的延长呈渐增趋势，髓过氧化物酶值在保存12 h以后与灌注前有显著差异，丙二醛和湿干比值保存8 h后与灌注前有显著差异。保存8 h后，实验组肺组织结构和超微结构的变化仍然可逆，较对照组变轻，但保存4，12，及24 h两组变化基本相似。结果提示，在实验条件下，供肺在改良自制低钾右旋糖苷液中保存8 h后开始出现显著变化，保存12 h后开始出现不可逆变化。

关键词: 低钾右旋糖苷液, 改良, 肺保存, 髓过氧化物酶, 丙二醛, 湿干比, 肺移植

Abstract:

BACKGROUND: Clinical application of low potassium dextran (LPD) solution has better effectiveness, but effective period of donor lung preservation is still short and price is expensive.
OBJECTIVE: To observe changes of lung preservation after different periods preserved with modified self-confected LPD solution and to evaluate the storage term of lung in this solution.
METHODS: In total 32 healthy dogs were randomly divided into the control group and experimental group. Dogs in the control group were perfused with LPD solution; and those in the experimental group were perfused with modified self-confected LPD solution. Changes of myeloperoxidase, malonaldehyde, wet to dry weight ratio (W/D), pathological result and super-micro structural results from donor lung tissues were compared at pre-perfusion, after perfusion, and 4-, 8-, 12-, as well as 24-hours of preservation.
RESULTS AND CONCLUSION: For both groups: the values of myeloperoxidase, malonaldehyde and W/D were increasing as lung preservative period in vivo was prolonging; after 12-hour preservation, the value of myeloperoxidase was significant changed while the value of malonaldehyde and W/D were changed significantly after 8-hour preservation; the pathological and super-micro structural changes were reversible till lung preservative period reached 8-hour. Changes of lung preservation started to be significant after 8-hour preserved with modified self-confected LPD solution and irreversible historical changes appeared after 12-hour preservation.

中图分类号:

