易洛魁同源盒基因3调控血管周围脂肪组织褐变改变血管损伤的潜在机制

doi:10.12307/2026.169

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (22): 5671-5681.doi: 10.12307/2026.169

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易洛魁同源盒基因3调控血管周围脂肪组织褐变改变血管损伤的潜在机制

胡晓咏，宋乾华，杨朝颖，唐瑞，李红建

新疆医科大学第五附属医院高血压科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000

收稿日期:2025-06-06 接受日期:2025-09-16 出版日期:2026-08-08 发布日期:2025-12-26
通讯作者: 李红建，博士，教授，新疆医科大学第五附属医院高血压科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000
作者简介:胡晓咏，男，1987年生，安徽省芜湖市人，汉族，新疆医科大学在读博士，主要从事心血管基础与临床研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区卫生健康科研项目(2025001CXKYXM650025463)，项目负责人：李红建；新疆“天山英才”医药卫生高层次人才培养计划-领军人才项目(TSYC202301A057)，项目负责人：李红建；国家自然科学基金地区科学基金项目(8226020195)，项目负责人：李红建

Potential mechanism by which iroquois homeobox 3 regulates the browning of perivascular adipose tissue in vascular injury

Hu Xiaoyong, Song Qianhua, Yang Zhaoying, Tang Rui, Li Hongjian

Department of Hypertension, The Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uyghur Autonomous Region, China

Received:2025-06-06 Accepted:2025-09-16 Online:2026-08-08 Published:2025-12-26
Contact: Li Hongjian, MD, Professor, Department of Hypertension, The Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uyghur Autonomous Region, China
About author:Hu Xiaoyong, MD candidate, Department of Hypertension, The Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uyghur Autonomous Region, China
Supported by:
Health and Wellness Research Project of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2025001CXKYXM650025463 (to LHJ); Xinjiang 'Tianshan Talents' High-level Talent Training Program in Medicine and Health - Leading Talent Project, No. TSYC202301A057 (to LHJ); the National Natural Science Foundation of China, No. 8226020195 (to LHJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
易洛魁同源盒基因3：是易洛魁同源框基因家族转录因子，通过靶向视黄醇饱和酶调控脂肪细胞代谢表型，在血管周围组织中参与维持脂肪产热褐变状态以发挥血管保护作用。
血管周围脂肪褐变：血管外膜脂肪细胞从白色(储能)向棕色(产热)转化的过程，伴随解偶联蛋白1等产热基因激活，可减轻血管炎症并促进内皮功能修复。

背景：在医学领域，血管损伤相关疾病备受关注，血管周围脂肪组织褐变与之密切相关，但特定基因在其中的调控机制尚待明晰。
目的：初步探讨易洛魁同源盒基因3在血管损伤过程中调控血管周围脂肪组织褐变的潜在机制。
方法：解析血管周围脂肪组织相关单细胞测序数据矩阵GSE275779，探讨易洛魁同源盒基因3在不同细胞亚群中的表达水平及功能；结合脂肪细胞相关芯片和测序表达谱GSE44059、GSE7032、GSE185518、GSE168387，筛选差异基因并验证易洛魁同源盒基因3在棕色脂肪细胞分化过程中的表达水平；基于msigdb数据库和ChIP-seq数据库GTRD筛选易洛魁同源盒基因3的下游靶基因。在脂肪前体细胞中干扰易洛魁同源盒基因3和过表达视黄醇饱和酶，采用qPCR和Western blot检测脂肪细胞褐变相关基因的mRNA和蛋白表达水平。
结果与结论：生物信息学分析结果显示，脂肪细胞特征因子PR结构域蛋白16、细胞死亡诱导DFFA样效应蛋白A和解偶联蛋白1等在糖尿病患者的血管周围脂肪组织中显著下调，且这些基因均参与脂肪褐变；结合高通量测序数据分析发现易洛魁同源盒基因3在棕色脂肪组织中高表达，并参与了棕色脂肪的分化；进一步筛选出视黄醇饱和酶为易洛魁同源盒基因3的下游靶基因，且它的水平随着棕色脂肪的分化而差异表达。在成熟棕色脂肪细胞中敲低易洛魁同源盒基因3，会导致视黄醇饱和酶和脂肪褐变相关标志物(解偶联蛋白1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α、PR结构域蛋白16)的表达均降低。在视黄醇饱和酶回复实验中，视黄醇饱和酶过表达显著上调脂肪褐变相关标志物的蛋白水平，但不影响易洛魁同源盒基因3的表达。此研究初步揭示了易洛魁同源盒基因3在血管损伤过程中调控血管周围脂肪组织褐变的潜在机制。

