KRT18与mRNA及长链非编码RNA互作调控椎间盘髓核细胞损伤的机制

doi:10.12307/2025.239

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (2): 312-321.doi: 10.12307/2025.239

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KRT18与mRNA及长链非编码RNA互作调控椎间盘髓核细胞损伤的机制

刘钟元1，李扬2，张志文2

1湖北中医药大学针灸骨伤学院，湖北省武汉市 430061；2湖北中医药大学附属医院、湖北省中医院、湖北省中医药研究院，湖北省武汉市430061

收稿日期:2023-12-07 接受日期:2024-02-19 出版日期:2025-01-18 发布日期:2024-05-24
通讯作者: 张志文，博士，副主任医师，湖北中医药大学附属医院、湖北省中医院、湖北省中医药研究院，湖北省武汉市 430061
作者简介:刘钟元，男，1999年生，湖北省武汉市人，汉族，湖北中医药大学中医骨伤学在读硕士，医师，主要从事脊椎相关疾病治疗机制的研究。
基金资助:
湖北省自然科学基金项目(2022CFB406)，项目负责人：张志文

Mechanism by which KRT18 interacts with mRNA and long non-coding RNA to regulate intervertebral disc nucleus pulposus cell injury

Liu Zhongyuan1, Li Yang2, Zhang Zhiwen2

1College of Acupuncture and Orthopedics, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430061, Hubei Province, China; 2Hospital affiliated to Hubei University of Traditional Chinese Medicine, Hubei Hospital of Traditional Chinese Medicine, Hubei Institute of Traditional Chinese Medicine, Wuhan 430061, Hubei Province, China

Received:2023-12-07 Accepted:2024-02-19 Online:2025-01-18 Published:2024-05-24
Contact: Zhang Zhiwen, MD, Associate chief physician, Hospital affiliated to Hubei University of Traditional Chinese Medicine, Hubei Hospital of Traditional Chinese Medicine, Hubei Institute of Traditional Chinese Medicine, Wuhan 430061, Hubei Province, China
About author:Liu Zhongyuan, Master candidate, Physician, College of Acupuncture and Orthopedics, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430061, Hubei Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Hubei Province, No. 2022CFB406 (to ZZW)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)：是长度> 200个核苷酸的非编码RNA。lncRNA在剂量补偿效应、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用。
椎间盘髓核：髓核是乳白色半透明胶状体，富于弹性，为椎间盘结构的一部分，位于两软骨板与纤维环之间。由纵横交错的纤维网状结构即软骨细胞和蛋白多糖黏液样基质构成的弹性胶冻物质。

背景：椎间盘中差异表达的RNA结合蛋白在椎间盘退变中发挥着关键作用，其中RNA结合蛋白KRT18水平的降低与椎间盘退行性病变相关，但其在椎间盘髓核细胞中的具体作用尚未完全确定。
目的：探讨KRT18与mRNA及长链非编码RNA结合互作对椎间盘髓核细胞的影响及机制。
方法：对因腰部骨折或椎间盘退行性病变而接受椎间融合术的患者进行人体髓核组织取样获得正常髓核细胞和退变髓核细胞，并进行
iRIP-seq、功能富集分析以及DNA 微阵列分析，随后根据分析结果在髓核细胞中敲低KRT18，通过蛋白免疫印迹及qRt-PCR在蛋白和RNA水平检测相关基因水平的表达。
结果与结论：通过iRIP-seq分析发现GUAAUC和AGCCUC序列中存在大量的KRT18结合位点，表明KRT18可参与调控RNA的转录、翻译、稳定性或在细胞信号传导途径中发挥作用。其能够与成熟的mRNA稳定结合，其中表达较高的基因包括CRLF1及IGFBP4等，同时与其结合的长链非编码RNA的峰值基因包括SNHG25、SNHG12、NEAT1、USP32、EIF4A2和CDH4，这些基因多涉及细胞凋亡、炎症等多种生物过程，并且能介导细胞外基质代谢的相关通路，KRT18能够调控它们的稳定性、转运、翻译、剪接等多个方面的功能，进而影响基因的表达和细胞功能。实验结果验证了在髓核细胞中敲低KRT18，细胞外基质代谢水平被抑制出现失衡，导致体外椎间盘退变。该研究首次从KRT18与mRNA及长链非编码RNA结合的角度探讨其调控机制，并推测了KRT18在椎间盘退变发病机制中的潜在功能，为今后KRT18关键功能的研究奠定了基础。
https://orcid.org/0000-0001-8554-2199(刘钟元)；https://orcid.org/0000-0002-3303-9046(张志文)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 椎间盘退行性变, RNA结合蛋白, KRT18, iRIP-seq, mRNA, 长链非编码RNA

