2.1   空白自组装胶束和载药自组装胶束的特性表征结果   空白自组装胶束和载药自组装胶束的平均粒径分别为(159.28±1.96) nm和(176.27±5.23) nm，载药后自组装胶束平均粒径显著增加(P < 0.01)，见图1A。空白自组装胶束和载药自组装胶束的多分散系数分别为0.21±0.06和0.23±0.02，Zata电位分别为(-15.87±0.32) mV和(-25.67±0.98) mV，载药自组装胶束的Zata电位绝对值显著增加(P < 0.01)，见图1B。两种胶束的稳定性评价结果显示，随着时间的延长，空白自组装胶束和载药自组装胶束的粒径有轻微增加，表现出可控的稳定性，同时两胶束的多分散系数无显著变化，但同时间下空白自组装胶束的多分散系数高于载药自组装胶束(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001)，见图1C，D，表明载药自组装胶束具有更稳定的体系。透射电镜下可见空白自组装胶束及载药自组装胶束均呈分布均一的规则球状，见图1E，F。载药自组装胶束中氨甲环酸和二甲双胍的质量浓度分别为(20.03±0.12)，(6.67±0.08) mg/mL，氨甲环酸和二甲双胍的载药量分别为(19.97±0.12)%，(6.65±0.08)%。



2.2   载药自组装胶束的体外经皮释放性能检测结果   通过Franz扩散池和小鼠皮肤对载药自组装胶束的体外经皮渗透性能进行评价，结果见图2所示。载药自组装胶束单位皮肤面积的活性成分累计透皮量随透皮时间延长而升高，24 h时载药自组装胶束中氨甲环酸和二甲双胍单位皮肤面积的累计透皮量分别是氨甲环酸溶液和二甲双胍溶液的2.9倍(P < 0.01)和1.6倍(P < 0.05)，见图2A，B；载药自组装胶束内活性成分的稳态透皮速率和皮肤内贮留量也显著增加，载体中氨甲环酸和二甲双胍的稳态透皮速率分别是氨甲环酸溶液的4.2倍(P < 0.01)和二甲双胍溶液的1.3倍(P < 0.05)，见图2C，D；载体中氨甲环酸和二甲双胍在皮肤内的贮留量分别是氨甲环酸溶液和二甲双胍溶液的1.5倍(P < 0.001)和1.3倍(P < 0.001)，见图2E，F。



2.3   载药自组装胶束的荧光模型药物渗透评价结果   在荧光显微镜下观察罗丹明B标记载药自组装胶束对猪耳脱毛区域皮肤的渗透情况，通过对皮肤纵切图观察可知，罗丹明 B溶液和罗丹明B标记自组装胶束溶液均在皮肤表层及附属器官(如毛囊)内有荧光聚集，见图3A；通过对皮肤横切图观察可知，罗丹明 B溶液荧光仅渗透到10-100 μm的皮肤浅层部位，而罗丹明B标记自组装胶束溶液渗透扩散至皮下400 μm以下的深层区域，展现出对皮肤的良好渗透性能，见图3B。



2.4   载药自组装胶束的生物安全性评价结果   通过MTT检测得出，使用不同质量浓度空白自组装胶束作用于B16F10细胞和L929细胞后，两种细胞存活率最低分别为(91.8±6.6)%和(90.3±0.8)%，见图4A，B。使用不同质量浓度载药自组装胶束、二甲双胍溶液和氨甲环酸溶液分别作用于B16F10细胞后，50-250 μg/mL载药自组装胶束溶液组细胞存活率均高于80%，500 μg/mL载药自组装胶束组呈现轻微细胞毒性，细胞存活率为75%，见图4C，说明空白自组装胶束和一定质量浓度载药自组装胶束对于L929细胞和B16F10细胞具有良好的生物安全性。溶血实验结果显示，离心后阴性对照组中红细胞在离心管内形成沉淀，阳性对照组中红细胞在纯化水中破裂，离心后未分层；在50-500 μg/mL载药自组装胶束溶液中的红细胞经离心后在血液中发生分层，上层溶液无明显血红色，各样品溶血率均小于1.1%，故可视为无溶血风险，见图4D。