https://orcid.org//0009-0006-8917-3793 (胡晓咏)；https://orcid.org/0009-0006-1826-505X (李红建)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 血管损伤, 血管周围脂肪组织, 生物信息学, 单细胞测序, 褐变, 易洛魁同源盒基因3(IRX3)

Abstract: BACKGROUND: Vascular injury-related diseases have garnered significant attention in the medical field, and the browning of perivascular adipose tissue is closely linked to these diseases. However, the regulatory mechanisms of specific genes involved in this process remain unclear.
OBJECTIVE: To investigate the potential mechanism by which iroquois homeobox 3 regulates the browning of perivascular adipose tissue in vascular injury.
METHODS: The perivascular adipose tissue-related single-cell sequencing data matrix GSE275779 was analyzed to investigate the expression levels and functions of iroquois homeobox 3 in various cell subpopulations. In conjunction with adipocyte-related microarray and sequencing data GSE44059, GSE7032, GSE185518, and GSE168387, differentially expressed genes were identified, and the expression level of iroquois homeobox 3 during the differentiation of browning adipocytes was validated. The downstream target genes of iroquois homeobox 3 were screened using the msigdb database and the ChIP-seq database GTRD. By disrupting iroquois homeobox 3 and overexpressing retinol saturase in adipocyte precursor cells, the mRNA and protein expression levels of adipocyte browning-related genes were detected using quantitative polymerase chain reaction and western blot analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: Bioinformatics analysis results showed that adipocyte characteristic factors PR domain containing 16, cell death-inducing DFFA-like effector A, and uncoupling protein 1 were significantly downregulated in diabetic perivascular adipose tissue, and these genes were all involved in fat browning. Combined with high-throughput sequencing data analysis, iroquois homeobox 3 was found to be highly expressed in brown adipose tissue and to play a role in the differentiation process of brown adipocytes. Retinol saturase was identified as a downstream target gene of iroquois homeobox 3, and its expression levels differed during the differentiation of brown adipocytes. In mature brown adipocytes, knocking down iroquois homeobox 3 resulted in a decrease in the expression of retinol saturase and adipocyte browning-related markers (uncoupling protein 1, peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 alpha, PR domain containing 16). In the retinol saturase rescue experiment, overexpressing retinol saturase substantially upregulated the protein levels of adipocyte browning-related markers, but did not affect the expression of iroquois homeobox 3. This study preliminarily reveals the potential mechanism by which iroquois homeobox 3 regulates the browning of perivascular adipose tissue in vascular injury.

Key words: vascular injury, perivascular adipose tissue, bioinformatics, single cell sequencing, browning, iroquois homeobox 3

中图分类号:

胡晓咏, 宋乾华, 杨朝颖, 唐瑞, 李红建. 易洛魁同源盒基因3调控血管周围脂肪组织褐变改变血管损伤的潜在机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(22): 5671-5681.

Hu Xiaoyong, Song Qianhua, Yang Zhaoying, Tang Rui, Li Hongjian. Potential mechanism by which iroquois homeobox 3 regulates the browning of perivascular adipose tissue in vascular injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(22): 5671-5681.

