筛选动脉粥样硬化线粒体功能障碍与铁死亡相关基因及调控的中药预测

doi:10.12307/2026.635

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (10): 2641-2652.doi: 10.12307/2026.635

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筛选动脉粥样硬化线粒体功能障碍与铁死亡相关基因及调控的中药预测

祁祥1，曹珊2，陈健1，张艺嘉3，刘珂珂2，徐子福1，刘往1，付晓霄1，殷晓磊1

河南中医药大学，1中医学院(仲景学院)，2医学院，3教务处，河南省郑州市 450046

收稿日期:2025-05-06 接受日期:2025-06-10 出版日期:2026-04-08 发布日期:2025-09-01
通讯作者: 曹珊，医学博士，教授，博士生导师，河南中医药大学医学院，河南省郑州市 450046
作者简介:祁祥，男，1997年生，河南省周口市人，汉族，河南中医药大学在读博士，主要从事中医药防治心脑血管疾病研究。
基金资助:
河南省自然科学基金项目(242300421295)，项目负责人：曹珊；崔应民全国名老中医药专家传承工作室建设项目(国中医药人教函[2022]75号)，项目负责人：曹珊；河南省科技攻关项目(232102310434)，项目负责人：曹珊；河南省中医药科学研究重大专项课题(2022ZYZD20)，项目负责人：曹珊；河南省中医药科学研究重点课题(2023ZY1031)，项目负责人：曹珊

Screening of genes related to mitochondrial dysfunction and ferroptosis in atherosclerosis and target prediction of regulatory traditional Chinese medicine

Qi Xiang1, Cao Shan2, Chen Jian1, Zhang Yijia3, Liu Keke2, Xu Zifu1, Liu Wang1, Fu Xiaoxiao1, Yin Xiaolei1

1College of Traditional Chinese Medicine (Zhongjing College), 2School of Medicine, 3Academic Affairs Office, Henan University of Chinese medicine, Zhengzhou 450046, Henan Province, China

Received:2025-05-06 Accepted:2025-06-10 Online:2026-04-08 Published:2025-09-01
Contact: Cao Shan, MD, Professor, Doctoral supervisor, School of Medicine, Henan University of Chinese medicine, Zhengzhou 450046, Henan Province, China
About author:Qi Xiang, PhD candidate, College of Traditional Chinese Medicine (Zhongjing College), Henan University of Chinese medicine, Zhengzhou 450046, Henan Province, China
Supported by:
Henan Provincial Natural Science Foundation, No. 242300421295 (to CS); National Famous Traditional Chinese Medicine Experts Inheritance Studio Construction Project, No. [2022]75 (to CS); Henan Provincial Science and Technology Research Project, No. 232102310434 (to CS); Major Special Project of Henan Traditional Chinese Medicine Scientific Research, No. 2022ZYZD20 (to CS); Key Project of Henan Traditional Chinese Medicine Scientific Research, No. 2023ZY1031 (to CS)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
动脉粥样硬化：是一种以大、中动脉血管脂质沉积最终形成斑块为病理特征的一类慢性疾病，是心血管疾病的病理基础。动脉粥样硬化发病常伴随着慢性炎症、脂质积聚和免疫功能紊乱等复杂病理表现。近年来的研究发现，线粒体功能障碍和铁死亡广泛参与了动脉粥样硬化的发病。
线粒体功能障碍：指线粒体在能量代谢、氧化还原平衡、细胞信号传导等方面的异常，最终可导致细胞功能受损。线粒体功能障碍与动脉粥样硬化发病密切相关，可通过介导铁死亡、氧化应激、炎症反应等途径参与到动脉粥样硬化的疾病发展。