2.5   载药自组装胶束对B16F10细胞黑色素含量及酪氨酸酶活性影响的检测结果   B16F10细胞在培养过程中能分泌黑色素，各组B16F10细胞孵育后黑色素含量检测结果，见图4E所示。与空白对照组比较，氨甲环酸溶液和二甲双胍溶液作用后细胞黑色素含量均显著下降(P < 0.05)，证实两种活性物质均能影响B16F10细胞黑色素的生成[19-20]；药物物理混合组对B16F10细胞黑色素分泌的抑制作用显著强于氨甲环酸组和二甲双胍组(P < 0.01)，说明两种活性物质联合使用能增强抑制B16F10细胞的黑色素生成；使用载药自组装胶束作用后B16F10细胞黑色素含量下降至71.0%，黑色素含量低于药物物理混合组(P < 0.005)，说明自组装胶束的联合输送能增强抑制B16F10细胞黑色素生成的作用。
各组B16F10细胞孵育后酪氨酸酶活性检测结果，见图4F。与空白对照组比较，氨甲环酸或二甲双胍溶液作用后B16F10细胞内酪氨酸酶活性略有下降但差异无显著性意义(P > 0.05)，而两者物理混合溶液作用后B16F10细胞内酪氨酸酶活性下降显著(P < 0.05)，酶活性降至88.1%；使用载药自组装胶束作用后B16F10细胞内酪氨酸酶活性下降至64.5%(P < 0.005)，与物理混合组比较差异有显著性意义(P < 0.01)。B16F10细胞内黑色素分泌及酪氨酸酶活性检测结果说明，功能性自组装胶束包载氨甲环酸后具有协同抗黑色素分泌的作用。

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在紫外线暴露、炎症、激素变化和药物反应等内外界因素的影响下，皮肤黑色素代谢异常引起的皮肤色素沉着会对患者心理健康及生活质量造成较大影响[1-2]。目前的治疗方法包括光电治疗、化学换肤和药物治疗等。光电治疗和化学换肤通过消除既存黑色素的策略治疗皮肤色素沉着，2种治疗方法效果不稳定，长期或过量使用易引起炎症、皮肤萎缩等不良反应，药物治疗仍是目前主要的治疗方法[3-4]。氨甲环酸是一种抗纤维蛋白溶解的药物，临床上常用作止血剂[5]。1979年，日本科学家发现氨甲环酸在治疗皮肤色素沉着时具有效果好、安全性高等优势，此后氨甲环酸作为治疗皮肤色素沉着的药物引起广泛重视[6]。药理研究显示，氨甲环酸可通过抑制纤溶酶-纤溶酶原途径使黑色素合成减少，同时还可通过竞争性抑制干扰酪氨酸酶对酪氨酸的催化作用，减少黑色素生
成[7-8]。目前氨甲环酸给药途径包括口服、注射、局部给药等，在皮肤色素沉着治疗中氨甲环酸局部给药是更理想的给药方式，但氨甲环酸的极性大，局部给药时难以突破皮肤角质层屏障和细胞膜，皮下蓄积不易达到有效治疗浓度[9-11]。针对氨甲环酸在局部给药过程中遇到的障碍，基于纳米技术的策略被广泛关注，研究者聚焦使用不同纳米载体提高氨甲环酸的透皮效率和皮内蓄积浓度，目前报道的具有透皮递送优势的纳米载体有固体脂质纳米粒、醇质体和纳米胶束等[11-16]。其中，聚合物胶束具有独特的“壳-核”结构，便于负载不同类型的小分子药物，与其他纳米载体相比在载药量、稳定性、生物相容性及促渗透作用方面显示优势，故被广泛使用[17]。
课题组曾经设计选用双胍类结构二甲双胍与表没食子儿茶素没食子酸棕榈酸酯通过氢键与静电作用在水溶液中自组装为纳米胶束，用于化疗药物在肿瘤组织内部的渗透和递送，该自组装胶束具有生物相容性好、载药能力高、组织渗透性好等优势[18]。目前的研究证明，二甲双胍可降低体内环磷酸腺苷表达，使酪氨酸酶合成减少以抑制黑色素合成[19]；而表没食子儿茶素没食子酸棕榈酸酯也具有较强的抗氧化性能，可使已生成的黑色素发生分解，同时还可抑制酪氨酸酶合成进而抑制黑色素合成，因此，推测以两者为材料构建的自组装纳米载体将具有一定协同抗皮肤色素沉着作用[20]。