图/表（结果） 5

2.1 单细胞测序分析发现损伤血管周围脂肪组织褐变减少血管损伤是糖尿病的常见并发症[20]。GSE275779数据集展示了正常和糖尿病大鼠血管周围脂肪组织中单细胞景观。经Seurat降维得到28个细胞亚群(图1A)，然后根据细胞标志物的表达特异性进一步降维，得到13个细胞亚群，分别为成纤维细胞、脂肪细胞、T细胞、巨噬细胞、B细胞、间皮细胞、内皮细胞、NKT细胞、神经施万细胞、肥大细胞、中性粒细胞、树突状细胞、单核细胞(图1B)。对脂肪细胞进一步分析，表达排名前5的特征因子包括脂肪酸结合蛋白4、过氧化物酶体增殖物激活受体γ、脂联素、长链酰基辅酶A合成酶1和细胞死亡诱导DFFA样效应蛋白C(图1C)，其中脂肪酸结合蛋白4、过氧化物酶体增殖物激活受体γ的统一流形逼近与投影聚类图谱如图1D所示。研究发现与对照组相比，PR结构域蛋白16、细胞死亡诱导DFFA样效应蛋白A和解偶联蛋白1等在糖尿病大鼠的血管周围脂肪组织中显著下调，且这些基因均参与脂肪褐变(图1E)[23]。结果表明，糖尿病血管损伤伴随着血管周围脂肪组织褐变的抑制。
2.2 IRX3在脂肪细胞中特异性表达并且在棕色脂肪中表达上调对单细胞测序数据GSE275779中对照和糖尿病大鼠脂肪细胞中差异基因(∣logFC∣> 1，adjusted P.value < 0.05)进行筛选(图2A)及功能富集发现差异基因富集到脂肪褐变这一过程(图2B)，表明具有血管损伤特性的糖尿病大鼠血管周围脂肪组织确实存在脂肪褐变的改变。进一步分析发现IRX3只在脂肪细胞中特征表达，并且在对照组血管周围脂肪组织的脂肪细胞中高表达，在糖尿病大鼠的血管周围脂肪组织的脂肪细胞中下调(图2C，D)，提示血管损伤时血管周围脂肪组织褐变减少可能与IRX3表达减少有关联。同样，在棕色脂肪相关芯片表达数据(GSE44059和GSE7032)中，也发现相较于白色脂肪组织，IRX3在棕色脂肪组织中显著高表达(图2E，F，P < 0.05)。
2.3 IRX3在脂肪褐变过程中表达上调使用GSE185518数据，包括诱导多潜能干细胞、分化过程中的棕色脂肪以及胚胎棕色脂肪组织验证，发现随着棕色脂肪细胞的成熟，IRX3的mRNA表达显著提高，并且在棕色脂肪组织中表达最高(图3A)。使用GSE168387展示了未分化的胚胎干细胞(Undiff-Stem cells)、中胚层期(Mesoderm stage)、棕色脂肪前体细胞(Brown adipocytes precursor)以及成熟的棕色脂肪细胞(Brown adipocytes)这一棕色脂肪诱导分化过程中基因表达数据，同样也观察到类似

