碱性成纤维细胞生长因子对庆大霉素致肾小管上皮损伤的拮抗效应

doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.02.012

摘要/Abstract

摘要：

背景：体内实验证实成纤维细胞生长因子能有效保护庆大霉素致肾小管上皮细胞的损伤，但对体外培养细胞的作用如何不多见。
目的：在建立庆大霉素肾毒性体外细胞模型的基础上，观察不同浓度碱性成纤维细胞生长因子对庆大霉素肾毒性的保护作用。
方法：采用酶加网筛方法分离纯化昆明小鼠肾小管上皮细胞，调整细胞浓度为1×10⁸ L^-1，将细胞悬液移入96孔细胞培养板，分组培养：空白对照组：正常培养；庆大霉素组: 10，30，50 µL/孔 (即400，1 200，2 000 U/孔)记为G1、G2、G3；碱性成纤维细胞生长因子组：20，50，80 µL/孔(即90，225，360 ng/孔)记为B1、B2、B3；庆大霉素加碱性成纤维细胞生长因子干预组：先加碱性成纤维细胞生长因子12 h后，再加庆大霉素12 h培养，分9个剂量组，即G1B1、G1B2、G1B3、G2B1、G2B2、G2B3、G3B1、G3B2、G3B3，每组4复孔。观察细胞形态及数量变化。
结果与结论：庆大霉素对肾小管上皮细胞的损伤呈剂量依赖性，中、高浓度组的上皮细胞皱缩，变圆，肿胀，贴壁差，内部胞质破坏严重，结构紊乱，低浓度组细胞数量改变不明显，并且开始有成纤维细胞出现；碱性成纤维细胞生长因子各组细胞饱满、折光性强，数量明显增多，50 µL/孔浓度以上效果显著，与80 µL/孔差异无显著性意义；庆大霉素加碱性成纤维细胞生长因子干预组中低浓度庆大霉素组细胞未见明显损害，细胞数量反而增多，中浓度庆大霉素组损害的细胞崩解减少、细胞皱缩和贴壁差的程度有所减轻，高浓度碱性成纤维细胞生长因子干预后细胞形态良好，但高浓度庆大霉素所致细胞肿胀、坏死损伤任何浓度的碱性成纤维细胞生长因子干预都无法改善。50 µL/孔碱性成纤维细胞生长因子对中、低浓度庆大霉素所致肾毒性有拮抗作用，对高浓度庆大霉素所致肾毒性无保护作用。

关键词: 碱性成纤维细胞生长因子, 庆大霉素, 肾小管上皮细胞, 细胞培养, 泌尿系统组织工程

Abstract:

BACKGROUND: In vivo experiments have confirmed that fibroblast growth factor can effectively protect gentamicin-induced renal tubular epithelial cell injury, but the effect on the in vitro cultured cells is still rare.
OBJECTIVE: To explore the mechanisms of basic fibroblast growth factor (bFGF) at different concentrations on preventing nephrotoxity mediated by genamicin on the primarily cultivated renal tubular epithelial cell models.
METHODS: By use of enzyme and mesh screening, renal tubular epithelial cells were isolated from Kunming mice and purified, adjusting the cell concentration of 1×10⁸/L, then cell suspension was moved to a 96-well culture plate and divided into different groups for culture: blank control group: normal culture; gentamicin group: 10, 30, 50 μL/hole (ie, 400, 1 200, 2 000 U/holes) are recorded as G1, G2, G3; bFGF group: 20, 50, 80 μL/hole (ie, 90, 225, 360 ng/hole) are recorded as B1, B2, B3; gentamicin plus bFGF intervention group: after adding bFGF 12 hours, then added gentamicin 12 hours, assigned into 9 dose subgroups, namely, G1B1, G1B2, G1B3, G2B1, G2B2, G2B3, G3B1, G3B2, G3B3, each subgroup contained four-hole complex. Cell morphology and quantity was observed.
RESULTS AND CONCLUSION: Gentamicin showed a dose-dependent effect on the renal tubular epithelial cell injury, epithelial cells in the medium and high concentration groups exhibited shrinkage, rounded, swelling, poor adhesion, severely damaged cytoplasm and structural disorder. In the low concentration group, the number change of cells was not obvious, and fibroblasts began to appear; In the bFGF groups, cells were full, exhibited strong refraction, the cell number increased significantly, these manifestations were significant in 50 μL/hole concentration, and there was no significant difference compared with 80 μL/hore concentration; in case of gentamicin plus bFGF intervention, cells with low concentrations of gentamicin had no obvious damage to cells, which increased, the damaged cells collapse was reduced in the group of low concentration of gentamicin, cell shrinkage and poor adhesion were slightly relieved, high concentrations of bFGF intervention could yield to good cell morphology, but high concentrations of gentamicin caused cell swelling and necrosis of injury, which could not be improved by any concentrations of bFGF intervention. 50 μL/hole bFGF has antagonistic effect on the nephrotoxicity mediated by medium and low concentrations of gentamicin, but has no protection on high concentration of gentamicin-induced nephrotoxicity.