通过对氨甲环酸结构分析及预实验发现，氨甲环酸与二甲双胍在水溶液中可结合生成复盐，再与表没食子儿茶素没食子酸棕榈酸酯的酚羟基自组装，构建载药量高且稳定性较好的纳米自组装胶束；同时，氨甲环酸被包载入自组装胶束后能有效降低氨甲环酸的极性，形成一种具有协同对抗色素沉着活性和增强药物渗透性能的自组装胶束。基于此，此次研究采用植物多酚衍生物表没食子儿茶素没食子酸棕榈酸酯与二甲双胍作为载体材料，通过氢键与静电作用自组装包载氨甲环酸，制备具有协同对抗色素沉着活性和增强药物渗透性能的自组装纳米胶束，增强氨甲环酸抗皮肤色素沉着效应，为氨甲环酸经皮给药治疗皮肤色素沉着面临的问题提供新方法。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

1.1    设计   功能化自组装胶束制备与表征及体外细胞学实验。
1.2   时间及地点   实验于2023年10月至2024年5月在湖北工业大学生命科学与健康工程学院完成。
1.3   材料
1.3.1   主要试剂   氨甲环酸(上海麦克林)；盐酸二甲双胍(上海碧云天)；表没食子儿茶素没食子酸棕榈酸酯(长兴三聚)；罗丹明B(美国Sigma)；DMEM高糖培养基、0.25%胰蛋白酶-EDTA(美国Gibco)；MTT、DAPI染色剂、酪氨酸酶活性检测试剂盒(北京索莱宝)；EDTA抗凝兔血(南京森贝伽)，其他试剂均为分析纯。
1.3.2   主要仪器   荧光分光光度计(日本岛津，RF-6000)；紫外分光光度计(日本岛津，UV-80)；激光粒度仪(英国马尔文，Nano ZS90)；倒置荧光显微镜(日本奥林巴斯，IX73)；冷冻切片机(德国徕卡，CM1860)；酶标仪(德国宝特，Elx-800)；Franz扩散池(上海黄海药检，TYP-2)；透射电子显微镜(美国通用，Talos F200 X)。
1.3.3   细胞   小鼠皮肤黑色素瘤细胞(B16F10，模型细胞)、小鼠成纤维细胞(L929，正常细胞)购自中国典型培养物保藏中心。两种细胞均采用DMEM高糖培养基(包含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素双抗)，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中进行培养。
1.3.4   实验动物   雌性Balb/c小鼠6只，7周龄，体质量18-20 g，购自湖北省疾病预防控制中心动物实验中心，许可证号：SCXK(鄂)2020-0018。将小鼠放置在食物和水源充足、保持正常昼夜节律的干净动物房内饲养1周，以适应新环境。动物实验已通过湖北工业大学动物伦理委员会批准(编号：HBUT20230083)，并按照《实验动物的护理和使用指南》进行。
1.4   实验方法   
1.4.1   自组装胶束的制备   参考课题组前期制备方法制备未载药的空白自组装胶束[18]。
载药自组装胶束的制备：将75 mg氨甲环酸和25 mg二甲双胍一同放入研钵中，滴入50 μL无水乙醇，持续研磨30 min，得到氨甲环酸和二甲双胍的复盐，置于真空干燥箱中40 ℃干燥待用。取氨甲环酸和二甲双胍的复盐100 mg溶于3 mL纯化水中，取3 mg/mL表没食子儿茶素没食子酸棕榈酸酯的乙醇溶液100 μL，以20 s/滴速度滴入复盐溶液中，制得载药自组装胶束溶液。同法制备载罗丹明B的载药自组装胶束溶液(0.5 mg/mL)。
