序贯式干细胞移植治疗Duchenee型肌营养不良症

doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.40.017

摘要/Abstract

摘要：

背景：Duchenne型肌营养不良症是一种累及肌肉系统的致死性遗传疾病，迄今尚无有效治疗方法。近年来学者们针对干细胞治疗Duchenne型肌营养不良症进行了基础研究和动物实验，在此基础上又进行了有意义的临床试验。
目的：观察Duchenne型肌营养不良症患儿接受序贯式干细胞移植治疗前后，其运动功能、肌细胞修复与再生、抗肌萎缩蛋白表达和缺失基因替代的变化，评价治疗的可行性和安全性。
方法：于2009-05应用序贯式干细胞移植治疗1例8岁男性Duchenne型肌营养不良症患儿，多重连接探针扩增方法基因分析13外显子缺失。序贯式干细胞移植，即依次行脐带间充质干细胞经静脉内移植-肌肉内移植-单倍体异基因造血干细胞移植。定期检测血清酶学变化、供者HLA植入证据、缺陷基因表达、肌细胞膜抗肌萎缩蛋白表达、运动功能改善情况。
结果与结论：序贯式干细胞移植治疗Duchenne型肌营养不良症，可使缺失基因替代，肌细胞膜dystrophin阳性表达，血清酶学显著降低，进一步提高运动功能。可阻止Duchenne型肌营养不良症患儿疾病进展，有望获得持续性改善。

关键词: 假肥大型肌营养不良症, 序贯, 脐带间充质干细胞, 单倍体异基因, 造血干细胞移植, 抗肌萎缩蛋白

Abstract:

BACKGROUND: Duchenne muscular dystrophy (DMD), a well-known genetic lethal in humans, cannot be effectively cured at present. Recently, scholars have performed basic research and animal trials using stem cells for treatment of DMD, and also conduct significant clinical studies.
OBJECTIVE: To investigate the feasibility and safety of therapy in patients with DMD who received stem cell transplantation in sequence by observing the change of their motor function, muscle cytothesis and regeneration, expression of dystrophin and altering of depletion gene.
METHODS: An 8-years old boy with DMD was treated by stem cell transplantation in sequence in May 2009. Exon 13 was depleted by multiplex ligation-dependent probe amplification. Stem cell transplantation in sequence was as follows: First, intravenous umbilical cord mesenchymal stem cell (UC-MSC) transplantation; Second, intramuscular UC-MSC transplantation; finally, monoploid allogene hemopoietic stem cell transplantation. Sero-enzyme, implantation proof of donor HLA antigen, expression of depletion gene and dystrophin of myocyte membrane, motor function were detected after transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: By stem cell transplantation in sequence for DMD, depletion gene could be substituted. Dystrophin of myocyte membrane expresses; sero-enzyme steps down significantly; motor function is improved. It could prevent the progression of disease and patient’s condition is to be ameliorated continuously.

中图分类号:

R394.2

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Yang Xiao-feng, Xu Yi-feng, Lü Nai-wu, Zhang Yi-bin, Wang Hong-mei, Lu Yan, Lü Xin, Zhou Jin-xu, Liu Xin-ping. Stem cell transplantation in sequence for treatment of Duchenee muscular dystrophy[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2010, 14(40): 7487-7492.