中图分类号:

R392.114

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参考文献

引言

材料方法

讨论

成纤维细胞生长因子以往有很多体内实验^[11-15] ，但体外培养的研究尚不多。原代细胞最大限度保留了体内细胞的生物学特点^[16-17] 。
庆大霉素对肾小管上皮细胞损伤，呈剂量依赖关系^[18] 。结果也证实：①10 µL/孔庆大霉素处理后，未见明显细胞形态变化，而且出现些纤维状的细胞。故知 10 µL/孔的庆大霉素浓度太低，对肾小管上皮细胞起不到损伤作用。也可能低浓度的庆大霉素促进肾小管上皮细胞内分泌碱性成纤维细胞生长因子^[19-20] 。因为低浓度庆大霉素对少部分细胞造成损伤，细胞破损的微小空隙使内源性的碱性成纤维细胞生长因子释放，对余下的细胞可起到很好保护。这也解释为什么纤维状细胞会增多，因为碱性成纤维细胞生长因子可促进成纤维细胞的增长。当然也有文献认为纤维状细胞可能是肾小管上皮细胞转化为的肌成纤维细胞^[21] 。类似的情况也发生在角膜内皮^[22] 。②30 µL/孔庆大霉素处理后，肾小管上皮细胞肿胀、边界不清。结果与对照组和10 µL庆大霉素组存在显著差异，说明此浓度的庆大霉素对肾小管上皮细胞可产生较强的损伤作用。但与50 µL/孔庆大霉素组结果对比差异不明显，说明30 µL/孔庆大霉素为一个临界值，可对细胞产生致死性结果。它与受体的结合基本饱和。③50 µL/孔的庆大霉素处理后，可见细胞溶解坏死。庆大霉素肾毒性的机制下：酶活性的改变，自由基损伤, 膜流动性下降，细胞内高钙，抑制能量产生等。一些神经组织病变也可见相似改变^[23] 。
加入20 µL/孔碱性成纤维细胞生长因子时，结果与对照组无明显区别，故认为20 µL/孔碱性成纤维细胞生长因子浓度过低，对细胞增殖作用不明显。当加入50 µL/孔碱性成纤维细胞生长因子时，细胞增多明显，胞核更清楚，见核仁。与对照组和20 µL/孔碱性成纤维细胞生长因子组有显著差异，说明此浓度的碱性成纤维细胞生长因子对肾小管上皮细胞与显著的促增殖作用。但结果与80 µL/孔碱性成纤维细胞生长因子组差异不明显，说明50 µL/孔碱性成纤维细胞生长因子为一个临界值，可对肾小管上皮细胞产生显著的增殖作用。它与受体结合基本饱和^[24-29] 。当加入80 µL/孔碱性成纤维细胞生长因子时，细胞显著增多，结果与对照组、20 µL/孔碱性成纤维细胞生长因子差异显著，对上皮细胞有强增殖能力。
以往文献基本都先加庆大霉素后加成纤维细胞生长因子修复治疗^[20] ，机制不同，效果也不一定明显。先加碱性成纤维细胞生长因子12 h后，再加庆大霉素损伤，效果明显。碱性成纤维细胞生长因子受体有高亲和性和低亲和性两种，高亲和性受体，具有酪氨酸激活性^[30] ，对庆大霉素有预防保护作用。以往文献多是定性的研究，少涉及定量。碱性成纤维细胞生长因子和庆大霉素两个因素分别3个水平，做析因分析。它们之间存在有显著的交互作用。从2个均数图可看出，加50 µL/孔庆大霉素处理的细胞，A值都下降为一个低点上，说明无论何浓度碱性成纤维细胞生长因子处理都无效。因此50 µL/孔庆大霉素是致死量，无法保护修复，对细胞的伤害远大于各浓度碱性成纤维细胞生长因子的保护作用。
因为碱性成纤维细胞生长因子和庆大霉素之间存在显著交互作用，分析单独效应，从结果看：①10 µL/孔庆大霉素量太小，对细胞无法起到损伤作用，各浓度碱性成纤维细胞生长因子均能明显增殖细胞 ②加入50 µL/孔庆大霉素，细胞损害严重，无碱性成纤维细胞生长因子可以有保护作用。③用80 µL/孔碱性成纤维细胞生长因子保护时，效果同50 µL/孔碱性成纤维细胞生长因子组，可能与受体饱和有关。
也有文献说明，碱性成纤维细胞生长因子的作用有时效性，随时间延长而失去促细胞增殖的作用。且内源性与外源性碱性成纤维细胞生长因子在量效，作用方式与途径等方面存在差异^[31] ，在合适的时间，碱性成纤维细胞生长因子效力最高，能对抗高浓度庆大霉素，故摸索最合适的作用时间也是今后的研究内容之一。

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