背景：线粒体功能障碍和铁死亡广泛参与了动脉粥样硬化的发病，研究动脉粥样硬化发病过程中线粒体功能障碍与铁死亡相关生物标志物对该病的诊断与治疗具有重要意义。
目的：基于生物信息学和机器学习算法，探究动脉粥样硬化发病过程中线粒体功能障碍与铁死亡相关生物标志物，并预测潜在调控中药。
方法：从GEO数据库(由美国国立生物技术信息中心于2000年开发的基因表达数据库，收录并整理了全球研究机构和科研工作者提交的基因表达数据)获取动脉粥样硬化疾病数据集GSE100927，并筛选差异表达基因，基于差异基因开展免疫浸润分析。利用加权基因共表达网络分析(WGCNA)获得动脉粥样硬化相关的关键模块基因，将关键模块基因与线粒体功能障碍基因、铁死亡基因以及差异表达基因取交集，基于交集基因对疾病组数据共识聚类分析，鉴定每个聚类亚型之间的差异基因。对差异基因进行富集分析，基于最小绝对收缩和选择算子与随机森林等机器学习方法筛选Hub基因。进一步使用RAW264.7细胞构建动脉粥样硬化细胞模型，基于qPCR对Hub基因进行验证，使用数据库进行Hub基因调控的中药预测。
结果与结论：①将差异表达基因、WGCNA模块基因，线粒体功能和铁死亡特征基因取交集得到5个交集基因，基于这5个基因进行共识聚类分析得到2个亚型，亚型之间的差异分析得到994个线粒体功能与铁死亡相关亚型差异表达基因。通过2种机器算法预测出3个Hub基因，分别为DMTN、FCGR3A与MGST1，结合细胞实验验证后发现DMTN、MGST1可能具有较高的诊断价值。中药预测结果显示，当归、肉桂等中药可能是DMTN、MGST1的调控中药。②结果表明，DMTN、MGST1基因对动脉粥样硬化有一定诊断价值，还可作为动脉粥样硬化发病过程中线粒体功能障碍与铁死亡相关的特征基因，当归、肉桂等中药作为调控以上基因的药物具有一定研究潜力。
https://orcid.org/0009-0005-5845-1431(祁祥)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 生物信息学, 机器学习, 动脉粥样硬化, 线粒体功能障碍, 铁死亡, 免疫细胞, 中药

Abstract: BACKGROUND: Mitochondrial dysfunction and ferroptosis are widely involved in the development of atherosclerosis. Research on biomarkers related to mitochondrial dysfunction and ferroptosis in atherosclerosis is important for disease diagnosis and treatment.
OBJECTIVE: To investigate mitochondrial dysfunction- and ferroptosis-related biomarkers in the pathogenesis of atherosclerosis using bioinformatics and machine learning algorithms, and to predict potential regulatory traditional Chinese medicines (TCMs).
METHODS: The atherosclerosis dataset GSE100927 was obtained from the GEO database (which is the gene expression database, developed by the National Center for Biotechnology Information in 2000, collects and organizes gene expression data submitted by research institutions and scientists worldwide), and differentially expressed genes were identified, followed by immune infiltration analysis. Weighted correlation network analysis (WGCNA) identified atherosclerosis-related module genes. These module genes were intersected with mitochondrial dysfunction genes, ferroptosis genes, and differentially expressed genes. Consensus clustering analysis was performed on the disease group data based on the intersected genes, and differentially expressed genes between the clusters were identified. Enrichment analysis of the differentially expressed genes was conducted. Hub genes were screened using machine learning algorithms, including the least absolute shrinkage and selection operator (LASSO) and random forest. An atherosclerosis cell model was constructed using RAW264.7 cells, and hub genes were validated through qPCR. Finally, databases were used to predict TCMs regulating the Hub genes.
RESULTS AND CONCLUSION: Five intersected genes were identified by intersecting differentially expressed genes, WGCNA module genes, and mitochondrial dysfunction- and ferroptosis-related genes. Consensus clustering analysis based on these five genes identified two subtypes. Differential analysis between the subtypes revealed 994 subtype-specific differentially expressed genes related to mitochondrial dysfunction and ferroptosis. Three hub genes, dematin actin binding protein (DMTN), Fc gamma receptor IIIa (FCGR3A), and microsomal glutathione S-transferase 1 (MGST1), were predicted using two machine learning algorithms. Experimental validation suggested that DMTN and MGST1 have significant diagnostic values. TCM prediction results indicated that Angelica sinensis and cinnamon may regulate DMTN and MGST1. To conclude, DMTN and MGST1 have diagnostic values and can serve as characteristic genes related to mitochondrial dysfunction and ferroptosis in atherosclerosis. TCMs such as Angelica sinensis and cinnamon have potential as regulators of these genes and warrant further research.

