重组大鼠肝再生增强因子原核表达载体构建及多克隆抗体制备

doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.11.011

摘要/Abstract

摘要：

背景：国外有1篇文献报道了肝再生增强因子在中枢神经系统内的分布与表达。由于关于重组大鼠肝再生增强因子蛋白多克隆抗体制备、鉴定及原核表达载体如何构建的相关文献较少，国内对于其在中枢神经系统的研究目前未见报道。

目的：利用大肠杆菌BL21表达大鼠肝再生增强因子融合蛋白，并制备和鉴定其多克隆抗体。

方法：提取SD大鼠海马组织RNA，构建原核表达重组质粒pET28a-ALR并转化到宿主菌BL21中，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达目的融合蛋白，经Ni²⁺亲和层析纯化回收，4次免疫日本大耳白兔后，心脏取血，吸取血清作为多克隆抗体，以ELISA测定抗体血清效价，Western-blotting检测抗体的特异性和亲和性。观察：①原核表达重组质粒pET28a-ALR构建。②pET28a-ALR重组体酶切鉴定。③ELISA及Western-blotting检测结果。

结果与结论：双酶切电泳检测结果显示得到了预期条带，其大小分别为5.3 kb和0.4 kb，经核苷酸序列分析证明成功构建了pET28a-ALR原核表达载体。成功获得分子质量约为19 ku纯化的融合蛋白。ELISA测定显示多克隆抗体效价可达到 1∶2 000，说明抗体与纯化的重组肝再生增强因子蛋白具有良好的反应性，有较高的效价，可满足实验的要求。通过Western-blotting检测证明该抗体可以特异性识别肝再生增强因子蛋白。实验成功地利用原核表达体系表达了肝再生增强因子融合蛋白，并制备、纯化了抗肝再生增强因子蛋白的多克隆抗体，经鉴定能够满足针对肝再生增强因子免疫印迹检测的实验要求。

关键词: 肝再生增强因子, 原核表达, 多克隆抗体, 制备, 鉴定

Abstract:

BACKGROUND: An abroad study reported the distribution and expression of augmenter of liver regeneration (ALR) in the central nervous system. There are few literatures on how to prepare and evaluate ALR protein polyclonal antibody in recombinant rats, and how to construct prokaryotic expression vector. There are no reports concerning ALR in the central nervous system in China.
OBJECTIVE: To express ALR fusion protein in E. coli BL21 and prepare and identify polyclonal antibody.
METHODS: RNA was extracted from the hippocampus of Sprague Dawley rats. The prokaryotic expression plasmid pET28a-ALR was constructed and the positive recombinant plasmid was transformed into BL21. Protein ALR was expressed by inducing transformed BL21 with Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) and purified by Ni2+ affinity chromatography column after immune the rabbit for 4 times, the serum of rabbits was extracted from heart as polyclonal antibody. The titer and specificity of the rabbit’s antiserum was respectively measured by ELISA and Western blotting. The following parameters were measured: construction of prokaryotic expression plasmid pET28a-ALR; pET28a-ALR recombinant enzyme digestion evaluation; results of ELISA and Western-blotting.
RESULTS AND CONCLUSION: Expecting bands were obtained by double enzyme digestion electrophoresis, respectively 5.3 kb and 0.4 kb. Nucleotide sequence analysis verified that prokaryotic expression vector pET28a-ALR was successfully constructed. The 19 ku fusion protein was successfully expressed. The titer of the antiserum measured by ELISA could achieve 1: 2 000. This indicated that antibody and purified recombinant ALR had a good reaction, and high titer, could meet the experimental require. Western blotting analysis proved that the antibody could identify the prokaryotic expression product of ALR. Prokaryotic expression system expressed ALR fusion protein, prepared and purified polyclonal antibody of ALR protein, and could meet the experimental require of ALR immunoblotting.

中图分类号:

R318

刘正芳，王建明，王岚，曾晓云，熊玲，罗志秀，伍俊伊. 重组大鼠肝再生增强因子原核表达载体构建及多克隆抗体制备[J]. 中国组织工程研究, 2010, 14(11): 1943-1947.

Liu Zheng-fang, Wang Jian-ming, Wang Lan, Zeng Xiao-yun, Xiong Ling, Luo Zhi-xiu, Wu Jun-yi. Genetic recombinant prokaryotic expression of augmenter of liver regeneration and preparation of polyclonal antibodies in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2010, 14(11): 1943-1947.