R617

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参考文献

引言

材料方法

讨论

3.1 改良自制LPD液的特点 LPD液模拟细胞外液成分配制而成，含有低浓度K⁺和高浓度Na⁺，同时含有低分子右旋糖苷40。低钾能够避免高钾对内皮细胞的损伤，从而减少内皮细胞生成和释放炎症递质^[6] ；而右旋糖苷40作为高渗基质的作用包括：①提高胶体渗透压。②改善微循环，保护内皮-上皮屏障，阻止无复流现象发生。③减少供肺脂质过氧化的发生，保护肺表面活性物质的活力。④可能作为氧自由基清除剂。⑤促进肺成纤维细胞的蛋白合成等^[3] 。
3.2 不同灌注保存液的比较 供肺灌注保存液主要分为细胞内液型和细胞外液型。总体上，认为无论在移植肺功能，炎症反应，肺损伤，肺水肿以及减少原发性移植物失功等方面，细胞外液型灌注保存液供肺保存效果明显好于细胞内液型灌注保存液的学者占多数^[7-8] ；而在细胞外液型灌注保存液中，又以LPD液的灌注保存效果较好^{[5, 7]} 。
进一步改善LPD液灌注保存效果的改良研究已经开展^[9] 。所谓改良目前包括：LPD液添加葡萄糖以降低低温保存肺中的有氧代谢^[10] ，以及添加一氧化氮供体如三硝酸盐等^[11] 。国外动物实验添加新型弹性蛋白酶抑制剂^[12] 、国内临床尝试使用添加棉子糖的改良LPD液^[13] ，也取得较好的效果。
3.3 LPD液的配制 正是基于前述国际上对于LPD液供肺灌注保存效果的多数认可，以及因不满足LPD液目前灌注保存效果而进行进一步改良的趋势，作者选用LPD液作为配制及改良肺移植灌注保存液研究的原型及对照标准。
实验结合LPD液的配方，经过反复试验，自行配置了LPD液。初期配制时在渗透压及pH值方面与LPD液差距较大，通过调整配方内含Na⁺成分的剂量，并以添加碳酸氢钠的方式在基本维持电解质浓度的情况下，使pH值接近LPD液水平。同样为了接近LPD液的渗透压，本实验增加了原配方没有的甘露醇，而其他研究也证实，甘露醇不仅可调节渗透压，也可以减轻细胞间隙水肿，具有抗缺血再灌注损伤作用^[14] 。
最终配制结果虽然成分和理化特性与LPD液仍有一定差距，但已经非常接近，成为进一步研究的基础。
3.4 自制LPD液的改良 为了完善自制LPD液肺保存效果，依据肺移植肺损伤的机制及肺损伤保护原则，本实验进一步提出自制LPD液的改良方案。
肺灌注保存及再灌注损伤的机制和肺保护原则：普遍认为再灌注后氧自由基的生成、钙超载、内皮功能不良与激活的中性粒细胞之间的相互作用参与了缺血再灌注损伤^[15-16] 。
初期移植肺功能障碍的主要原因是缺血再灌注损伤，而供体肺灌注保存期间的低温、缺血、缺氧激活残留的中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞产生炎性细胞因子、氧自由基等有害物质，还引起三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)耗竭、乳酸增加，细胞内钙超载^[17-18] 。因而肺灌注保存直接导致的肺损伤同样不容忽视。
根据肺移植缺血再灌注损伤损伤及供肺灌注保存肺损伤的机制，肺移植肺损伤保护主要包括4个方面：①抑制中性粒细胞聚集和激活。②清除氧自由基。③血管内皮细胞损伤的保护，而内皮细胞的保护包括：环磷酸腺苷的补给：通过肺灌注液中添加前列腺素完成；保护性一氧化氮的补充肺灌注液中添加硝酸甘油和硝酸盐阴离子(一氧化氮供体)增加保护性一氧化氮产生或添加L-精氨酸(一氧化氮前体)增加保护性一氧化氮合成。④肺上皮细胞损伤的保护，主要通过给与外源性肺表面活性物质完成^[19] 。
自制LPD液的进一步改良方案：针对肺移植肺损伤的机制及保护原则，特别是内皮细胞保护的重要性；国内外在LPD液中加入前列腺素E1，保护性一氧化氮供体或前体等以提高LPD液肺保存效果的成功改良方案以及国内临床使用的便捷性和经济性^[20] ，作者对自行配置的LPD液提出进一步改良方案：增加原LPD液配方中没有的前列腺素E1和硝酸甘油。
这两种新添加剂的具体作用如下：①前列腺素E1的作用：前列腺素E1具有选择性扩张肺血管作用，通过对抗低温引起的肺血管反射性收缩和气道痉挛达到迅速降温和充分灌洗供肺的目的；同时前列腺素E1具有抗炎特性，能抑制中性粒细胞黏附，血小板聚集及溶酶体酶的释放，改善血管通透性；另外，前列腺素E1还可有效地抑制K+介导的血管收缩^[15] 。本组试验中，自制LPD液添加前列腺素E1后，在灌注液成分仍有差距的前提下，供肺保存效果能与LPD液基本相似，前列腺素E1的供肺保护作用得到进一步证实。②一氧化氮的作用：通过系统研究，保护性一氧化氮减轻肺缺血再灌注损伤的机制包括^[21] ：一氧化氮能对抗内皮素、儿茶酚胺以及缺氧等引起的肺血管收缩，降低PVR；调节血管张力和维持通气/血流平衡，既舒张肺血管，也舒张支气管平滑肌；抑制血细胞与内皮细胞黏附，减少氧自由基的产生；具有保持血管内皮通透性的特性；具有非特异性广谱抗微生物活性。