Key words: bioinformatics, machine learning, atherosclerosis, mitochondrial dysfunction, ferroptosis, immune cells, traditional Chinese medicines

中图分类号:

祁祥, 曹珊, 陈健, 张艺嘉, 刘珂珂, 徐子福, 刘往, 付晓霄, 殷晓磊. 筛选动脉粥样硬化线粒体功能障碍与铁死亡相关基因及调控的中药预测[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(10): 2641-2652.

Qi Xiang, Cao Shan, Chen Jian, Zhang Yijia, Liu Keke, Xu Zifu, Liu Wang, Fu Xiaoxiao, Yin Xiaolei. Screening of genes related to mitochondrial dysfunction and ferroptosis in atherosclerosis and target prediction of regulatory traditional Chinese medicine[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(10): 2641-2652.

图/表（结果） 15

2.1 差异表达基因的识别通过对动脉粥样硬化数据集进行差异分析后获得2 289个差异表达基因，其中992个基因表达下调，由此推测这些基因在动脉粥样硬化病理进程中受到了抑制；1 296个基因表达上调，反映了这些基因在动脉粥样硬化病理进程中可能被激活，进一步绘制了火山图和热图，见图1。
2.2 免疫浸润细胞分析免疫浸润分析结果表明，疾病组和正常组之间静息树突状细胞、M0巨噬细胞、活化肥大细胞、静息肥大细胞、单核细胞、中性粒细胞、活化CD4+记忆T细胞、CD8+ T细胞、γδT细胞浸润水平存在显著差异(P < 0.05)，见图2，表明以上9种免疫细胞可能在动脉粥样硬化的病理进程中发挥着一定作用。
2.3 加权基因共同表达网络的构建基于加权基因共表达网络分析GSE100927数据集基因与免疫细胞的相关性，样本聚类后先剔除2个离群样本，见图3A。将软阈值β设置为10，最终鉴定出11个目标模块，见图3B-D。通过热图展示出每个模块和免疫细胞的相关性，结果发现绿色模块与Mast.cells.activated高度正相关(r=0.53，P=8×10-9)，黑色模块与B.cells.memory高度正相关(r=0.54，P=8×10-9)，青绿色模块与Macrophages.M0高度正相关(r=0.79，P=2×10-22)，见图3E。将以上3 760个模块基因与线粒体功能障碍相关基因、铁死亡相关基因以及差异表达基因取交集获取5个关键基因，分别为BID、BAX、COX7A1、 LYRM1与MGST1，见图4A。
2.4 亚型基因的差异表达分析基于5个线粒体功能障碍与铁死亡相关差