1.4.2   自组装胶束表征   使用透射电子显微镜观察空白自组装胶束溶液和载药自组装药胶束溶液的形貌。采用激光粒度仪测定空白自组装胶束、载药自组装胶束的水合粒径、多分散系数和Zeta电位(n=3)。将空白自组装胶束和载药自组装胶束放置在(4±1) ℃冰箱内保存，第1，3，5，10，15天检测两种胶束粒径与多分散系数变化，评估胶束的稳定性。使用紫外分光光度计分别在220 nm和233 nm波长下测定梯度质量浓度对照品氨甲环酸溶液(60-1 000 μg/mL)和二甲双胍溶液(5-60 μg/mL)在相应检测波长处的紫外吸收值，以质量浓度为横坐标、吸收值为纵坐标拟合得到氨甲环酸回归曲线(Y=0.007 2X-0.005 5，R2=0.999 6)和二甲双胍回归曲线(Y=0.072 3X+0.052 2，R2=0.999 3)；检测载药自组装胶束的紫外吸收值，代入曲线求得所含相应药物质量浓度和载药量。
1.4.3   载药自组装胶束的体外经皮释放性能
体外透皮实验：腹腔注射苯巴比妥溶液(100 mg/kg)麻醉6只小鼠，待小鼠麻醉昏迷后采用剃毛器剃除背部毛发，颈椎脱臼法处死小鼠；小心剥离小鼠背部完整皮肤，去除皮肤内侧黏膜后备用。将6只小鼠皮肤随机分为载药自组装胶束组、游离氨甲环酸组与游离二甲双胍组，每组2只，采用Franz扩散池对载药自组装胶束中氨甲环酸和二甲双胍的透皮行为和皮内滞留量进行评价，以同质量浓度游离氨甲环酸溶液(25 mg/mL)、二甲双胍溶液(8.3 mg/mL)作对照。将小鼠皮肤固定在扩散池(2.54 cm2)上，接受池中加入7 mL PBS为接受介质，样品池中分别加2 mL载药胶束溶液、二甲双胍溶液和氨甲环酸溶液(每组重复3次)，32 ℃下磁力搅拌(800 r/min)。第0.5，1，2，3，4，8，10，12，24 小时，分别吸取各接受池内溶液2 mL(同时补充等量新鲜PBS)，使用紫外分光光度计测定各取样点样品中药物含量，按式(1)计算单位皮肤面积的药物累计渗透量(Q)，同时以单位面积累积药物透皮率对时间作曲线图，曲线斜率即为单位面积的稳态透皮率。
Q=(Vpool ×Cn +∑n-1 Cn ×Vi )/Apool                                               (1)
公式中，Vpool 为接受池体积，Cn为第n点取样测得的药物浓度，Vi为每次取样体积，Apool 为扩散池的有效扩散面积。
皮内贮留量测定：将各组体外透皮实验中小鼠皮肤取下，用PBS(pH=7.4，1×)冲洗干净，用滤纸吸干表面水分后称质量，将皮肤剪碎后加入2 mL无水乙醇剪切10 min，超声10 min充分提取药物。将所得样品1 000 r/min离心10 min，取上清液用0.45 μm滤膜过滤，使用紫外分光光度法测定皮肤内药物贮留量。
荧光渗透评价：将新鲜猪耳(购自当地农贸市场，2只)毛发去除后用纯化水洗净，用滤纸吸干表面水分后划分出若干直径3 cm的小圈，随机分为3组：分别取100 μL游离罗丹明 B溶液、罗丹明B标记的自组装胶束溶液和PBS均匀涂抹至小圈内，32 ℃孵育5 h后，用手术刀取下相应皮肤液氮冷冻备用；用冷冻切片机制备厚度为10 μm的横/纵向皮肤切片，置于倒置荧光显微镜观察10，100，200，400，800 μm处皮肤横切片和皮肤纵切片，分析药物荧光渗透分布情况。
1.4.4   载药自组装胶束的生物安全性评价
细胞相容性实验：①将B16F10细胞(或L929细胞)悬液稀释后加入96孔板内，细胞密度为1×104 /孔，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中过夜培养。待细胞贴壁后，将培养液换成含不同质量浓度(16，32，64，160，320 μg/mL)空白自组装胶束的培养液，另设对照组(单独细胞培养)和调零组(仅含培养基无细胞)，每组5个复孔。培养24 h后，按照MTT法[21]，使用酶标仪测定各组在490 nm波长下的吸光度值(A)，计算细胞存活率。细胞存活率(%)=(实验组A值-调零组A值)/(对照组A值-调零组A值)×100%。②采用MTT法评价载药自组装胶束对B16F10细胞的毒性作用。