结果，从未分化的干细胞到成熟褐色脂肪细胞分化过程中IRX3的mRNA表达显著提高，其中以棕色脂肪前体细胞的表达量最高(图3B)。总之，棕色脂肪细胞分化过程中IRX3的mRNA表达显著提高。进一步基于GSE168387所有样本数据得到与IRX3表达具有相关性的基因(∣r∣> 0.95，P < 0.05)，并对其进行功能富集分析(图3C，D)和KEGG通路富集分析(图3E，F)，结果表明，正相关基因大多参与多潜能分化调控以及心肌细胞发育调控，而负相关基因参与能量平衡代谢。以上结果表明，IRX3可能参与棕色脂肪细胞分化过程。
2.4 IRX3可能介导RETSAT参与血管周围脂肪组织褐变 IRX3作为IRX家族的转录因子调控基因表达，为了进一步探讨IRX3参与棕色脂肪细胞分化的可能机制。此研究筛选IRX3分化过程中的下游靶基因。从msigdb (https://www.gsea-msigdb.org/)得到了IRX3的靶基因(IRX3_TARGET_GENES)，其中55个基因经ChIP-seq数据库GTRD鉴定，在其启动子区(TSS-1000，+100 bp) 含有1个或多个IRX3蛋白(UniProt:P78415) 结合位点。将IRX3的靶基因与GSE168387数据中和IRX3表达具有显著相关性的基因取交集(r > 0.95，OR < -0.95，P < 0.05)，发现核糖体蛋白S13、RETSAT可能是IRX3的靶基因(图4A)。RETSAT和IRX3表达也具有显著的正相关性(图4B)。进一步研究结果显示，在棕色脂肪细胞分化测序数据GSE185518和GSE168387中，观察到RETSAT的mRNA水平随着棕色脂肪细胞分化程度增加而有不同程度的升高(图4C，D，P < 0.05)，说明IRX3极有可能介导RETSAT参与棕色脂肪细胞的分化过程。
2.5 IRX3可上调RETSAT参与脂肪细胞褐变为了进一步验证IRX3/RETSAT是否调控脂肪褐变，检测3T3-L1脂肪前体细胞诱导成棕色脂肪细胞后IRX3表达变化，发现IRX3 mRNA和蛋白表达水平都显著升高(图5A)。在3T3-L1细胞中敲低IRX3并进行棕色脂

肪细胞诱导分化，qPCR和Western blot检测细胞中IRX3的mRNA和蛋白表达水平以评估转染效率，结果表明，Lv-sh-IRX3敲低模型构建成功。进一步在体外对IRX3和RETSAT的关系进行验证，采用qPCR和Western blot检测RETSAT的蛋白表达水平，结果显示，成棕色脂肪诱导分化后RETSAT表达也上调。与Lv-NC组相比，IRX3敲低会明显下调RETSAT的蛋白水平(图5B)。最后采用Western blot检测脂肪细胞褐变相关标志物解偶联蛋白1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α、PR结构域蛋白16的表达水平，结果显示，成棕色脂肪诱导分化后，上述标志物表达显著上调。与Lv-NC组相比，IRX3敲低组解偶联蛋白1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α和PR结构域蛋白16的表达水平显著降低，表明脂肪细胞褐变受到抑制(图5C)。
为进一步验证IRX3通过RETSAT参与脂肪细胞褐变，在IRX3敲低细胞中进行RETSAT过表达的回复实验，3T3-L1脂肪前体细胞转染RETSAT过表达载体后进行诱导分化。qPCR和Western blot结果显示，与Lv-sh-NC组或Lv-sh-IRX3组相比，Lv-RETSAT成功增加了RETSAT的mRNA和蛋白水平，但对IRX3的表达无影响(图5D，E)。Western blot检测脂肪细胞褐变相关标志物，结果显示，Lv-RETSAT显著增加了解偶联蛋白1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α和PR结构域蛋白16的表达水平，脂肪细胞褐变水平增强(图5F)。综上所述，IRX3可能通过RETSAT参与脂肪细胞褐变。IRX3/RETSAT调控脂肪细胞褐变的功能也提示其可能通过促进脂肪细胞褐变发挥保护血管的功能。