异基因，使用共识聚类算法进行无监督聚类分析，以期识别与动脉粥样硬化疾病组相关的亚型基因，见图4B-E。结合累积分布函数图可以看到聚类簇k值被设置为9，此次研究选取k=2作为聚类结果；结合共识矩阵的热图可以看到k=2时具有清晰明确的分类边界，因此将疾病组的69个动脉粥样硬化样本分为A亚型和B亚型。基于A与B两种亚型基因进行差异分析，最终获取994个线粒体功能与铁死亡相关的亚型差异表达基因，并绘制火山图，见图5A。
2.5 差异表达基因富集分析 994个线粒体功能与铁死亡相关亚型差异表达基因的GO富集分析结果显示，动脉粥样硬化病变涉及白细胞介导的免疫、细胞活化的正调控、白细胞趋化性、肌动蛋白细胞骨架、内吞囊泡、肌动蛋白结合、免疫受体活性、整合素结合、模式识别受体活性等生物学过程，见图5B；KEGG富集分析显示，动脉粥样硬化病变过程中涉及B细胞受体信号通路、脂质与动脉粥样硬化、Rap1信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、Toll样受体信号通路、核因子κB信号通路、缺氧诱导因子1信号通路、钙信号通路、铁死亡、趋化因子信号通路、胞葬、Th1和Th2细胞分化，见图5C；GSEA分析显示以上基因与铁死亡信号通路，缺氧诱导因子1信号通路，NOD样受体信号通路，过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路的上调有关，与Wnt信号通路的下调有关，由此推测线粒体功能障碍和铁死亡可能受到以上信号通路的调控，并参与到动脉粥样硬化病变过程，见图5D。
2.6 机器学习模型的构建与验证 LASSO回归分析鉴定出59个特征基因，Random Forest鉴定出25个基因，两种算法取交集获得3个诊断生物标志物，分别为DMTN、FCGR3A与MGST1，见图6。基于“rms”包构建动脉粥样硬化诊断列线图，利用校准曲线评估该诊断模型，结果显示患病风险与预测患病风险之间的差异较小，表明该模型预测动脉粥样硬化的发病较为准确，见图7A，B。决策曲线分析结果表明，DMTN、FCGR3A和MGST1曲线在阈概率为0-0.5时净获益率较大，验证集分析结果也证实了以上结论，见图7C，D。受试者工作特征曲线评估结果表明DMTN、FCGR3A和MGST1的曲线下面积值均高于0.7，验证集数据也验证了该结果，见图7E，F。这进一步证明列线图模型可以对早期动脉粥样硬化患者具有较好的诊断能力。
2.7 核心基因的GSEA分析与相关性分析 DMTN、FCGR3A和MGST1基因在疾病组和对照组中的表达量，见图8A-C。GSEA分析发现， DMTN基因低表达时，Wnt信号通路和转化生长因子β信号通路呈现出上调趋势，铁死亡信号通路、NOD样受体信号通路与过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路呈现出下调趋势；FCGR3A基因高表达时，Wnt信号通路与转化生长因子β信号通路为下调趋势，铁死亡信号通路、NOD样受体信号通路与过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路则为上调趋势；MGST1基因低表达时，Wnt信号通路，转化生长因子β信号

通路、铁死亡信号通路和过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路为上调趋势，NOD样受体信号通路则会下调趋势，见图8D-F。
相关性分析显示，FCGR3A基因与M0巨噬细胞(r=0.74)显著正相关，与活化肥大细胞(r=-0.57)显著负相关；DMTN基因与M0巨噬细胞(r=-0.54)显著负相关，与中性粒细胞(r=0.28)显著正相关；MGST1基因与M0巨噬细胞(r=-0.42)显著负相关，与单核细胞(r=0.48)显著正相关，见图8G。Hub基因与线粒体功能障碍铁死亡相关差异基因相关性分析发现，FCGR3A与BID基因(r=0.87)显著正相关，与COX7A1基因(r=-0.76)显著负相关；DMTN与BID基因(r=-0.71)显著负相关，与COX7A1基因(r=-0.70)显著正相关；MGST1与LYRM1基因(r=0.46)显著正相关，与BID基因(r=-0.26)显著负相关，见图8H。
2.8 动脉粥样硬化核心基因在细胞模型中的表达油红O染色结果显示，与对照组相比，模型组细胞体积有所增大，并出现脂质沉积、细胞泡沫化的病理现象，表明动脉粥样硬化细胞模型构建成功，见图9A，B。qPCR检测结果表明，与对照组相比，模型组RAW264.7细胞中DMTN、MGST1基因表达量显著下降(P < 0.05)，FCGR3A基因表达量无明显变化(P > 0.05)，见图9C-E。
2.9 调控中药预测结果此次研究基于DMTN、MGST1预测得到当归、肉桂等16味中药，见表2。经过进一步分析发现以上药物四气以温、平为主，五味以甘、苦味为主，归经主归心经、肝经，见图9F-H。功效分析发现以上药物功效以行气活血、温中补虚为主。