将B16F10细胞悬液稀释后加入96孔板内，细胞密度为1×104 /孔，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中过夜培养。待细胞贴壁后，更换为含不同质量浓度载药自组装胶束的培养液(50，100，200，250，500 μg/mL，以胶束中氨甲环酸质量浓度计算)，另设二甲双胍组(160 μg/mL)和氨甲环酸组(500 μg/mL)，每组5个复孔，同时设置对照组(单独细胞培养)与调零组(仅含培养基无细胞)，每组5个复孔。培养24 h后，按照MTT法，使用酶标仪测定各组在490 nm波长下的A值，计算细胞存活率。
溶血实验：取50 mL抗凝兔血在4 ℃下1 500 r/min离心5 min，去除上清液，随后使用PBS(pH=7.4)洗涤3次以分离红细胞，用PBS配制40 g/L红细胞悬浮液。样品烘干后，溶解在PBS中配制50-500 μg/mL(以胶束中氨甲环酸质量浓度计算)的载药自组装胶束溶液。以水和PBS分别作为阳性对照(+)和阴性对照(-)。将等体积的红细胞悬浮液和样品(或水、PBS)溶液混合并在37 ℃下孵育2 h；将血液混合物1 500 r/min离心5 min，取上清液100 μL转移到 96孔板中，使用酶标仪检测 540 nm 波长下吸光度值，计算溶血率。溶血率(%)=(样品吸光度值-阴性对照组吸光度值)/(阳性对照组吸光度值-阴性对照组吸光度值)×100%。
1.4.5   载药自组装胶束对B16F10细胞中黑色素含量的影响   将B16F10细胞接种于96孔板中，细胞密度为8 000个/孔，培养至细胞贴壁后弃去培养液，分5组培养：空白对照组加入6 mL DMEM培养基，氨甲环酸组加入含500 µg/mL游离氨甲环酸的DMEM培养基6 mL，二甲双胍组加入含160 µg/mL游离二甲双胍的DMEM培养基6 mL，物理混合组加入含500 µg/mL游离氨甲环酸、160 µg/mL游离二甲双胍的DMEM培养基6 mL，载药自组装胶束组加入含载药自组装胶束的DMEM培养基6 mL (500 µg/mL，以胶束中氨甲环酸质量浓度计算)，每组5个复孔。培养12 h后弃去培养液，收集细胞，加入1 mL NaOH(1 mol/L，含10%二甲基亚砜)吹打均匀，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养24 h，充分裂解细胞核溶解黑色素颗粒。取出细胞悬液均匀转移到96孔板中，使用酶标仪测量490 nm波长下吸光度值，计算黑色素含量。黑色素含量=加药组吸光度值/空白对照组吸光度值×100%。
1.4.6   载药自组装胶束对B16F10细胞中酪氨酸酶活性的影响   将B16F10细胞接种于96孔板中，细胞密度为8 000个/孔，待细胞贴壁生长后弃去培养液，分5组培养：空白对照组加入100 μL DMEM培养基，氨甲环酸组加入含500 µg/mL游离氨甲环酸的DMEM培养基100 μL，二甲双胍组加入含160 µg/mL游离二甲双胍的DMEM培养基100 μL，药物物理混合组加入含500 µg/mL游离氨甲环酸、160 µg/mL游离二甲双胍的DMEM培养基100 μL，载药自组装胶束组加入含载药自组装胶束的DMEM培养基100 μL (500 µg/mL，以胶束中氨甲环酸质量浓度计算)，每组5个复孔。培养24 h后，每孔加入100 μL TritonX-100于-80 ℃下存放30 min，室温溶解后，每孔加入50 μL左旋多巴溶液于37 ℃静置3 h。使用酶标仪测量490 nm波长下吸光度值，计算酪氨酸酶活性。酪氨酸酶活性(%)=加药组吸光度值/空白对照组吸光度值×100%。
