N-乙酰半胱氨酸对烟熏模型大鼠肺组织氧化应激的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1877

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (2): 254-259.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1877

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N-乙酰半胱氨酸对烟熏模型大鼠肺组织氧化应激的影响

李响¹，王玮²，夏书月¹，何巍¹

¹沈阳医学院附属中心医院呼吸与危重症学科，辽宁省沈阳市 110024；²中国医科大学附属第一医院呼吸与危重症学科，辽宁省沈阳市 110001

收稿日期:2019-05-17 修回日期:2019-06-11 接受日期:2019-07-20 出版日期:2020-01-18 发布日期:2019-12-25
通讯作者: 李响，沈阳医学院附属中心医院呼吸与危重症学科，辽宁省沈阳市 110024
作者简介:李响，女，1984年生，吉林省人，汉族， 2016年中国医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事呼吸系统疾病的基础与临床研究。
基金资助:
沈阳医学院科技基金项目(20182032)；沈阳市卫生和计划生育委员会委科研课题计划项目(2017年)；国家重点研发计划重大慢性非传染性疾病防控研究重点专项 (2016YFC1304502)

Effects of N-acetylcysteine on oxidative stress in lung tissue of smoked rats

Li Xiang¹, Wang Wei², Xia Shuyue¹, He Wei¹

¹Intensive Care Unit of Respiratory, Affiliated Central Hospital of Shenyang Medical College, Shenyang 110024, Liaoning Province, China; ²Intensive Care Unit of Respiratory, the First Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China

Received:2019-05-17 Revised:2019-06-11 Accepted:2019-07-20 Online:2020-01-18 Published:2019-12-25
Contact: Li Xiang, Intensive Care Unit of Respiratory, Affiliated Central Hospital of Shenyang Medical College, Shenyang 110024, Liaoning Province, China
About author:通讯作者：李响，沈阳医学院附属中心医院呼吸与危重症学科，辽宁省沈阳市 110024
Supported by:
the Science and Technology Foundation of Shenyang Medical College, No. 20182032; the Research Project of Health and Family Planning Commission of Shenyang in 2017; the National Key Research and Development Program on Prevention and Control of Major Chronic Non-Communicable Diseases, No. 2016YFC1304502

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

吸烟与慢性阻塞性肺疾病：慢性阻塞性肺疾病最重要的危险因素是吸烟。被动吸烟和生物质燃料使用等其他暴露也发挥作用。吸烟量和持续时间是疾病严重程度的促成因素。大多数(约80%)慢性阻塞性肺疾病患者都有吸烟史。吸烟到一定程度时，几乎所有吸烟者都可检测出肺功能下降。

N-乙酰半胱氨酸：是细胞维持正常生理功能的重要化合物谷胱甘肽的前体，而谷胱甘肽是细胞内重要的非酶类抗氧化物，能灭活活性氧，稳定细胞内膜结构，稳定细胞内的酶和蛋白质的功能，因此N-乙酰半胱氨酸能通过补充细胞内谷胱甘肽水平来增强抗氧化作用。

背景：N-乙酰半胱氨酸是谷胱甘肽的前体，可以直接清除氧自由基。然而，N-乙酰半胱氨酸是否通过降低氧化应激反应，减轻吸烟导致的肺损伤尚不完全清楚。

目的：探讨N-乙酰半胱氨酸对烟熏大鼠肺组织氧化应激的影响，并阐明其可能的作用机制。

方法：将30只雄性大鼠随机分为对照组、烟熏组、烟熏+N-乙酰半胱氨酸组。将烟熏组和烟熏+N-乙酰半胱氨酸组大鼠置于被动吸烟动物染毒系统，每次暴露20支香烟的烟雾中，2次/d，1 h/次，持续8周。N-乙酰半胱氨酸组大鼠每天被动烟熏前给予N-乙酰半胱氨酸200 mg/kg灌胃，持续8周。正常对照组大鼠仅单纯放置在染毒系统内，正常饲养8周。实验方案由沈阳医学院实验动物伦理委员会于2018年10月批准，批准号：研伦审第(2018)85号。