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引言

动脉粥样硬化是一种以大、中动脉血管脂质沉积最终形成斑块为病理特征的一类慢性疾病，是心血管疾病的病理基础[1]。动脉粥样硬化脂质斑块形成后，由于管腔狭窄可能导致血压异常以及心肌缺血等并发症；此外，斑块破裂还可诱发急性心肌梗死、心力衰竭和脑卒中等急性心脑血管事件[2]。研究发现，线粒体功能障碍广泛参与了动脉粥样硬化的发病，内皮细胞线粒体功能障碍会导致活性氧积累、能量应激和细胞死亡，在动脉粥样硬化发病中起着核心作用[3]。线粒体受损时能量供应会受到限制，并产生大量的活性氧[4]，活性氧的累积与凋亡因子释放则会介导氧化应激损伤，加重动脉粥样硬化病变[5]。铁死亡是一种新型细胞死亡形式，有研究发现铁死亡与动脉粥样硬化的发病有诸多关联[6]。铁死亡的主要特征是线粒体形态的改变，包括线粒体膜变得致密并伴随体积变小以及外膜破裂和线粒体嵴的减少或消失[7]。现阶段，线粒体功能障碍与铁死亡在动脉粥样硬化中作用机制的研究尚显不足，因此，结合生物信息学分析和机器学习方法从靶向调控线粒体功能以及铁死亡的角度探索动脉粥样硬化的生物标志物具有一定的意义。
中医药可通过多靶点、多机制发挥改善线粒体功能障碍和调节铁死亡的作用，在动脉粥样硬化的治疗中发挥积极作用[8-11]，基于调控线粒体功能与铁死亡途径探索防治动脉粥样硬化的中药具有一定研究价值。近年来，生物信息学分析方法和机器学习算法被广泛用于揭示疾病的关键生物标志物[12]，此次研究整合生物信息学、机器学习与实验验证等多学科方法，探究动脉粥样硬化发病过程中线粒体功能障碍与铁死亡之间的联系，预测出关键基因并进行体外实验验证，以期为寻找动脉粥样硬化诊断及治疗靶点提供参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1 资料和方法 Data and methods
1.1 设计通过生物信息学结合机器学习分析动脉粥样硬化线粒体功能障碍与铁死亡相关基因，并进行体外实验验证。
1.2 时间及地点实验于2024年8-12月在河南中医药大学龙子湖校区完成。
1.3 资料 GEO数据库是由美国国立生物技术信息中心于2000年开发的基因表达数据库，收录并整理了全球研究机构和科研工作者提交的基因表达数据。研究基于GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中以“Atherosclerosis”为检索词筛选数据集，物种设置为 “Homo sapiens”，实验类型为“Expression profiling by array”，最后检索到GPL17077平台的GSE100927数据集。数据集来自转录组测序实验，包含了104份取动脉的组织样本，其中69例动脉粥样硬化的疾病组与35例无动脉粥样硬化病变的对照组。由于该数据集样本量相对较大，样本分组与采集较为合理，筛选动脉粥样硬化生物标志物的结果较为可靠，因此基于该数据集进行生物信息学分析。患者和对照组按照7∶3的比例被随机分为训练集和验证集，并进行疾病诊断模型构建。以“limma”包的Normalize Between Arrays函数对数据进行Quantile归一化处理，基于MitoCarta 3.0数据库(https://www.broadinstitute.org/)筛选线粒体特征基因，该数据库由美国博德研究所(Broad Institute)开发，主要用于鉴定和整理哺乳动物线粒体相关基因[13]。铁死亡基因来自FerrDb数据库(http://www.zhounan.org/ferrdb/current/)，该数据库为广州医科大学附属脑科医院和四川大学于2020年合作发布，是第一个整理铁死亡调节因子和疾病关系的数据库[14]。
1.4 方法
1.4.1 筛选差异表达基因此次研究使用R软件(版本号4.3.0)开展所有分析，分析鉴定出GSE100927中的差异表达基因后，以log FC的绝对值≥0.3和P-value < 0.05为标准筛选关键差异表达基因，最后基于“pheatmap”和“ggplot2”包绘制差异表达基因的火山图和热图。
1.4.2 差异基因的免疫浸润细胞分析使用R语言“CIBERSORT”包对差异表达基因数据集进行免疫浸润分析，并量化不同免疫模式个体中22种免疫细胞类型的丰度，采用Wilcoxon秩和检验评估免疫细胞比例的差异，P < 0.05视为差异有显著性意义，基于“ggplot2”包对结果进行可视化分析。