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引言

血管损伤是动脉粥样硬化、高血压等多种心血管疾病的病理基础[1-2]，血管损伤的研究以往多聚焦于血管内皮细胞[3]。最近的研究表明血管周围脂肪组织功能障碍参与血管损伤[4-5]，如肾脏去神经支配通过调节血管周围脂肪组织减轻自发性高血压大鼠的血管重塑[6]。血管周围脂肪组织包围人体大部分血管，是一种脂肪组织库，由白色、米色和棕色脂肪组织组成[7]。据文献报道，高脂饮食等外界刺激会诱导棕色脂肪组织向白色亚型转化，释放炎症因子，导致血管损伤[8]。与之相反的是，血管周围脂肪组织褐变时，即由白色向棕色亚型转变，则有助于减轻炎症反应并促进血管重塑[9-10]，故而血管周围脂肪组织褐变可防止血管功能障碍进而限制高血压的发生。因此，促进血管周围脂肪组织褐变或为缓解血管损伤的有效策略。
易洛魁同源框基因3(iroquois homeobox gene 3，IRX3)是易洛魁同源框基因家族的转录因子。研究表明，IRX3在心血管疾病中具有保护作用[11-13]，且与脂肪组织紧密相关[14-15]，但作用机制尚不明确。研究发现，主动脉瓣狭窄患者经导管主动脉瓣植入术时，血液中IRX3甲基化水平高的患者生存率显著提高[11]。鉴于血管周围脂肪组织褐变在血管损伤中的潜在作用，推测IRX3的心血管保护可能与血管周围脂肪组织褐变相关。在此基础上，该研究借助生物信息学方法深入分析IRX3在血管损伤中的作用，揭示IRX3在血管损伤中调控血管周围脂肪组织褐变的潜在机制，为心血管疾病的研究提供新的视角和理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞实验和体内动物实验。
1.2 时间及地点实验于2024年9月至2025年1月在新疆医科大学实验室和新疆医科大学第五附属医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞小鼠前脂肪细胞系3T3-L1购买于武汉普诺赛生命科技有限公司，批号为CL-0006。
1.3.2 实验试剂与材料 BCA蛋白检测试剂盒、Trizol裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司；对照慢病毒及IRX3干扰慢病毒和视黄醇饱和酶(retinol saturase，RETSAT)过表达慢病毒购自湖南讴睿生物科技有限公司；IRX3(ab242133)、解偶联蛋白1(ab234430)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(ab313559)、PR结构域蛋白16(ab303534)、GAPDH(ab181602)抗体和HRP标记的羊抗兔二抗IgG(ab205718)购自美国Abcam公司；RETSAT抗体(PA5-147446)购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒PrimeScript™ RT Master Mix和快速qPCR试剂盒TB Green®Premix Ex Taq™ II FAST qPCR购自日本Takara公司。
1.4 生物信息学分析

1.4.1 单细胞测序数据分析从GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载血管周围脂肪组织相关单细胞测序数据集GSE275779[16]，包括正常和2型糖尿病大鼠血管周围脂肪组织的单细胞景观。使用Seurat 4.1.0加载单细胞RNA测序数据并进行质量控制和合并。对数据进行标准化、归一化，并获取高可变基因，进行主成分分析和批次效应去除。通过聚类分析和统一流形逼近与投影(uniform manifold approximation and projection，UMAP)降维可视化细胞类群。然后利用Find All Markers函数寻找差异表达基因并进行细胞类型注释。对差异表达基因进行基因本体(gene ontology，GO)或京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析。采用在线工具metascape (www.metascape.org)进行功能富集与绘图。最后将IRX3与血管周围脂肪组织中细胞亚群相结合，分析IRX3在不同细胞亚群中的丰度。细胞类型注释所用的标记基因见表1[17-19]。