结果与结论：①病理观察发现烟熏组大鼠肺组织排列紊乱、肺泡间隔增厚、炎症细胞浸润和间质纤维化，而烟熏+N-乙酰半胱氨酸组肺组织出血、间质内炎症细胞数量显著减少、纤维化程度减轻；②与对照组相比，烟熏组大鼠肺组织丙二醛5和肌醇酶α基因表达升高，超氧化物歧化酶1基因表达显著降低，而N-乙酰半胱氨酸可抑制上述变化；③免疫荧光和Western blot结果均发现烟熏+N-乙酰半胱氨酸组大鼠肺组织丙二醛5和肌醇酶α蛋白表达较烟熏组显著降低，超氧化物歧化酶1蛋白表达较烟熏组升高。此外，烟熏+N-乙酰半胱氨酸组核因子E2相关因子和Keap1蛋白表达明显升高，Bach1蛋白表达显著降低；④结果表明，N-乙酰半胱氨酸通过降低氧化应激对烟熏导致的肺损伤发挥保护作用，其作用机制可能通过激活核因子E2相关因子/Keap1信号通路实现。

ORCID: 0000-0002-6428-8715(李响)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 烟熏, N-乙酰半胱氨酸, 同型半胱氨酸, 氧化应激, 核因子E2相关因子/Keap1信号通路, 肺损伤, 丙二醛5, 肌醇酶α

Abstract:

BACKGROUND: N-Acetyl-L-cysteine is a precursor of glutathione, which can directly scavenge oxygen free radicals. However, it is not entirely clear whether N-acetyl-L-cysteine can alleviate smoking-induced lung injury by reducing oxidative stress.

OBJECTIVE: To investigate the effects of N-acetylcysteine on oxidative stress in lung tissue of smoked rats, and to clarify its possible mechanism of action.

METHODS: Thirty male rats were randomly divided into control, smoked and smoked+N-acetylcysteine groups. The rats in the smoked and smoked+N-acetylcysteine groups were placed in the passive smoking animal exposure system, with smoking of 20 cigarettes, twice/d, 1 hour/times, for 8 consecutive weeks. The rats in the smoked+N-acetylcysteine group were given 200 mg/kg N-acetylcysteine via gavage before passive smoking daily, for 8 consecutive weeks. The control rats were fed normally for 8 consecutive weeks. The study was approved by the Laboratory Animal Ethical Committee of Shenyang Medical College in October 2018, approval No. (2018)85.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Pathological observation showed that the pulmonary tissue was disordered, alveolar septal thickening, inflammatory cell infiltration and interstitial fibrosis in the smoking group, while the pulmonary hemorrhage, the number of inflammatory cells and the degree of fibrosis in the smoking+N-acetylcysteine group were significantly reduced. (2) Compared with the control group, the expression levels of malondialdehyde-5 and inositol-alpha genes were significantly increased, and superoxide dismutase-1 gene expression was significantly decreased in the smoked group, while N-acetylcysteine could inhibit the above changes. (3) Immunofluorescence staining and western blot assay results revealed that the expression levels of malondialdehyde-5 and inositol-alpha in lung tissue of rats in the smoked+N-acetylcysteine group was significantly lower than those in the smoked group, and the expression level of superoxide dismutase-1 was significantly higher than that in the smoked group. In addition, the expression levels of Nrf2 and Keap1 mRNA and protein were significantly increased, and the expression levels of Bach1 mRNA and protein were significantly decreased in the smoking+N-acetylcysteine group. (4) These results suggest that N-acetylcysteine can protect smoking-induced lung injury by reducing oxidative stress, and which might be through activating Nrf2/Keap1 signaling pathway.

Key words: smoked, N-acetylcysteine, homocysteine, oxidative stress, Nrf2/Keap1 signaling pathway, lung injury, malondialdehyde-5, inositol-alpha

中图分类号:

R453.9

TS41+3

R563

李响, 王玮, 夏书月, 何巍. N-乙酰半胱氨酸对烟熏模型大鼠肺组织氧化应激的影响[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(2): 254-259.

Li Xiang, Wang Wei, Xia Shuyue, He Wei. Effects of N-acetylcysteine on oxidative stress in lung tissue of smoked rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(2): 254-259.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析 30只大鼠随机分为对照组、烟熏组、烟熏+N-乙酰半胱氨酸组，各10只。实验过程中，没有动物死亡。

2.2 N-乙酰半胱氨酸对烟熏大鼠肺组织病理的影响苏木精-伊红染色结果发现，对照组大鼠肺组织排列较规则、未见明显的炎性细胞浸润、出血和坏死；烟熏组大鼠肺组织排列紊乱、肺泡间隔增厚，可见坏死、炎症细胞浸润和间质纤维化。而烟熏+N-乙酰半胱氨酸组肺组织出血、坏死明显缓解，间质内炎症细胞数量显著减少，纤维化程度减轻，见图1。