1.5   主要观察指标   载药自组装胶束的纳米特性及稳定性、体外经皮渗透性能、生物安全性以及对B16F10细胞中黑色素含量、酪氨酸酶活性的影响。
1.6   统计学分析   所有统计分析均在GraphPad Prism 8软件中进行，数据均以x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，P < 0.05认为差异有显著性意义。该文统计学方法已由湖北工业大学生命科学与健康工程学院专家审核。

皮肤色素沉着作为一种常见的慢性难治性色素沉着障碍疾病，是目前临床皮肤科和美容界研究的热点之一。尽管目前针对皮肤色素沉着有诸多治疗方式，但均存在一些局限性[2，8]。经皮给药因具有患者依从性好、给药便捷等优点，是治疗慢性皮肤性疾病的常用给药方式。为了解决活性成分的皮肤渗透屏障问题，形成了以微纳米技术、微针技术、离子导入技术为主的局部透皮给药技术[22]。余胜男等[16]使用醇质体包载氨甲环酸以提高药物经皮渗透量和深层皮肤中贮留量，但醇质体中磷脂含量对药物包封率影响较大且难以控制，同时存在醇质体中醇类挥发会影响药物稳定性等问题。LIU等[12]制备了一种具有良好靶向传递性与生物相容性的氨甲环酸纳米脂质体凝胶，经豚鼠色素沉着模型验证该纳米脂质体凝胶能突破皮肤角质层屏障渗透至表皮，并可将氨甲环酸靶向输送到黑素细胞，通过抑制酪氨酸酶活性减少黑素小体的数量和体积。但氨甲环酸在脂质体中的包封效率不高，同时脂质体易受光照、温度和pH值等因素影响会发生融合、聚集或降解，进而降低药效[23]。与之相比，聚合物胶束具有更高的物理化学稳定性、多样化的药物负载方式、良好的尺寸可控性和良好的生物相容性等优势，将其开发为氨甲环酸经皮给药制剂具有较好的应用前景[24]。
表没食子儿茶素没食子酸棕榈酸酯中酚羟基与二甲双胍中带正电的氨基，通过氢键与静电相互作用紧密而有序的自组装结合形成一种外部亲水、内部疏水的纳米胶束，课题中待包载的活性物质氨甲环酸可与二甲双胍结合生成复盐，再通过氢键与静电作用与表没食子儿茶素没食子酸棕榈酸酯中带负电荷的酚羟基结合形成载药胶束，改善氨甲环酸的强亲水性[18]。经激光粒度仪测定显示，空白自组装胶束和载药自组装胶束的平均粒径均在200 nm以内，较小的尺寸有助于更紧密地与皮肤角质层贴合和透皮扩散[25]。皮肤上因硫酸蛋白多糖的存在而带负电，与同为负电性的胶束作用后，在静电力作用下使皮肤上产生一种临时通道增强胶束渗透，同时载药自组装胶束的电位绝对值增高，能增加体系稳定性[26]。经透射电镜观察可见制备的载药自组装胶束呈规则球状，这种结构有助于保持胶束内部药物的稳定以及药物在体内的传递和释放；同时注意到透射电镜中观察到胶束粒径与测定的水合粒径相比略有减小，可能与载药自组装胶束中氨甲环酸静电作用及溶剂挥发效应有关[27-29]。稳定性评价结果显示，空白自组装胶束、载药自组装胶束的平均水合粒径和多分散系数数值在观察时间内保持可控的稳定性。采用自组装胶束包载氨甲环酸具有良好的包载能力，载药量达到(19.97±0.12)%，与脂质体或醇质体方式包载相比显示了更高的载药能力[12，16]。
采用局部给药方式治疗皮肤疾病的药物，药物活性成分透过皮肤角质层屏障达到相应治疗皮层的累积量是评价药物性能的关键因素[30]。在体外透皮实验中，载药自组装胶束与游离药物相比单位皮肤面积的累计透皮量、稳态透皮速率和皮内贮留量均有显著增加，说明采用功能化自组装胶束局部递送抗皮肤色素沉着活性成分能显著增强活性成分的皮肤渗透和皮内贮留能力，有助于加快活性成分发挥治疗作用，从而提高治疗效果。药物从皮肤表面向内部渗透时常借助毛囊、皮脂腺等皮肤附属器官进行[31]，荧光模型渗透实验结果表明，表没食子儿茶素没食子酸棕榈酸酯/二甲双胍自组装纳米胶束在皮肤内有良好的渗透性，通过皮肤角质层细胞间隙和皮肤附属器官(如毛囊、汗腺)渗透进入皮下400 μm以下的深层区域，有助于药物作用于黑素细胞抑制黑色素形成[32]。