参考文献

引言

材料方法

讨论

DMD的病因是位于x染色体短臂2区1带(Xp21) dystrophin基因突变，导致肌细胞膜形态结构异常，肌膜通透性及转运功能改变，致使肌细胞遭受破坏，为脂肪组织及纤维化组织所替代。当肌肉干细胞库的细胞不断调动而耗竭后，肌纤维发生不可逆的坏死，甚至消失，最终导致死亡^[12-13] 。由于dystrophin基因异常造成肌细胞膜损伤并非单一细胞受损，而是多种因素共同作用的结果，如微循环障碍、神经源性因素和肌膜损害等^[14] ，损伤肌细胞功能的改善和缺陷基因的修复是治疗本病的两个关键问题。序贯式干细胞移植术的方案正是为了解决这两个关键问题而设计的，依次应用脐带间充质干细胞经静脉内移植-肌肉内移植-单倍体异基因造血干细胞移植，既可提高患儿的运动功能，又可纠正缺陷基因为正常基因表达，使DMD患儿的病情得到全面控制。
3.1 改善损伤肌细胞功能——经静脉和肌肉UCMSCs移植   UCMSCs改善损伤肌细胞功能的可能性：间充质干细胞除具有自我更新和增殖能力外，还具有多向化潜能，且免疫性低，已成为一种理想的干细胞移植种子细胞^[15-16] 。近年来的研究结果表明，骨髓来源的间充质干细胞可以在体外经诱导分化为肌肉细胞^[17-18] 。Dezawa等^[19]把诱导的MSCs通过静脉注射和局部肌肉注射移植到mdx鼠体内，显示两种导入方法均可以再生肌纤维。2007-06杨晓凤等^[20]应用自体骨髓和脐血间充质干细胞联合移植治疗DMD患儿，82.4%的患儿肌力增强，运动功能改善，无不良反应发生，证实骨髓和脐血来源的间充质干细胞可用于治疗肌萎缩性疾病。但DMD患儿自体干细胞存在dystrophin表达缺失，不是最合适的种子细胞。
2006年Conconi等^[21]证实人的WJ来源CD105⁺间充质干细胞在体外可以向肌样细胞诱导，在培养7，11 d分别表达Myf5和MyoD。UCMSC较BMSC更为原始，增殖分化能力更强，生物性能稳定，可大量培养扩增。本例患儿应用UCMSC经静脉和肌肉内注射后运动功能改善，ADL评分增加，血清肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、乳酸脱氢酶活性较移植前降低，表明肌肉变性坏死速度减缓。
UCMSCs治疗DMD的机制：可能有以下几点：①修复损伤的肌膜，部分纠正dystrophin的表达缺陷^[22] 。②修复损伤的肌细胞，抑制肌细胞病变^[23-25] 。③修复病变的血管和神经，改善血液供应，传导信号加强^[26-27] 。④间充质干细胞向肌细胞分化，可有少量肌细胞新生^[28-30] 。
3.2 修复缺陷基因—异基因造血干细胞移植
修复缺陷基因的可能性：治愈DMD的惟一途径是修复缺陷基因。目前尚无基因疗法应用于临床，异基因造血干细胞移植成为修复缺陷基因的手段。Gussoni等^[31]将标记的正常雄性C57鼠骨髓干细胞注入放疗清髓后的雌性mdx鼠的尾静脉中，随着时间延长，经标记的骨髓干细胞在mdx鼠骨骼肌特异性分布指数明显高于正常对照C57鼠，抗肌萎缩蛋白的表达由阴性转变为阳性，同时伴有免疫病理、肌肉生理功能明显改善。张成等^[32]对1例DMD患儿进行了HLA全相合异基因脐血干细胞移植术，缺失的外显子得到纠正；75 d肌肉活检可见新生肌管形成，dystrophin免疫组化呈阳性，血清肌酸激酶下降，肌力略有改善，提示异基因造血干细胞移植可修复DMD缺陷基因。
近年来应用单倍体异基因造血干细胞移植治疗血液系统恶性疾病的有效手段^[33-34] ，几乎能为100%的患者找到供者，从根本上解决了供者来源问题。本例患儿在静脉和肌肉干移植改善肌细胞功能的基础上，接受单倍体异基因外周血干细胞移植，结果显示缺失的外显子得到纠正。移植后第85天肌肉活检显示骨骼肌内有供体基因位点表达(11.23%)，移植前缺失的13外显子呈弱阳性表达。肌细胞膜dystrophin间断阳性表达，证实供者的造血干细胞不仅能在骨髓中定居重建造血功能，也可迁移至病变的肌肉中并分化为正常的骨骼肌细胞。血清肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、乳酸脱氢酶下降，肌力和运动功能进行性提高也证实此种观点。
移植效果分析： ①造血干细胞移植后15，30 d进行供者和患者的骨髓和外周血短片段重复顺序DNA基因分析，显示供者完全独立植入。②缺失的外显子完全纠正，转变为正常基因型表达，这是供者正常的基因已替代了受者的缺陷基因的结果。③造血干细胞移植后85 d复查肌肉活检，肌细胞形态改善，免疫组化dystrophin间断阳性表达，提示肌肉细胞坏死得到初步控制。④血清肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、乳酸脱氢酶数值由下降—轻度升高—下降的波动过程，与大剂量免疫抑制剂的应用和干细胞减轻或修复损伤肌细胞有关。⑤移植后90 d复查肌电图，波幅改善；⑥移植后动作灵活度增强，上下肢肌力提高0.5~1级，运动功能明显改善，ADL评分较治疗前显著增加。
异基因造血干细胞移植治疗DMD的机制： ①异基因造血干细胞中正常的基因替代了患儿的缺陷基因，解决了病因问题。②大量间充质干细胞和造血干细胞定位于损伤肌肉，使肌细胞坏死得到有效控制。③大剂量免疫抑制剂的应用降低肌膜的通透性，抑制了肌细胞坏死速度。
3.3 序贯式干细胞移植的风险    经静脉和肌肉UCMSCs移植安全性好，未发现不良反应。单倍型异基因造血干细胞移植术具有很高的风险性：①移植后移植物抗宿主反应。②植入物排斥。③移植后免疫重建迟缓，同HLA配型相合移植比较，存在造血重建慢、移植物抗宿主反应严重、免疫重建迟和移植相关死亡高等诸多问题。本例患儿采用非清髓预处理方案，给予高数量的单个核细胞和CD34⁺细胞输注，分次进行高数量的UCMSCs输注，致死性风险的预防等措施，未发生移植相关性并发症，未发生移植物抗宿主反应，达到预期治疗目的。
3.4 序贯式干细胞移植治疗DMD的意义   应用序贯式干细胞移植治疗DMD患儿取得了初步成功，对于这种致死性遗传疾病具有重要意义，也为其他类型遗传疾病的治疗提供了一个新的思路。本文结果表明，序贯式干细胞移植是一个全方位治疗DMD的方案，不仅修复损伤肌细胞，提高肌力和运动功能，又使缺陷基因得到纠正，病因治疗和临床症状治疗相结合，使DMD这一不治之症的治疗迈向一个新阶段。
序贯式干细胞移植适合于保留运动功能的轻、中度肌肉萎缩的DMD患儿，已丧失行走能力的严重肌肉萎缩的患儿即使缺陷基因纠正，也不可能改善患儿的运动功能。本项方案的远期疗效正在进一步随访观察中。　　

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