2.3 N-乙酰半胱氨酸对烟熏大鼠肺组织氧化应激基因表达的影响实时PCR结果发现，与对照组相比，烟熏组大鼠肺组织中丙二醛5和肌醇酶α基因表达水平显著升高(P < 0.05)，超氧化物歧化酶1基因表达水平显著降低(P < 0.05)；而与烟熏组相比，烟熏+N-乙酰半胱氨酸组大鼠肺组织中丙二醛5和肌醇酶α基因表达显著降低(P < 0.05)，超氧化物歧化酶1基因表达显著升高(P < 0.05)，见表1。

2.4 N-乙酰半胱氨酸对烟熏大鼠肺组织中氧化应激相关蛋白的影响

2.4.1 免疫荧光染色与对照组相比，烟熏组大鼠肺组织中丙二醛5和肌醇酶α阳性表达显著升高，超氧化物歧化酶1阳性表达显著降低；与烟熏组相比，烟熏+N-乙酰半胱氨酸组大鼠肺组织中丙二醛5和肌醇酶α阳性表达显著降低(P < 0.05)，超氧化物歧化酶1蛋白表达显著升高，见图2。

2.4.2 Western blot分析与对照组相比，烟熏组大鼠肺组织丙二醛5和肌醇酶α蛋白表达显著升高，超氧化物歧化酶1蛋白表达显著降低(P < 0.05)，而烟熏+N-乙酰半胱氨酸组丙二醛5和肌醇酶α蛋白表达显著降低，超氧化物歧化酶1蛋白表达显著升高(P < 0.05)，见图3。

2.5 N-乙酰半胱氨酸对烟熏大鼠肺组织中核因子E2相关因子/Keap1通路mRNA及蛋白表达的影响核因子E2相关因子/Keap1信号通路对于调节细胞氧化应激的防御机制具有非常重要的作用。

2.5.1 mRNA表达为了阐明N-乙酰半胱氨酸对烟熏导致肺损伤的作用机制，研究通过实时PCR检测了核因子E2相关因子/Keap1信号通路核因子E2相关因子、Keap1和Bach1 mRNA表达变化。结果发现，与对照组相比，烟熏组大鼠肺组织核因子E2相关因子和Keap1 mRNA表达显著降低，Bach1 mRNA表达增加(P < 0.05)，而烟熏+N-乙酰半胱氨酸组核因子E2相关因子和Keap1 mRNA表达明显升高，Bach1 mRNA表达显著降低(P < 0.05)，见表2。

2.5.2 蛋白表达以Western blot技术检测到核因子E2相关因子/Keap1途径相关因子核因子E2相关因子、Keap1和Bach1蛋白表达变化。结果发现，与对照组相比，烟熏组大鼠肺组织核因子E2相关因子和Keap1蛋白表达显著降低，Bach1蛋白表达增加(P < 0.05)，而烟熏+N-乙酰半胱氨酸组核因子E2相关因子和Keap1蛋白表达显著升高，Bach1蛋白表达显著降低(P < 0.05)。结果表明，N-乙酰半胱氨酸可能通过激活核因子E2相关因子/Keap1信号通路对烟熏导致的肺损伤发挥保护作用，见图4。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2018年9至12月在沈阳医学院附属中心医院完成。

1.3 材料

实验动物：SPF级雄性Wistar大鼠30只，鼠龄6周，购自本溪长生实验动物有限公司，动物许可证号：SYXK(辽)2018-003)，饲养于沈阳医学院附属中心医院标准动物房内。实验方案由沈阳医学院实验动物伦理委员会于2018年10月批准，批准号：研伦审第(2018)85号。

实验用主要试剂及仪器：黄果树牌香烟 (焦油16 mg/支，烟气烟碱 1.2 mg/支)购自贵州中烟工业有限责任公司；N-乙酰半胱氨酸泡腾片(许可证号：国药准字H20057334)购自浙江金华康恩贝生物制药有限公司；超氧化物歧化酶1、肌醇酶1α、丙二醛5、核因子E2相关因子、KelCh样ECH相关蛋白(KelCh-like ECH-related proteins，Keap1)和Bach1抗体购自英国Abcam公司；蛋白提取试剂盒购自美国Santa公司；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和基因检测试剂盒购自美国Santa公司；被动吸烟动物染毒系统(型号PABS200)购自北京贝兰博科技有限公司；OLYMPUS奥林巴斯显微镜(型号BX53)购自上海赖氏电子科技有限公司；imark酶标仪购自美国伯乐公司。