增加保护性一氧化氮的方法主要集中在两个方面：一是一氧化氮直接吸入，其作用仅局限于肺，对体循环无影响^[22]，但是临床使用不便，需要特殊设计机械呼吸装置并可监测气体浓度，导致临床上难以推广^[23]。另一方面是在灌注保存液中增加一氧化氮的供体或前体，但是受到一氧化氮合酶的限制，效果难以持久，且对体循环有一定影响^[24] 。虽然有上述问题，但是一氧化氮的供体或前体如硝酸甘油、L-精氨酸加入灌注保存液改善保存效果仍得到证实^[25] 。特别是由于吸入一氧化氮在目前国内供体获取时开展可能性很小，为了研究的实用性，作者选择临床上较常使用的硝酸甘油作为一氧化氮供体加入自制LPD液进行改良。
在本组研究中，自制LPD液中加入硝酸甘油用于供肺灌注保存，通过增加保护性一氧化氮生成使得改良自制LPD液肺保护效果与LPD液无明显差异，保护性一氧化氮的肺保护作用得到进一步证实。
3.5 改良自制LPD液离体肺保存时间的观察及与LPD液的比较 供肺保存时间是评价肺保存方案乃至灌注保存液保存效果的重要指标之一^[1] 。目前临床应用的肺保存技术所提供的保存期限为4~6 h^[26] ，短于其他实质脏器的保存时间，也成为肺移植发展的制约因素^[27] 。针对延长有效肺保存时间以改善肺保存效果的研究很多，如在LPD液中添加维生素E、维生素C和尿激酶进行改良，在双肺移植实验中，供肺保存达到18 h后移植仍功能良好^[28] ；也有在LPD液中加入氨基乙酸及经氨基乙酸静脉预处理，供肺保存24 h后移植功能良好的报道^[29] 。最近，国内研究证实，在LPD液中加入棉子糖，不但能明显减轻缺血末期组织损伤和保持细胞完整性，提高再灌注后移植肺功能，而且可以将肺保存时间明显延长至12 h^[30] ，其结果也得到了临床验证^[13] 。
实验观察了两组离体肺保存不同时间的参数变化。无论对照组还是实验组，MPO、丙二醛和W/D等指标均随着保存时间的延长呈渐增趋势，但是在灌注后及保存4 h和灌注前相比，差异无显著性意义(P > 0.05)。保存8 h后，两组的丙二醛和W/D出现显著变化(P < 0.05)，而MPO在保存12 h后出现显著变化(P < 0.05)。两组肺组织结构和超微结构的改变随着保存时间的延长，也有逐步加重的趋势：在保存4 h后变化仍不明显；到保存8 h后已经出现明显改变，但仍未出现严重不可逆的改变；而保存12 h后肺泡结构出现一些不可逆的组织学改变，如肺泡上皮脱落、线粒体嵴断裂等；保存24 h后不可逆改变已经非常明显：肺泡融合、红细胞外渗、气血屏障破坏等，此时肺组织肯定不能再用于移植。虽然目前国内外研究尚无关于供肺出现严重不可逆损伤而无法移植的MPO、丙二醛及W/D确切值的报道，但是作者认为测定值与灌注前相应值对照出现显著差异，可说明此时供肺损伤已达到一定程度，可能影响移植后受体肺功能和生存，故应尽量避免应用保存时间过长而某参数已出现显著变化的供肺进行移植。作为评价供肺功能重要指标的供肺结构及超微结构的改变，存在上述公认的不可逆改变表现^[30]，而在供肺保存时间上则应尽量短于不可逆改变出现的时限。
改良自制LPD液在本实验条件下保存供肺4 h供肺组织结构及超微结构变化不明显，保存供肺8 h后出现明显改变但尚未出现不可逆改变，保存12 h后出现不可逆改变；MPO、丙二醛和W/D与灌注前相比的显著变化出现在保存8 h甚至12 h后。作者认为改良自制LPD液在本实验条件下保存供肺4 h后移植应该是安全的，而安全保存时间期限可能达到8 h，需要进一步实验，特别是活体功能实验加以证实。
对于LPD液保存的供肺在保存8 h后，肺组织结构及超微结构也未出现不可逆改变，且MPO，丙二醛及W/D的显著变化也出现在保存8 h甚至12 h后，作者认为与本实验条件采用23 ℃灌注、10 ℃保存的灌注保存温度和供肺获取时50%的吸入氧浓度有关，有研究证实与传统的4 ℃灌注保存和供肺获取时的空气吸入相比^[31-32] ，前者供肺灌注保存效果更好。因而作者推测，LPD液在本实验条件下的安全肺保存期限可能超过传统的4~6 h而达到8 h，当然进一步系统的比较研究是必需的。

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