1.4.3 加权基因共表达网络分析加权基因共表达网络分析(Weighted correlation network analysis，WGCNA)可用于寻找高度相关的基因聚类模块[15]。此次研究基于“WGCNA”包对数据集进行分层聚类，剔除离群样本后确定软阈值并建立无尺度网络与拓扑重叠矩阵，再计算每个模块基因与免疫细胞的相关性，最终选取高相关系数的模块基因与线粒体功能障碍基因、铁死亡基因及差异表达基因取交集，进行下一步分析。
1.4.4 基因的共识聚类分析基于5个线粒体功能与铁死亡相关差异基因，使用“ConsensusClusterPlus”包对GSE100927数据集疾病组基因表达进行无监督聚类数据分析，分析出亚型的理想k值。采用“Limma” 包分析不同聚类簇间的差异表达基因，参数设置为logFC的绝对值≥0.5和P-value < 0.05，使用“ggplot2”包将结果进行可视化。
1.4.5 亚型基因富集分析基于R包“cluster Profiler”对差异表达基因进行基因本体(Gene Ontology，GO)分析，京都基因和基因百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)分析以及基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis，GSEA)，对富集分析结果进行可视化。
1.4.6 诊断性模型的构建与验证基于“glmnet”包，运用最小绝对收缩和选择算子(least absolute shrinkage and selection operator，LASSO)回归与随机森林方法筛选基因，将筛选后的特征基因进行相交鉴定出Hub基因。基于Hub基因构建诊断模型后，使用校准曲线来评估诊断模型预测能力，采用决策曲线来评价该模型的应用价值，用受试者工作特征曲线评价模型预测准确性。
1.4.7 核心基因的基因集富集分析与相关性分析分析Hub基因的表达量，基于疾病组Hub基因的表达进行GSEA分析，使用Pearson相关性分析研究Hub基因与免疫细胞和线粒体功能障碍铁死亡相关基因的关联性(P值参数设置为P < 0.01)。
1.4.8 调控中药预测核心基因潜在调控中药使用Coremine Medical (https://www.coremine.com/)和本草组鉴(http://herb.ac.cn/)数据库进行检索。将检索到的中药根据《中国药典》2020年版对名称进行规范化，未收录的中药不进行统计，再结合《中国药典》进一步分析其四气、五味、归经及功效。
1.4.9 体外细胞实验巨噬细胞RAW264.7购于武汉赛维尔生物科技有限公司，编号：STCC20020P。巨噬细胞泡沫化是动脉粥样硬化病变的标志之一，巨噬细胞RAW264.7常用于建立巨噬泡沫细胞模型，因此，研究选用该细胞构建动脉粥样硬化体外模型[16]。
细胞培养与分组：使用专用培养基(Servicebio公司，批号：GA241101)培养RAW264.7细胞，置于恒温无菌细胞培养箱(37 ℃、体积分数5% CO2)中。将RAW264.7细胞均匀接种于24孔板内，细胞密度为1×105/孔，分2组培养：模型组加入50 μg/mL氧化低密度脂蛋白(奕元生物，批号：YB002)干预24 h构建动脉粥样硬化细胞模型[17]，对照组不施加干预，每组设复孔3个。
细胞油红O染色：干预24 h后，用预冷的PBS洗涤1次，加入40 g/L多聚甲醛固定10 min，使用油红O染色试剂盒(Beyotime公司，批号：Z907240905)按照说明书配制油红O染色液，根据流程进行染色操作。
qPCR分析：干预24 h后，用PBS清洗细胞3次，使用RNA提取液(Servicebio公司，批号：CR2406057)提取细胞总RNA，检测RNA浓度和纯度。使用反转录试剂盒(Vazyme公司，批号：7E1981F4)合成cDNA，使用 ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix
(Vazyme公司，批号：Q711-02)进行qPCR实验，反应条件为：预变性95 ℃ 30 s，1个循环；变性95 ℃10 s，退火延伸60 ℃ 30 s，40个循环，实验重复3次。以GAPDH作为内参基因，各基因的引物序列见表1，使用2-ΔΔCt法计算出各基因的相对表达量。