1.4.2 IRX3在脂肪细胞相关芯片及高通量测序数据中的表达验证 GSE44059芯片包含12只小鼠白色脂肪细胞及基质血管部分和6只小鼠棕色脂肪细胞及基质血管部分基因表达数据谱。GSE7032芯片包含6只小鼠白色脂肪细胞和5只小鼠棕色脂肪细胞分化7 d
的表达数据谱[20]。GSE185518测序结果包含3例人多能干细胞呈棕色脂肪细胞分化前后以及3例人胚胎棕色脂肪组织的表达数据谱[21]。GSE168387测序数据包含多能干细胞和人胚胎干细胞在棕色脂肪诱导分化不同阶段(0-30 d)的mRNA表达谱[22]，其中0 d为未分化干细胞(undiff-stem cells)，2-4 d为中胚层期(Mesoderm stage)，8-12 d为棕色脂肪前体细胞，20-30 d为棕色脂肪细胞。筛选与IRX3表达具有显著相关性的基因(Pearson相关性筛选阈值r > 0.95，OR < -0.95，P < 0.05)并进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。功能富集采用在线工具metascape(www.metascape.org)绘制。
1.4.3 筛选IRX3的下游靶点为了探讨IRX3在棕色脂肪细胞分化过程中的下游靶点，从msigdb(https://www.gsea-msigdb.org/)得到IRX3的靶基因(IRX3_TARGET_GENES)。经GTRD-基因转录调控数据库(http://gtrd.biouml.org)鉴定，其中55个基因在其启动子区(TSS-1000，+100 bp)含有1个或多个IRX3蛋白结合位点。将IRX3的靶基因(IRX3_TARGET_GENES)与GSE168387所有样本表达数据中和IRX3表达具有显著相关性的基因(Pearson相关性筛选阈值r > 0.95，OR < -0.95，P < 0.05)取交集获得IRX3调控棕色脂肪细胞分化的潜在靶基因。将目的基因在GSE168387和GSE185518测序数据中进行验证。
1.5 实验方法
1.5.1 细胞培养及分化将3T3-L1脂肪前体细胞培养于完全培养基(DMEM+体积分数10%胎牛血清+1%双抗)并置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中。使用第3-9代3T3-L1脂肪前体细胞，细胞复苏后使用完全培养基进行扩增，当细胞汇合度达到90%左右，传代并以5×108 L-1细胞浓度接种于6孔板中，每孔2 mL，待细胞生长至完全汇合后，接触抑制2 d(细胞在现有培养条件下不再进行传代等操作，让细胞维持相互接触铺满孔底的状态持续2 d，以此实现接触抑制)，计为诱导分化0 d，分组加入棕色脂肪细胞诱导分化培养基(10 µg/mL胰岛素、0.25 µmol/L地塞米松、0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、50 nmol/L三碘甲状腺原氨酸和1 µmol/L罗格列酮)培养8-10 d，每2 d更换1次培养基，分化结束后收取细胞(棕色脂肪细胞)可用于后续分子学检测。
1.5.2 细胞分组和慢病毒感染
(1)分组一：将棕色脂肪细胞随机分为3组，分别为棕色脂肪细胞组、Lv-sh-NC组和Lv-sh-IRX3组。另设置未分化的3T3-L1细胞作为对照。棕色脂肪细胞组细胞正常培养，Lv-sh-NC组和Lv-sh-IRX3组细胞感染慢病毒。具体操作如下：收集1×106个3T3-L1细胞接种在6孔板中，当细胞汇合度达到80%左右时，将携带Lv-sh-IRX3和Lv-sh-NC序列的慢病毒感染细胞，其中慢病毒滴度为3×107 TU/mL，感染结束后在完全培养基中正常培养72 h后，用2 μg/mL嘌呤霉素筛选稳定感染的细胞，然后按照1.5.1方法进行棕色脂肪诱导分化。
(2)分组二：将棕色脂肪细胞随机分为4组，分别为Lv-sh-NC组、Lv-sh-IRX3组、Lv-sh-NC+Lv-RETSAT组和Lv-sh-IRX3+Lv-RETSAT组。具体操作参照分组一，将Lv-sh-IRX3和Lv-RETSAT慢病毒按照分组感染到3T3-L1细胞中，进行棕色脂肪细胞诱导分化并后续分子实验。

上述慢病毒构建引物序列信息见表2。

1.5.3 qPCR 按上述分组将棕色脂肪细胞诱导分化完成后，通过Trizol裂解液提取各组细胞中的总RNA，并使用紫外可见分光光度计通过检测A260/A280比值分析RNA的纯度和浓度，进一步进行反转录合成cDNA，加入Syber mix体系，加入引物后上机进行PCR扩增，GAPDH作为标准化对照。采用2-ΔΔCT方法计算相对表达水平，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列信息见表3。