参考文献

引言

材料方法

讨论

大鼠肝再生增强因子被证实存在于许多组织中(肝脏、肾脏、睾丸等)^[4^，^9]，除促进肝细胞再生外还具有多种功能，如参与组织器官的形成与发育、免疫调控作用、增强金属蛋白酶活性、与线粒体功能有关等^[10]。作者在前期研究中发现肝再生增强因子在阿尔茨海默病模型大鼠海马中的表达水平明显下降，提示肝再生增强因子在神经系统疾病中可能具有潜在的病理作用。阿尔茨海默病发病机制十分复杂，涉及淀粉样蛋白前体过度表达、β-淀粉样蛋白沉积、慢性炎症反应等^[11-13]，且这些分子机制之间相互联系、相互影响。随着研究技术水平的不断发展和深入，越来越多的具有多种重要生物功能的蛋白分子被发现，或被发掘出新的功能，肝再生增强因子就是其中之一。本实验选用目前应用广泛的PET原核表达系统，它是Zhang及Studier等^[14]利用与启动子配套能高效转录特定基因的外源RNA聚合酶构建的T7RNA聚合酶/启动子系统。与其他E.coli启动子系统(Lac，Tac，PL)不同，由于E.coli的RNA聚合酶不能识别T₇启动子，当没有T₇RNA聚合酶时，则不存在基础转录，从而使克隆与表达两步很好分离^[15-16]。另外，该表达载体的两端带有His-Tag多肽序列标签。该标签可以增加融合蛋白的可溶性表达^[17]，可利用抗His的单克隆抗体对表达的融合蛋白进行鉴定，还可以通过His-Tag能与Ni²⁺发生鳌合作用的原理对融合蛋白进行纯化，简化了蛋白质下游纯化技术的步骤^[18-19]。肝再生增强因子的编码区基因与啤酒酵母的核基因ERV1同源，ERV1/ALR蛋白的羧基末端具有CXXC功能序列，从酵母到人的同源基因中都有这段保守序列^[20-21]，理论上预测为可溶性蛋白，经原核表达获得的目的蛋白主要以胞质不溶性组分的包涵体形式存在。包涵体是多肽错误折叠的高密度多聚体，它在细胞内形成的原因主要是由于细胞内加工表达多肽正确折叠的能力丧失；当外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，由于形成蛋白的速度快产量高，蛋白折叠辅助因子不足，蛋白不能及时正确折叠而大量堆积形成^[22-23]。在蛋白纯化和复性的先后顺序上，本实验选用现在变性条件下亲和层析纯化后复性的方案。首先通过加入尿素变性使包涵体蛋白溶解，其作用原理是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展^[24]。蛋白纯化过程是通过固定化金属亲和层析方法在变性条件下进行的^[25]，其原理是组氨酸标签序列与固定在基于次氨基三乙酸和亚氨基二乙酸的His.Bind树脂上的二价阳离子Ni²⁺结合，洗去未结合蛋白后，用咪唑或pH稍低的缓冲液洗脱并回收目的蛋白^[26]。蛋白复性是指重组蛋白所形成的包涵体在一定浓度的溶剂中，其结合的蛋白相互分离，呈变性状态，即所有的氢键、疏水键全部破坏，但一级结构保持完好，通过缓慢除去变性剂是目的蛋白从变性的完全伸展状态回复到正常的折叠结构。蛋白复性的方法有很多，包括稀释复性、透析复性、超滤复性、柱上复性等^[27]。本实验采用的是透析复性，即直接将纯化产物置于浓度不断降低的尿素溶液中达到复性的目的，其好处是不增加体积，通过直接降低透析浓度来控制变性剂除去速度。复性的蛋白加入佐剂免疫白兔，还能减少抗原接种剂量和接种次数；增强免疫应答的速度和持续时间，调节抗体的亲和力及特异性等^[28-29]。本实验成功地利用原核表达体系表达了肝再生增强因子融合蛋白，并制备、纯化了抗肝再生增强因子蛋白的多克隆抗体，经鉴定能够满足针对肝再生增强因子免疫印迹检测的实验要求，为进一步入研究肝再生增强因子奠定了基础。

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