Abstract: BACKGROUND: Differentially expressed RNA-binding proteins in the intervertebral disc plays a key role in intervertebral disc degeneration, and decreased levels of the RNA-binding protein KRT18 are associated with degenerative disc disease, but its specific role in the nucleus pulposus cells has not yet been fully determined.
OBJECTIVE: To investigate the interaction of KRT18 with mRNA and long non-coding RNA on nucleus pulposus cells of the intervertebral disc and its mechanism.
METHODS: Normal and degenerated nucleus pulposus cells were obtained from nucleus pulposus samples of patients undergoing interbody fusion for lumbar fracture or intervertebral disc degeneration. iRIP-seq, functional enrichment analysis, and DNA microarray analysis were performed to identify the mRNA and long non-coding RNA binding with KRT18. Subsequently, KRT18 was knocked down in nucleus pulposus cells based on the analysis results, and the expression levels of related genes were detected at the protein and RNA levels through protein immunoblotting and qRT-PCR, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Through iRIP-seq analysis, we identified abundant KRT18 binding sites within the GUAAUC and AGCCUC sequences, indicating that KRT18 may be involved in regulating RNA transcription, translation, stability or play a role in cell signaling pathways. It can stably bind to mature mRNA, among which highly expressed genes include CRLF1, IGFBP4, etc. At the same time, the peak genes of long non-coding RNA binding with it include SNHG25, SNHG12, NEAT1, USP32, EIF4A2 and CDH4. Most of these genes are involved in various biological processes such as apoptosis and inflammation, and can mediate related pathways of extracellular matrix metabolism. KRT18 can regulate their stability, transport, translation, splicing and other functions, thus affecting gene expression and cell function. We further verified through experiments the knockdown of KRT18 in nucleus pulposus cells, and found that the level of extracellular matrix metabolism was inhibited and unbalanced, resulting in intervertebral disc degeneration in vitro. This study investigated the regulatory mechanism of KRT18 from the perspective of its binding with mRNA and long non-coding RNA for the first time, and speculated the potential function of KRT18 in the pathogenesis of intervertebral disc degeneration, laying a foundation for future research on the key functions of KRT18.

Key words: Intervertebral disc degeneration, RNA-binding protein, KRT18, iRIP-seq, mRNA, long non-coding RNA

中图分类号:

刘钟元, 李扬, 张志文. KRT18与mRNA及长链非编码RNA互作调控椎间盘髓核细胞损伤的机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(2): 312-321.

Liu Zhongyuan, Li Yang, Zhang Zhiwen . Mechanism by which KRT18 interacts with mRNA and long non-coding RNA to regulate intervertebral disc nucleus pulposus cell injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(2): 312-321.