1.5.4 Western blot 按上述分组将棕色脂肪细胞诱导分化完成后，用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液对各组细胞进行裂解，然后用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。蛋白(30 μg)用10% SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上，5% BSA室温封闭2 h后，分别加入适宜浓度的一抗IRX3、解偶联蛋白1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α、PR结构域蛋白16和RETSAT(稀释比例均为1∶1 000)，内参为GAPDH(稀释比例为1∶10 000)，4 ℃孵育过夜，洗膜后加入HRP标记的羊抗兔二抗IgG(稀释比例为1∶7 000)，室温孵育1 h，ECL工作液显影。用Image Pro Plus 6.0对Western blot图像中各组条带进行灰度定量，每次实验重复3次。
1.6 主要观察指标 ①生物信息学分析损伤血管周围脂肪组织褐变情况；②IRX3在脂肪细胞中的表达特异性及表达水平；③IRX3在脂肪褐变过程中的表达；④IRX3是否介导RETSAT参与血管周围脂肪组织褐变；⑤体外实验验证IRX3能否上调RETSAT参与脂肪细胞褐变。
1.7 统计学分析使用Graphpad 8.0软件对实验数据进行统计分析，实验数据以x±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用one-way ANOVA，事后采用Tukey’s multiple comparisons test，以P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过新疆医科大学统计学专家审核。

