表没食子儿茶素没食子酸酯可减轻大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤

doi:10.12307/2021.112

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (26): 4145-4149.doi: 10.12307/2021.112

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表没食子儿茶素没食子酸酯可减轻大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤

薛庆，童梁成，杨智伟，汪剑龄，赵磊，周胜，彭赛，李颖

解放军东部战区空军医院骨科，江苏省南京市 210002

收稿日期:2020-07-06 修回日期:2020-07-09 接受日期:2020-08-29 出版日期:2021-09-18 发布日期:2021-04-28
通讯作者: 李颖，博士，副主任医师，解放军东部战区空军医院骨科，江苏省南京市 210002
作者简介:薛庆，男，1989年生，安徽省宿州市人，汉族，2017年徐州医科大学毕业，硕士，医师，主要从事骨创伤研究。

Epigallocatechin gallate alleviates skeletal muscle ischemia-reperfusion injury in rats

Xue Qing, Tong Liangcheng, Yang Zhiwei, Wang Jianling, Zhao Lei, Zhou Sheng, Peng Sai, Li Ying

Department of Orthopedics, Air Force Hospital of Eastern Theater Command, Nanjing 210002, Jiangsu Province, China

Received:2020-07-06 Revised:2020-07-09 Accepted:2020-08-29 Online:2021-09-18 Published:2021-04-28
Contact: Li Ying, MD, Associate chief physician, Department of Orthopedics, Air Force Hospital of Eastern Theater Command, Nanjing 210002, Jiangsu Province, China
About author:Xue Qing, Master, Physician, Department of Orthopedics, Air Force Hospital of Eastern Theater Command, Nanjing 210002, Jiangsu Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
缺血再灌注损伤：缺血后再灌注可使组织器官结构、功能得到恢复，患者病情好转康复，但有时缺血后再灌注不仅不能使组织器官功能恢复，反而加重组织器官的功能障碍和结构损伤。这种在缺血基础上恢复血流后组织损伤反而加重，甚至发生不可逆性损伤的现象称为缺血再灌注损伤。
细胞凋亡：为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及在四肢再植术中调控等作用，它并不是病理条件下自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。

背景：既往研究表明，骨骼肌缺血再灌注损伤在四肢再植术中是一个常见而且严重的临床问题，严重影响再植肢体术后存活率及功能。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)具有较强抗氧化性、抗炎及抑制细胞凋亡的作用。
目的：探讨EGCG在大鼠下肢骨骼肌缺血再灌注损伤中的作用。
方法：将雄性SD大鼠30只随机分为5组：假手术组、缺血再灌注组、EGCG组(10，100，200 mg/kg)，除假手术组外，其他4组建立下肢缺血再灌注损伤模型，EGCG组在再灌注前30 min按照体质量腹腔注射EGCG。缺血4 h再灌注2 h后，取下腔静脉血和右腓肠肌组织，ELISA法检测血清中肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β水平，腓肠肌组织中超氧化物歧化酶和髓过氧化物酶水平；苏木精-伊红染色法观察腓肠肌组织病理形态；TUNEL实验观察腓肠肌组织中细胞凋亡情况。
结果与结论：①与缺血再灌注组比较，EGCG组(100，200 mg/kg)血清中肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β水平及腓肠肌组织中髓过氧化物酶水平降低，超氧化物歧化酶水平升高，且与EGCG剂量呈正相关性；②苏木精-伊红染色结果显示EGCG组(100，200 mg/kg)肌纤维连续性及完整性、间质水肿程度等病理表现得到明显改善；③TUNEL实验结果显示EGCG组(100，200 mg/kg)凋亡细胞明显减少；④结果表明，EGCG通过减轻炎症反应、抗氧化应激及抑制组织细胞凋亡保护大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤。

https://orcid.org/0000-0001-9085-586X (薛庆)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 缺血再灌注损伤, 骨骼肌, 表没食子儿茶素没食子酸酯, 氧化应激, 炎症, 凋亡, 大鼠

Abstract:

BACKGROUND: Skeletal muscle ischemia-reperfusion (I/R) injury is a serious problem commonly encountered in clinical practice which seriously impacts the function and survival rate of replanted limbs. Epigallocatechin gallate (EGCG) has been proved to be antioxidant, anti-inflammatory and anti-apoptotic.