1.5 主要观察指标数据集差异表达基因的生物信息学分析结果，关键基因的潜在调控中药预测以及qPCR实验验证关键基因在动脉粥样硬化细胞

模型的相对表达量。

1.6 统计学分析基于GraphPad Prism 9.5软件进行统计学分析，两组间的比较采用非配对t检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。该文统计学方法已经河南中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

现阶段，全球动脉粥样硬化患者数量逐年增长，并且有年轻化趋势，该病造成的并发症给患者造成了巨大负担[18]。动脉粥样硬化疾病进程与线粒体功能障碍和铁死亡密切相关[19]；此外，动脉粥样硬化患者发病时会出现外周血免疫成分的变化，这些变化反映着疾病的病情，因此，探索疾病监测的生物标志物以及潜在治疗靶点是该领域研究的热点[20]。
此次研究鉴定出5个线粒体功能与铁死亡相关特征基因，基于以上基因使用共识聚类算法进行了无监督聚类分析，识别与动脉粥样硬化相关的亚型，对994个亚型差异基因进行富集分析，GO分析结果显示动脉粥样硬化涉及免疫系统与肌动蛋白，既往研究已发现免疫细胞与免疫相关基因参与了动脉粥样硬化进程[21]，由肌动蛋白组成的细胞骨架与血管收缩、细胞增殖、形态维持、细胞分裂等过程有关，在高血压、动脉粥样硬化等血管病理性重构过程中扮演重要角色[22]。富集分析与GSEA分析显示，线粒体功能与铁死亡相关基因不仅同样与免疫炎症相关通路有关，还可能与代谢相关通路以及氧化应激相关通路相关。例如，缺氧诱导因子1α可通过直接靶向线粒体来防止氧化应激诱导的细胞凋亡[23]，通过激活缺氧诱导因子1信号通路可改善线粒体功能，降低活性氧含量，抑制铁死亡和细胞凋亡，发挥治疗动脉粥样硬化的作用[24]。过氧化物酶体增殖物激活受体是一类可调节脂质代谢相关基因的配体激活转录因子，过氧化物酶体增殖物激活受体α作为其亚型之一在心脏和血管壁中高表达[25]。激活过氧化物酶体增殖物激活受体α通路可减轻线粒体DNA损伤引发的自噬依赖性铁死亡，并减轻高脂血症介导的血管钙化[26]。以上研究对探索动脉粥样硬化的发病机制有一定的启示意义。
近年来，机器学习在临床领域得到了广泛应用[27]。此次研究基于LASSO和随机森林两种机器学习算法筛选得到DMTN、FCGR3A、MGST1，结合qPCR实验发现DMTN与MGST1在对照组与模型组之间差异表达显著，而FCGR3A无差异表达，因此推测DMTN与MGST1有潜力作为预测动脉粥样硬化的生物标志物。目前关于DMTN与动脉粥样硬化发病机制的报道较少，相关性分析发现DMTN与COX7A1、BID基因显著相关。COX7A1可通过增强三羧酸循环和线粒体电子传递链中复合物IV的活性，进一步增加肺癌细胞对半胱氨酸剥夺诱导的铁死亡敏感性，这对探索动脉粥样硬化的干预靶点有一定的启示[28]。WEI等[29]发现，豨莶草水提取物可通过调节COX7A的表达改善心脏缺血再灌注损伤，该过程与减轻活性氧介导的氧化应激损伤和恢复线粒体功能有关[30]。
BID基因可将铁死亡与线粒体损伤联系起来，通过抑制BID可保证线粒体功能的完整性、抑制铁死亡 [31]。亦有研究发现，Fas细胞表面死亡受体可通过激活BID抑制脂肪酸氧化，而抑制小鼠BID可使其免受Fas介导的线粒体氧化应激损伤和肝脂肪变性，而非酒精性脂肪肝是最常见的代谢紊乱之一，与肥胖、2型糖尿病和动脉粥样硬化发病密切相关[32]。因此，后续可基于此探索动脉粥样硬化发病过程中DMTN基因对线粒体功能障碍与铁死亡的影响。研究表明，内皮细胞氧化应激诱导的线粒体膜通透性改变参与到细胞死亡调控，这进一步导致血管内皮功能损伤及动脉粥样硬化病变[33]。而线粒体内膜中的MGST1可以与线粒体膜通透性转换调节蛋白相互作用，参与线粒体介导的细胞死亡，高表达MGST1还可改善细胞中大量活性氧产生导致的氧化应激损伤[34]。KUANG等[35]发现MGST1是铁死亡的负向调节因子，有望成为抑制肿瘤细胞铁死亡的关键靶点。总之，DMTN与MGST1作为动脉粥样硬化病变中线粒体功能障碍与铁死亡特征基因具有一定研究潜力。