生物相容性与细胞毒性评价是衡量所制备纳米药物是否能实际应用的重要指标，通过生物相容性实验可以评价载药自组装胶束对细胞的影响，评估其安全性，为进一步的体内实验提供必要支持。生物相容性实验结果表明，空白自组装胶束对正常细胞L929和模型细胞B16F10均具有良好的生物相容性，作为局部药物递送系统具有较高的生物安全性；同时载药自组装胶束在包载氨甲环酸高质量浓度下(500 μg/mL)对模型细胞B16F10的毒性小(细胞存活率75%)。溶血实验是检验医用生物材料生物相容性的指标之一，一般认为溶血率≥5%时该材料易引发溶血，此次实验中各质量浓度载药自组装胶束的溶血率均不足1.1%，溶血率低，说明载药自组装胶束具有良好的生物安全性[33]。模型细胞B16F10内黑色素含量与酪氨酸酶活性呈正相关，酪氨酸酶活性能影响黑色素的分泌量[34]。模型细胞B16F10内黑色素分泌及酪氨酸酶活性评价结果说明，氨甲环酸和二甲双胍均能有效抑制黑素合成与分泌，物理联合用药显示一定协同作用，而将药物装载入自组装功能纳米胶束后作用显著增强，证实载药自组装胶束可通过增加靶细胞活性成分有效浓度，更有效抑制细胞内酪氨酸酶活性，减少黑色素合成与分泌。
综上所述，课题成功设计构建自组装氨甲环酸/表没食子儿茶素没食子酸棕榈酸酯/二甲双胍胶束，功能化自组装胶束能渗透并扩散至皮下较深层部位，具有更高的单位皮肤面积透过量和皮内贮留量；细胞水平评价显示自组装胶束载体具有良好的生物安全性，包载的氨甲环酸后能显著降低模型细胞B16F10的酪氨酸酶活性、减少黑色素的生成。通过将氨甲环酸制成纳米胶束后提高其在皮肤中的渗透性能，改善氨甲环酸经皮给药治疗皮肤色素沉着的效应，为氨甲环酸经皮给药治疗皮肤色素沉着面临的问题提供了新方法。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

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文题释义：

功能化自组装胶束：自组装胶束是一种由分子自发形成的热力学稳定纳米级胶状团聚体，分子在溶液中达到一定浓度时通过疏水基团与亲水基团相互作用，以非共价键方式进行组装，形成具有特定结构和功能的纳米载体，同时在载体结构中共聚或修饰添加具有特定功能的化学集团，可赋予胶束新的性质与功能，使其具有靶向、渗透、示踪等功能。
皮肤色素沉着：是指局部皮肤因黑色素增加而变得比周围皮肤颜色更深。皮肤色素沉着的常见原因包括紫外线暴露、炎症后色素沉着、激素变化、遗传因素和药物反应。皮肤色素沉着虽通常无害，但会影响皮肤外观并给患者带来社交压力，日渐成为医学界与美容界研究热点之一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

因紫外线暴露、炎症、激素变化和药物反应等内外界因素影响下，皮肤黑色素代谢异常引起的皮肤色素沉着会对患者心理健康及生活质量造成较大影响。氨甲环酸作为治疗皮肤色素沉着的药物具有效果好、安全性高等优势，但其极性强、局部给药时难以突破皮肤角质层屏障和细胞膜，皮下蓄积不易达到有效治疗浓度。此次研究采用植物多酚衍生物表没食子儿茶素没食子酸棕榈酸酯与二甲双胍作为载体材料，通过氢键与静电作用自组装包载氨甲环酸，制备具有协同对抗色素沉着活性和增强药物渗透性能的自组装纳米胶束，增强氨甲环酸抗皮肤色素沉着效应，为氨甲环酸经皮给药治疗皮肤色素沉着面临的问题提供新方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

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