OBJECTIVE: To investigate the role of EGCG in I/R injury of rat skeletal muscle.
METHODS: Thirty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into five groups: sham operation group, I/R group, and three EGCG groups in which 10, 100 and 200 mg/kg EGCG was intraperitoneally injected 30 minutes before reperfusion respectively according to the weight of the rats. A lower limb I/R injury model was made in each group except for the sham operation group. The levels of tumor necrosis factor-α and interleukin-1β in serum were measured and the levels of superoxide dismutase and myeloperoxidasein gastrocnemius muscle tissue were detected. Morphological changes of gastrocnemius muscle tissue were observed by hematoxylin-eosin staining. Cell apoptosis in gastrocnemius muscle tissue was observed by the TUNEL assay.
RESULTS AND CONCLUSION: In the 100 and 200 mg/kg EGCG groups compared to the I/R group, there were the decreased levels of tumor necrosis factor-α and interleukin-1β in serum and myeloperoxidase in gastrocnemius muscle tissue and the increased level of superoxide dismutase in gastrocnemius muscle tissue, which were positively correlated with the EGCG dose. Hematoxylin-eosin staining results suggested an evident improvement in pathological manifestations ofgastrocnemius muscle, such as the continuity and integrity of muscle fibers and the degree of interstitial edema, in 100 and 200 mg/kg EGCG groups. TUNEL assay showed that 100 and 200 mg/kg EGCG inhibited cell apoptosis in gastrocnemius muscle tissue. To conclude, EGCG protects rat skeletal muscle from I/R injury by reducing inflammatory reaction, antioxidant stress and inhibiting apoptosis.

Key words: ischemia-reperfusion injury, skeletal muscle, epigallocatechin gallate, oxidative stress, inflammation, apoptosis, rat

中图分类号:

薛庆, 童梁成, 杨智伟, 汪剑龄, 赵磊, 周胜, 彭赛, 李颖. 表没食子儿茶素没食子酸酯可减轻大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(26): 4145-4149.

Xue Qing, Tong Liangcheng, Yang Zhiwei, Wang Jianling, Zhao Lei, Zhou Sheng, Peng Sai, Li Ying. Epigallocatechin gallate alleviates skeletal muscle ischemia-reperfusion injury in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(26): 4145-4149.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 30只SD大鼠均进入结果分析，无脱落。
2.2 EGCG可减轻缺血再灌注损伤导致的腓肠肌组织水肿、肌纤维溶解坏死正常的腓肠肌纤维具有清晰的边界和均匀的形态，无孔洞或断裂等特征，而受损的腓肠肌纤维则出现不均、断裂形态。如图2所示：与假手术组相比，缺血再灌注组腓肠肌纤维排列松散、不规则，肌膜不完整且模糊，肌横纹杂乱不齐，出现显著肌纤维间质水肿，部分区域出现肌纤维溶解坏死。与缺血再灌注组相比，EGCG(10 mg/kg)组仍存在腓肠肌组织结构水肿破坏及肌纤维溶解坏死情况，EGCG(100 mg/kg)组及EGCG(200 mg/kg)组肌纤维连续性及完整性、间质水肿程度等病理表现得到明显改善。随着EGCG浓度升高，腓肠肌纤维溶解坏死面积显著降低。

2.3 EGCG降低缺血再灌注损伤时炎症因子肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β水平如图3所示：与假手术组相比，缺血再灌注组大鼠血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平显著升高(P < 0.01)。与缺血再灌注组相比，EGCG(10 mg/kg)组大鼠血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平差异无显著性意义；EGCG(100 mg/kg)组大鼠血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平降低(P < 0.05)；EGCG(200 mg/kg)组大鼠血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平显著降低(P < 0.01)。相关性分析证明EGCG浓度变化程度与肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β水平变化存在高度相关性，即随着EGCG浓度提高，肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β水平降低(r=-0.973 5，R2=0.947 7；r=-0.979 5，R2=0.959 4)。