1.4 方法

1.4.1 烟熏模型的建立以及N-乙酰半胱氨酸干预

烟熏+N-乙酰半胱氨酸组大鼠每天被动烟熏前给予N-乙酰半胱氨酸200 mg/kg灌胃，持续8周。正常对照组大鼠仅单纯放置在染毒系统内，正常饲养8周。

1.4.2 取材干预8周后，水合氯醛麻醉，经腹主动脉采血后处死动物，打开胸腔，取出肺组织。将部分肺组织放入体积分数10%甲醛固定用于病理组织学检测，剩余肺组织放入-80 ℃保存，用于基因和蛋白检测。

1.4.3 病理组织学检测将石蜡包埋组织进行常规脱水、包埋、切片、苏木精-伊红染色观察肺组织病理改变；采用免疫荧光染色观察丙二醛5、肌醇酶α和超氧化物歧化酶1蛋白表达变化。肺组织石蜡切片分别经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水、体积分数0.1%Triton X-100处理30 min后，PBS洗涤3次，每次5 min。用体积分数5%胎牛血清白蛋白和10%山羊血清封闭30 min后添加一抗放置4 ℃冰箱内孵育过夜，荧光二抗染色。荧光显微镜观察。

1.4.4 实时定量实时PCR分析将5 mg新鲜肺组织充分研磨后，按照试剂盒说明书提取组织RNA，将提取的RNA进行定量后反转录为cDNA。采用SYBR Green实时荧光定量PCR技术，以GAPDH为内参，对超氧化物歧化酶1、丙二醛5、肌醇酶α、核因子E2相关因子、Keap1和Bach1进行扩增并分析，计算基因相对表达水平，实验重复3次，取平均值进行分析。引物序列：丙二醛5：F 5'-AGT GTC TCC ACT TGC TGA CC-3'，R 5'-CAG CAG CTC TCT TAC ACC TGA-3'；肌醇酶a：F5’-AGC ACA GTT ACA CTG CCT GAG-3'，R 5'-CTT CCA CGT GTG TTG GGA CCT-3'；超氧化物歧化酶1：F 5'-GAG CAT TCC ATC ATT GGC CG-3'，R 5'-GGC AAT CCC AAT CAC ACC AC-3'；核因子E2相关因子：F5'-TAG TGC CCC TGG AAG TGT CA-3'，R 5'-TTG GGA TTC ACG CAT AGG AG-3'；Keap1：F 5'-CCT TCA GCT ACA CCC TGG AG-3'，R 5'-AAC ATG GCC TTG AAG ACA GG-3'；Bach1：F 5'-AAG CTG TTC AAG CAA TTT GG-3'，R 5'-CTG ATT CAA GAT TCT GTA TAC AGT CAA-3'；GAPDH：F 5'-ATG GCC TTC CGT GTT CCT AC-3'，R 5'-GCC TGC TTC ACC ACC TTC TT-3'。反转录总体系为10 μL，使用条件37 ℃，15 min反转录反应，85 ℃，15 s失活，4 ℃保持，条件为快速反转录反应。

1.4.5 Western blot分析将5 mg新鲜肺组织充分匀浆，加入蛋白裂解液，12 000 r/min，离心5 min，吸取上清液，酶标仪制作标准曲线，用Bio-Rad蛋白测定法测定蛋白质浓度，体积分数10%聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白，转移到硝酸纤维素膜上进行Western blot分析。

1.5 主要观察指标肺组织中氧化应激相关蛋白的基因和蛋白的表达情况。

1.6 统计学分析采用SPSS 20.0统计学软件(美国IBM公司)对数据进行分析。计量资料用x(_)±s表示，数据采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

香烟烟雾中存在大量氧自由基和过氧化氢等有害物质，吸烟通过氧化应激诱导肺组织损伤^[9]，同时吸烟可以刺激炎症细胞产生，破坏氧化/抗氧化系统平衡^[10]。N-乙酰半胱氨酸是肺内重要的抗氧化物谷胱甘肽的前体，N-乙酰半胱氨酸治疗可迅速提高体内谷胱甘肽水平，抑制内源性氧化物生成^[11-13]。N-乙酰半胱氨酸作用机制多种多样，当通过吸入途径给N-乙酰半胱氨酸时，它对硫芥导致猪肺损伤有治疗作用^[14]。此次实验发现，烟熏可导致大鼠氧化应激-抗氧化应激表达失衡，导致肺组织损伤。而N-乙酰半胱氨酸通过降低氧化应激对烟熏导致的肺损伤发挥保护作用，其作用机制可能通过激活核因子E2相关因子/Keap1信号通路实现。