差异表达基因的免疫浸润分析显示，动脉粥样硬化疾病组与对照组之间多种免疫细胞存在差异，关键基因DMTN、MGST1与单核细胞、M0巨噬细胞、中性粒细胞有一定的相关性。单核细胞是免疫系统的重要组成部分，可在先天性和适应性免疫反应中充当免疫效应细胞，单核细胞衍生的巨噬细胞在炎症反应、胆固醇代谢和泡沫细胞形成中发挥着关键作用，而线粒体生物发生和能量代谢是调节单核细胞炎症状态的关键[36]。巨噬细胞中的线粒体载脂蛋白A-I结合蛋白可通过调节线粒体自噬和巨噬细胞极化来发挥抗动脉粥样硬化作用[37]。亦有研究发现，调控谷胱甘肽过氧化酶4信号通路可抑制巨噬细胞铁死亡，从而延缓动脉粥样硬化进展[38]。中性粒细胞胞外诱捕网是中性粒细胞响应炎症和病原体刺激时释放染色质和颗粒物形成的网状细胞外结构，与动脉粥样硬化发病密切相关[39]。阿霉素诱导的中性粒细胞胞外诱捕网可通过介导心肌细胞铁死亡，进而导致心肌损伤[40]。
综合以上分析可推测，靶向线粒体与铁死亡基因调控免疫细胞可能对动脉粥样硬化的治疗具有一定意义。
当前中药治疗动脉粥样硬化的研究日益广泛，此次研究基于关键基因预测得到当归、肉桂等16味中药，分析发现以上药物四气以温、平为主，五味以甘、苦味为主，归经主归心经、肝经。动脉粥样硬化归属于中医学“脉痹”的范畴，寒邪乃是其病因之一。寒性收引，易使血管直径变窄、血流速度减慢，加重动脉粥样硬化病变，因此应用温性药治疗该病具有一定可行性[41]。甘味药能补能缓，苦味药能泄能燥。有研究认为动脉粥样硬化的发病机制乃是“络虚毒损”，以扶正、解毒方法治疗该病乃是可行思路[42]。中医学认为“心主血脉”“肝主疏泄、主藏血”，正常生理状态下肝脏可助心脉气血通畅，而心脉得通，气血滋养周身又可使肝受濡养，肝气得畅。正如《明医杂著·医论》所云：“肝气通则心气和，肝气滞则心气乏，此心病先求于肝，清其源也”。因此，治疗动脉粥样硬化的中药应当归属心经、肝经[43]。研究还发现以上药物功效以行气活血、温中补虚为主，未来研究可深入探索这些中药在动脉粥样硬化治疗中的意义。
综上，此次研究结合生物信息学分析与实验验证发现，DMTN、MGST1有潜力成为动脉粥样硬化的生物标志物以及疾病进程中线粒体功能障碍与铁死亡相关的特征基因，研究还筛选了对以上基因可能具有潜在调控作用的中药，这对探索该疾病的潜在治疗药物具有一定意义。然而，文章数据来源为GEO数据库，存在研究纳入的样本量小、数据库预测中药的可靠性不足等局限性，未来研究应当进一步纳入更多临床样本，以增强分析结果的可靠性，还应开展动物实验深入探索DMTN与MGST1在动脉粥样硬化病变中的发挥的作用，进一步研究线粒体功能障碍和铁死亡与该疾病的联系。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

筛选动脉粥样硬化线粒体功能障碍与铁死亡相关基因及调控的中药预测

Screening of genes related to mitochondrial dysfunction and ferroptosis in atherosclerosis and target prediction of regulatory traditional Chinese medicine

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