2.4 EGCG降低缺血再灌注损伤时腓肠肌组织中髓过氧化物酶水平以及升高超氧化物歧化酶水平如图4所示：与假手术组相比，缺血再灌注组大鼠腓肠肌组织中髓过氧化物酶水平显著升高(P < 0.01)，超氧化物歧化酶水平显著下降(P < 0.01)。与缺血再灌注组相比，EGCG(10 mg/kg)组大鼠腓肠肌组织中髓过氧化物酶、超氧化物歧化酶水平差异无显著性意义；EGCG(100 mg/kg)组大鼠腓肠肌组织中髓过氧化物酶水平降低(P < 0.05)，超氧化物歧化酶水平升高(P < 0.05)；EGCG(200 mg/kg)组大鼠腓肠肌组织中髓过氧化物酶水平显著降低(P < 0.01)，超氧化物歧化酶水平显著升高(P < 0.01)。相关性分析证明EGCG浓度变化程度与髓过氧化物酶以及超氧化物歧化酶水平变化存在高度相关性(r=-0.988 7，R2=0.977 6；r=0.981 7，R2=0.963 8)。

2.5 EGCG抑制缺血再灌注时腓肠肌组织细胞凋亡如图5所示：与假手术组相比，缺血再灌注组绝大多数细胞核中存在棕色颗粒，即多数细胞都已凋亡。与缺血再灌注组相比，EGCG(10 mg/kg)组阳性细胞减少；EGCG(100 mg/kg)组阳性细胞明显减少；EGCG(200 mg/kg)组阳性细胞显著减少。通过ImageJ软件对细胞计数后计算各组腓肠肌细胞凋亡率，并进行统计分析。与假手术组相比，缺血再灌注组细胞凋亡率显著增加，差异有非常显著性意义(P < 0.01)；与缺血再灌注组相比，EGCG(10 mg/kg)组细胞凋亡率差异无显著性意义；EGCG(100 mg/kg)组细胞凋亡率降低(P < 0.05)；EGCG(200 mg/kg)组细胞凋亡率显著降低(P < 0.01)。

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引言

在四肢再植术中，肢体缺血再灌注损伤是一个常见的临床问题，严重影响再植肢体术后存活率及功能[1-2]。骨骼肌具有很高的代谢活性，对缺血再灌注损伤非常敏感[3-4]。尽管现在可以在肢体离断8 h内快速回植肢体恢复血流，但缺血再灌注损伤仍可导致骨骼肌持续损伤和坏死，终末致截肢和多系统器官功能障碍综合征[5-8]。因此，治疗骨骼肌缺血再灌注损伤非常重要。
表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)是从茶叶中分离得到的儿茶素类单体，是茶叶特有的儿茶素，其含量占茶多酚制品的40%-50%[9]。从有机化学分子合成角度分析它是2-连苯酚基苯并吡喃与没食子酸形成的酯，因为具有酚基键，所以EGCG具有酚类抗氧化的通性，并且EGCG分子具有特殊的立体化学结构，使得其抗氧化性进一步加强[10]。维生素C是公认的高效抗氧化剂，能减轻抗坏血酸过氧化物酶基底的氧化应力；维生素E是一种脂溶性维生素，其水解产物为生育酚，是最主要的抗氧化剂之一；EGCG抗氧化活性至少是维生素C的100多倍，是维生素E的25倍，能够保护细胞和DNA免受损害，EGCG的这些功效归结于对氧自由基的清除能力，也就是抗氧化能力[11]。在缺血再灌注损伤中，缺血期间积聚的厌氧代谢产物在再灌注阶段诱导白细胞迁移和炎症因子的释放[12]。虽然缺血再灌注损伤的病理生理机制尚不清楚，但已有报道认为肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β等促炎细胞因子和自由基等化学介质参与了缺血再灌注损伤，而且这些化学介质还损伤了其他重要器官[13]。尽管基础研究和临床前研究取得了一部分研究成果，但在临床实践中还没有可用的抗氧化物质，原因可能是大多数活性氧清除剂似乎并没有在机体内转化。有文献证实EGCG通过减轻炎症反应和抗氧化应激，从而减轻脑缺血缺氧后的神经元损伤和脑水肿[14-15]；EGCG还能减轻肾缺血再灌注时的肾小管上皮细胞凋亡[16]。作者根据现有研究提出假设：骨骼肌缺血再灌注损伤时，EGCG能够通过抑制炎症反应、抗氧化应激、抑制组织细胞凋亡，从而减轻骨骼肌组织缺血再灌注损伤。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2020年6至8月在南京生命科技小镇拜睿生物实验室完成。
1.3 材料选择雄性SD大鼠30只，清洁级，6-8周龄，体质量200-250 g，由拜睿生物实验室提供，根据实验室动物护理和使用卫生指南统一饲养，温度为(21±2) ℃、湿度为60%-65%、控制12/12 h的光/暗周期，给予统一鼠粮及饮水。该动物实验经过东部战区空军医院伦理委员会审查批准。
实验药物、试剂和仪器：EGCG(上海源叶生物科技有限公司)；ELISA试剂盒(Abcam公司)；TUNEL凋亡检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)；脱水机(JJ-12J，武汉俊杰电子有限公司)；石蜡包埋机(JB-P5，武汉俊杰电子有限公司)；石蜡超薄切片机(RM2016，购自上海徕卡仪器有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验动物分组 30只SD大鼠随机分为5组：假手术组、缺血再灌注组以及10，100，200 mg/kg EGCG组，每组6只。