讨论

生活条件提升与生活方式多样化促使肥胖率急剧攀升。据研究报道，全球肥胖人口已超10亿，约占全球总人口的1/8[24]。2023年的统计数据显示，中国约有一半的成年人超重或肥胖[25]。肥胖极容易给血管造成负担，大量数据揭示超重与肥胖会增加心血管疾病的发病率及死亡率[26]。弗雷明汉心脏研究分析指出，体质量指数上升与心血管疾病风险呈正相关[27]。鉴于此，脂肪组织在心血管疾病中的角色日益受到科研人员的广泛关注。
血管周围脂肪组织是广泛分布于除脑血管外的血管周围的脂肪组织，约占全身脂肪组织质量的3%[28]，传统上认为其主要起机械支撑作用，但最新研究显示，血管周围脂肪组织在血管及内皮功能调节中起核心作用[29]。血管周围脂肪组织存在3种亚型：白色、米色和棕色，以白色亚型为主，负责储存三酰甘油，其积累与心脏代谢紊乱、高血压及心血管疾病风险增加相关[30]；米色和棕色表型含量较少，通过热能耗散维持体温，展现血管保护作用[31]。临床报告指出，携带产热性脂肪组织(米色和棕色)的个体高血压及冠状动脉疾病发病率较低[32]。进一步研究显示，血管周围脂肪组织具有可塑性，在冷暴露、β-肾上腺素等刺激下，白色表型可转变为米色，进而转化为棕色表型，此过程称为褐变[33]。现有的证据表明，血管周围脂肪组织褐变在多种血管疾病中发挥保护作用，如骨形态发生蛋白4过度表达可促进血管周围脂肪组织褐变，抑制炎症反应，预防动脉粥样硬化[34]；血管周围脂肪组织褐变还可维持抗收缩作用，改善内皮功能，降低高血压风险[35]。此研究通过分析公开的血管周围脂肪组织相关单细胞测序数据，发现棕色脂肪细胞相关因子PR结构域蛋白16、细胞死亡诱导DFFA样效应蛋白A和解偶联蛋白1等在糖尿病的血管周围脂肪组织中显著下调，说明脂肪褐变与糖尿病血管损伤密切相关，与之前所报道脂肪褐变与血管疾病关系的结论相符。
IRX3具有血管保护作用，特别是在促进血管生成方面[36]，同时它被认为是肥胖的调节因子，参与脂肪分解过程。在一项动物实验中观察到，与肥胖倾向小鼠相比，肥胖抵抗的小鼠体质量较低，肝脏脂质合成减少，白色脂肪组织分解增加；此外，肥胖抵抗小鼠表现出自发的血管周围脂肪组织褐变和较少的纤维化，且与IRX3高表达相关[37]。在后续的细胞实验中发现IRX3过表达促进了棕色脂肪细胞中产热相关基因的表达[38]。还有文献报道，IRX3通过直接结合解偶联蛋白1的启动子来增加解偶联蛋白1的转录活性以促进白色脂肪细胞褐变[39]。此研究通过GSE数据库中单细胞测序、高通量测序及mRNA芯片表达数据发现IRX3只在脂肪细胞中表达，且在糖尿病模型的血管周围脂肪组织中低表达，与棕色脂肪形成密切相关，揭示IRX3对血管的保护作用可能与血管周围脂肪组织褐变有关。
为深入探究IRX3促进血管周围脂肪褐变的功能机制，通过msigdb 和ChIP-seq数据库GTRD鉴定出IRX3的潜在下游靶点为RETSAT。利用GSE185518和GSE168387测序数据验证，发现RETSAT的mRNA表达水平随棕色脂肪细胞分化程度提升而呈现差异性上调。RETSAT是一种在细胞代谢中起重要作用的酶，主要功能是催化视黄醇，但研究多聚焦于肿瘤领域[40-41]，在少量的资料中发现RETSAT参与脂质代谢，在脂肪组织等代谢活跃器官中高表达，且RETSAT缺失会导致小鼠体质量增加及肥胖加剧[42]，同时，RETSAT可调节细胞对氧化应激的反应，并在脂肪生成和脂质积累中发挥关键作用[43]。这些证据均指出RETSAT在脂肪细胞中发挥重要的调节作用，也为IRX3介导RETSAT参与心血管损伤过程中的血管周围脂肪组织褐变这一假设提供了更加有力的支撑，然而IRX3与RETSAT的靶向调控关系目前尚无文献报道。基于此设计了一系列体外实验进行验证。实验结果显示，成棕色脂肪细胞诱导分化后，IRX3和RETSAT表达水平显著上升；敲低IRX3抑制了RETSAT及脂肪细胞褐变标志蛋白(解偶联蛋白1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α和PR结构域蛋白16)的表达，而在此基础上回复RETSAT的表达，能恢复脂肪细胞褐变标志蛋白水平，这不仅表明了IRX3与脂肪褐变之间存在紧密联系，且提示IRX3可通过调控RETSAT来影响脂肪褐变过程。从临床应用前景来看，鉴于IRX3调控RETSAT通路与糖尿病血管损伤相关，后续有望针对这一通路开发出干预糖尿病患者血管损伤的治疗策略，例如通过药物等手段调节该通路中关键靶点的活性，从而促进血管周围脂肪组织褐变，减轻血管损伤。此外，在脂肪细胞褐变的调控网络中，目前已知存在多条通路参与其中，IRX3调控RETSAT通路与其他已报道的脂肪细胞褐变通路之间可能存在协同或互补的关系[44]，进一步深入探究IRX3调控RETSAT通路与其他褐变通路之间的相互作用机制，将有助于更全面地理解脂肪褐变的整体调控网络，为心血管疾病的防治提供更多靶点和思路。
综上所述，通过生物信息学方法分析单细胞测序、高通量测序及mRNA芯片表达谱，观察到IRX3在糖尿病血管损伤的周围脂肪组织中表达下调，在棕色脂肪细胞分化过程中以及棕色脂肪组织中高表达，并且IRX3的下游靶点RETSAT同样参与棕色脂肪细胞分化。进一步体外实验表明，IRX3通过调控RETSAT恢复脂肪细胞褐变，改善血管损伤。然而，还存在一定局限性：数据来源依赖公开数据库，可能有偏差，影响结论准确性；研究方法中，生物信息学分析难以完全模拟体内真实情况，结果向实践转化需验证。不过，在心血管疾病研究领域仍具创新性。以往多单独研究IRX3对血管周围脂肪组织褐变的影响，此次聚焦二者内在联系及调控机制，整合多组学数据分析并体外验证，填补空白，这丰富了发病机制相关理论体系，为干预策略提供靶点和思路。总之，为IRX3在血管损伤中的潜在保护作用提供了新视角，特别是在血管周围脂肪组织褐变与血管损伤关联方面，为后续机制研究奠定了坚实基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

易洛魁同源盒基因3调控血管周围脂肪组织褐变改变血管损伤的潜在机制

Potential mechanism by which iroquois homeobox 3 regulates the browning of perivascular adipose tissue in vascular injury

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