研究发现，口服N-乙酰半胱氨酸在肝脏中迅速且几乎完全吸收并代谢为半胱氨酸、二乙酰半胱氨酸和进一步混合的二硫化物^[15-16]。作者发现烟熏可导致大鼠肺组织氧化应激相关基因和蛋白水平失衡，而N-乙酰半胱氨酸处理则可缓解由烟熏导致的氧化应激反应。在氧化应激动物模型中，抗氧化剂在减轻肺损伤和保护心脏、肾脏和肝脏等其他器官免受损害方面被发现是有效的^[17-27]。N-乙酰半胱氨酸具有直接和间接的抗氧化性能，它的直接作用是由于自由硫醇基与清除活性氧的相互作用，而间接抗氧化作用与其作为谷胱甘肽前体的作用有关，导致细胞内谷胱甘肽浓度升高^[28]。研究表明，N-乙酰半胱氨酸处理通过减少细胞H₂O₂释放，减少嗜酸性粒细胞数量，降低白细胞黏附，修复烟熏导致的肺组织损伤^[29]。另外，研究表明大剂量N-乙酰半胱氨酸对慢性阻塞性肺疾病和慢性阻塞性肺疾病加重患者有明显的临床疗效，它可以显著改善慢性阻塞性肺疾病的氧化应激和炎症反应^[30]，大剂量N-乙酰半胱氨酸治疗对H1N1流感肺炎患者也有较好的临床效果^[31]。研究发现，HMGB1和RAGE参与高氧性肺损伤的发病机制，而吸入N-乙酰半胱氨酸可通过调节HMGB1和RAGE蛋白的表达减轻高氧性肺损伤^[32]。此外，sirt1通过调节foxo3a的表达对PM2.5诱导的呼吸氧化损伤具有保护作用，N-乙酰半胱氨酸可以激活sirt1并在PM2.5诱导的氧化损伤中发挥抗氧化作用^[33]。

众所周知，抗氧化途径参与细胞的氧化还原平衡过程，其中核因子E2相关因子2/Keap1信号途径发挥作用最为显著^[34]。研究表明，在健康细胞中，Keap1结合核因子E2相关因子，并以核因子E2相关因子为靶点，被蛋白酶体泛素化和降解。随后，为了应对氧化应激的增加，对Keap1上的半胱氨酸硫醇进行修饰，使核因子E2相关因子从Keap1释放并激活靶基因的转录^[35]。此外，核因子E2相关因子/ Keap1通路经常在人肺癌中被破坏^[36]。作者发现N-乙酰半胱氨酸处理可以显著提高核因子E2相关因子/Keap1 mRNA和蛋白表达，降低Bach1 mRNA和蛋白表达。与此次实验结果类似的是，ZHANG等^[37]发现核因子E2相关因子/ Keap1信号通路与支气管炎应激有关，而应用黄芪甲苷联合布地奈德治疗可上调核因子E2相关因子/Keap1蛋白表达和下调Bach1蛋白表达，结果提示核因子E2相关因子/ Keap1蛋白通路调控支气管炎的氧化反应。因此，结果表明，N-乙酰半胱氨酸通过降低氧化应激对烟熏导致的肺损伤发挥保护作用，其作用机制可能通过激活核因子E2相关因子/Keap1信号通路实现。此次实验的局限性在于仅阐明N-乙酰半胱氨酸通过核因子E2相关因子/Keap1信号通路降低氧化应激过程，缓解烟熏导致的肺损伤，缺乏对其下游蛋白进行阻断或激活研究。总之，烟熏可以导致肺组织损伤，而N-乙酰半胱氨酸治疗对烟熏诱发的大鼠肺组织损伤有保护作用，可能通过核因子E2相关因子/Keap1信号通路降低氧化应激损伤，N-乙酰半胱氨酸治疗可能成为一种吸烟导致肺损伤的一种潜在的治疗方法。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

N-乙酰半胱氨酸对烟熏模型大鼠肺组织氧化应激的影响

Effects of N-acetylcysteine on oxidative stress in lung tissue of smoked rats

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