1.4.2 大鼠右下肢缺血模型制备及EGCG腹腔注射全麻后，大鼠取仰卧位，所有操作遵照外科无菌手术要求，主要流程见图1，在大鼠右下腹部和腹股沟剃毛，经腹股沟做横切口暴露右侧腹股沟血管，右股动脉用无损伤血管夹夹闭，采用相同的弹性橡胶圈于腹股沟区做右下肢环形节扎，当大鼠趾掌变得苍白青紫、发凉，提示右下肢血流阻断成功。缺血4 h后，打开血管夹，切断弹性橡胶圈，大鼠趾掌由暗紫色又转为粉红色，恢复血流灌注，继续行2 h再灌注。

假手术组只进行手术操作，不夹闭血管，不做右下肢环形节扎；EGCG组在再灌注前30 min腹腔注射EGCG，但此时继续夹闭血管，阻断血流，待缺血4 h时打开血管夹切断橡胶圈后再灌注2 h，EGCG剂量分别为10，100，200 mg/kg，每只大鼠注射液体总量为2 mL；假手术组及缺血再灌注组腹腔注射等体积生理盐水。

1.4.3 取材再灌注结束时，每只大鼠取2 mL下腔静脉血，将血液样本静置于4 ℃冰箱中，待30 min自然凝固后离心
(2 500 r/min，4 ℃，25 min)收集上清，然后依据各检测指标采用不同试剂盒进行生化分析。取右腓肠肌肌肉组织，一部分用液氮保存，用于检测肌肉组织中超氧化物歧化酶及髓过氧化物酶水平，一部分用多聚甲醛固定，用于组织切片苏木精-伊红染色及TUNEL实验。
1.4.4 ELISA试剂盒检测血清中肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β水平根据试剂盒要求进行相应操作，酶标仪在450 nm波长下测定吸光度值，通过标准曲线计算样品中肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β水平。
1.4.5 ELISA试剂盒检测肌肉组织中超氧化物歧化酶及髓过氧化物酶水平称取0.1 g腓肠肌肌肉组织，加入一定量PBS，用匀浆器将标本充分匀浆，离心机离心(2 500 r/min，20 min)后收集上清，根据试剂盒要求进行相应操作，酶标仪在450 nm波长下测定吸光度值。
1.4.6 苏木精-伊红染色观察腓肠肌组织形态学变化腓肠肌组织固定48 h，乙醇脱水，二甲苯使组织透明，石蜡包埋后切成4 μm的薄片，组织切片用苏木精和伊红染色，光学显微镜下观察。
1.4.7 TUNEL法检测腓肠肌细胞凋亡情况根据TUNEL检测试剂盒，将标本常规切片，按照试剂盒说明书操作，DAB显色，苏木精轻度复染，蒸馏水清洗、脱水、透明、封固。细胞核中有棕色颗粒者为TUNEL阳性细胞，即凋亡细胞。通过Image J图像分析凋亡细胞和正常细胞数目，计算细胞凋亡率。
1.5 主要观察指标血清中肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β水平；腓肠肌组织中超氧化物歧化酶及髓过氧化物酶水平；腓肠肌组织结构变化和细胞凋亡水平。
1.6 统计学分析使用SPSS 19.0统计软件对实验结果进行统计处理。数据以x±s表示，Levene法进行方差齐性检验，若方差齐，用One-way ANOVA分析，两两比较用LSD检验，若方差不齐，用Games-Howell法进行分析。应用比较分析法进行相关性分析。取α=0.05为检验水准，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

讨论

该研究发现EGCG改善了缺血再灌注损伤时腓肠肌纤维连续性、完整性及间质水肿程度等病理表现，恢复了部分腓肠肌组织形态。此外，EGCG可以减轻由缺血再灌注损伤引起的组织细胞氧化应激和全身炎症反应。既往研究表明，骨骼肌缺血再灌注损伤在四肢再植术中是一个常见而且严重的临床问题，严重影响再植肢体术后存活率及功能[1-2]。骨骼肌具有很高的代谢活性，因此对缺血后再灌注损伤非常敏感[3-4]。现在治疗缺血再灌注损伤主要包括物理治疗及药物治疗。已有研究报道，缺血预处理[17]、缺血后适应[18]、控制性再灌注[19]、低温等物理疗法均可缓解骨骼肌缺血再灌注损伤[20]，药物治疗包括使用地塞米松[21]、血必净[22]、褪黑素[23]、青藤碱[24]、桃红四物液等[25]，这些药物已被证明对减轻骨骼肌缺血再灌注损伤有效。现实中不可预判发生肢体离断的个体及时间，对于肢体离断这种严重创伤患者，挽救患者生命、预防和保护重要脏器功能是第一目的。因此对离体患肢保护的措施仅仅停留在保存在4 ℃干冷的环境中，降低细胞代谢，延长保存时间，为患者争取更多的术前时间。然而术中及术后并没有相应的化学治疗方法。此外，尽管上述策略和药物在实验室中显示出了一些有效成果，但还没有确定有任何临床益处。因此，仍需要发现具有抗氧化和抗炎能力的新物质来治疗骨骼肌缺血再灌注损伤。
EGCG是茶多酚中含量最高的多酚类物质，具有较强的抗氧化作用和抑制炎症反应的作用[10-11,26]。经动物实验研究，大鼠半数致死量(LD50)为761.5 mg/kg，最大耐受量为300 mg/kg[27]，该实验最大使用剂量仅为200 mg/kg，低于最大耐受量。通过苏木精-伊红染色证实：EGCG可减轻缺血再灌注损伤导致的骨骼肌组织水肿、肌纤维溶解坏死，EGCG(100 mg/kg)组及EGCG(200 mg/kg)组肌纤维连续性及完整性、间质水肿程度等病理表现得到明显改善。随着EGCG浓度升高，骨骼肌肌纤维溶解坏死面积显著降低。已有报道认为肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β等促炎细胞因子和自由基等化学介质参与并加速了缺血再灌注局部组织损伤。有文献证实EGCG在大鼠肝脏缺血再灌注损伤中，可通过减轻炎症反应，减轻肝脏组织病理变化以及减弱炎性浸润从而保护肝脏[28]。使用ELISA检测结果显示，EGCG(100，200 mg/kg)能够降低骨骼肌缺血再灌注损伤时炎症因子肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β水平。实验证实，EGCG降低缺血再灌注损伤时炎症因子肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β水平，而且肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β水平与EGCG浓度呈负相关，说明骨骼肌缺血再灌注时炎症因子介入导致组织损伤。超氧化物歧化酶是生物体内重要的抗氧化酶，是生物体内清除自由基的首要物质。它可对抗与阻断氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞[29]。髓过氧化物酶催化反应生成的氧化剂可导致氧化应激和氧化性组织损伤。髓过氧化物酶还参与调节炎症反应的许多过程，造成炎症部位组织细胞损伤[30]。在缺血再灌注损伤时，为了清除大量氧自由基，超氧化物歧化酶水平逐渐下降，髓过氧化物酶水平逐渐增高[31]。该实验结果显示，EGCG能够通过抗氧化应激作用降低髓过氧化物酶水平及升高超氧化物歧化酶水平，并具有剂量相关性。由缺血再灌注损伤引起的组织细胞氧化应激和全身炎症反应可使骨骼肌细胞周围内环境发生紊乱。为维持内环境稳定，会出现由基因控制的细胞自主有序的死亡，即细胞凋亡。通过TUNEL实验证实，EGCG能抑制缺血再灌注损伤时腓肠肌组织细胞凋亡。
结论：该研究表明EGCG可减轻缺血再灌注引起的骨骼肌损伤。此外，EGCG对缺血再灌注损伤诱导的氧化应激和全身炎症反应具有保护作用，可能是治疗缺血再灌注损伤的一种有前景的药物。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

表没食子儿茶素没食子酸酯可减轻大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤

Epigallocatechin gallate alleviates skeletal muscle ischemia-reperfusion injury in rats

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