图/表（结果） 5

2.1 KRT18在退变髓核组织中表达并广泛影响转录组图谱现有研究表明，椎间盘退变的发病机制包括细胞外基质相关蛋白、炎症因子和细胞因子的失调等[22-24]。角蛋白家族尤其是KRT18被认为是单细胞水平上椎间盘的潜在生物标志物，但其功能尚不清楚[25]。为了进一步研究KRT18对椎间盘退行性病变的潜在影响，分析了GSE56081转录组数据集，其中包含5个退变髓核样本和5个健康髓核样本[26]。在得到所有检测到的基因水平变化后，通过对退变髓核和健康髓核样本中的所有基因进行主成分分析，可以清晰地分离出这两组(图1A)，表明了髓核转录组图谱的整体变化。MA图展示了与椎间盘退行性病变相关的差异表达基因，表明上调的差异表达基因明显多于下调的(图1B)。在4 083个上调的差异表达基因中，通过微阵列分析检测到在退变髓核组织中KRT18存在明显较高的表达(图1C)，暗示KRT18表达水平的变化能够密切调控影响椎间盘退行性病变的发生。
2.2 KRT18-RNA 相互作用图揭示了 KRT18 与成熟 mRNA 的结合能力 KRT18在先前的一项研究中被证实是一种新的RNA结合蛋白，暗示了其在椎间盘退变中的潜在功能[27]。为了深入研究KRT18在椎间盘退行性病变中可能发挥的功能，采用了一种改进的RNA免疫沉淀和测序方法(iRip-seq)来获得髓核细胞内与KRT18结合的RNA的全面基因组图谱。为此在iRIP-seq 过程中使用了Flag标记的 KRT18并进行2次独立的重复试验。蛋白免疫印迹实验验证了Flag-KRT18蛋白在总细胞裂解物和 Flag免疫沉淀 (IP) 样品中存在，而在IgG对照的IP部分中则不存在(图2A)，从而验证了iRIP过程的成功执行。将低质量的测序读数筛除后与人类基因组进行比对，随后根据对所有4个样本(2个IP样本和2个input样本)在整个转录组中映射读数分析得到，2个KRT18_IP样本展现出与input样本明显不同的聚类模式(图2B)。此外，IP和input样本对中每个检测到基因表达水平的相关图(以FPKM为单位)显示了KRT18_IP样本中特定基因的某些mRNA的偏倚(图2C，D)，这些结果证明 iRIP-seq 实验已成功进行。KRT18_IP和input样本中映射读数的基因组位置显示在5’非翻译区域KRT18相关读数存在富集(图2E)。对成熟mRNA的3个区域进行标准化读取密度分析进一步确认了KRT18在5’非翻译区域的富集(图2F)。5’非翻译是mRNA的起始区域，通常包含有调控转录和翻译的序列元件。基因在这个区域富集可能意味着它在调控转录和翻译过程中起着重要的作用，可能与mRNA的稳定性、翻译效率或其他生物学功能相关联。因此，这种富集可能表明KRT18与mRNA之间存在着良好的结合关系。
2.3 KRT18 结合峰富含CCG和CGC的基序从iRip-seq读数中提取KRT18结合峰，通过ABLIRC流程进行分析[18]，以研究髓核细胞内KRT18对与其结合的mRNA的影响。这些峰值的基因组位置主要存在于3’非翻译区域、内含子和编码序列(图 3A，B)。进一步分析重叠峰发现在2个重复样本之间共有285个峰共享基因组位置(图3C，P=4.029 05×10-250，超几何检验)。为了找出KRT18 峰中富集的潜在序列基序，采用了 HOMER 算法，显示共有序列CCG和CGC在两次IP实验识别的峰中都明显更多(图 3D，E)，这两个基序在共享峰中排名前三，P值具有差异显著性(图3F)。说明与KRT18相互作用的mRNA在转录和翻译调控中具有重要的功能。随后对与KRT18相互作用的mRNA进行了富集功能分析，GO分析得到一些与椎间盘退行性病变强相关的生物过程通路(图3G)，包括细胞外基质组织[28-29]、胶原纤维组织[30]、DNA转录调控、衰老以及凋亡的负调节；此外，KEGG分析显示其在黏附斑和细胞外基质-受体相互作用途径中存在显著富集(图3H)；同时这些基因在凋亡和松弛素信号通路中也被发现富集[31]。这些发现表明KRT18在相关mRNA的转录和选择性剪接过程中具有重要调控作用，密切影响椎间盘退行性病变的发病机制。
2.4 KRT18结合mRNA的基因分析为了进一步阐明与KRT18结合的mRNA在椎间盘退行性病变的潜在活性功能，将GSE56081数据集的差异表达基因与2次iRIP-seq中检测到的KRT18结合的基因峰群进行交叉，得到了182个重叠基因(图4A)，对这182个基因进行GO功能分析，分析结果显示高度富集的通路有细胞外基质组织、胶原纤维组织、MAPK级联的正向调节、细胞因子介导的信号传导途径等(图4B)。此外结果发现KRT18能够良好的结合到CRLF1和IGFBP4的5’非翻译区域(图4C，D)，其中CRLF1表达升高是黄韧带肥厚的主要反应[32]；而IGFBP4在调节细胞生长、增殖和凋亡中发挥重要作用[33]。因此推测，与KRT18结合的mRNA能够影响调控多种生物功能，并调节细胞外基质代谢，在椎间盘退行性病变的机制中发挥重要作用。
2.5 KRT18结合lncRNA的基因分析 LncRNA作为调节分子在许多生物过程和疾病包括椎间盘退行性病变中发挥着至关重要的作用[34-35]。对KRT18 iRIP-seq 数据的分析显示，两次实验中4.6%和7.1% 的峰位于非编码RNA的外显子区域区域内，该区域包含lncRNA。因此，根据所识别的基因峰群搜索与KRT18相互作用的lncRNA，将2次重复实验中筛选得到的lncRNA(包括lincRNA和反义RNA)交叉获得19个重叠的lncRNA(图5A)。在这些重叠的lncRNA中，RNU12和SNHG25始终表现出高丰度(图5B)，表明KRT18能够优先与它们相互作用。将input样本中高表达的lncRNA筛除后发现KRT18与SNHG25和SNHG12能够特异性结合，进一步可视化了这2个 lncRNA 的读数分布和结合峰(图 5C，D)，发现KRT18与其能够良好的结合。先前的研究表明，SNHG25能够调控细胞增殖及细胞凋亡[36]，同时SNHG12对炎症因子具有良好的调控作用[37]。这些发现表明KRT18与功能性 lncRNA存在较密切的相互作用，能够通过调节髓核细胞环境及炎症反应影响椎间盘退行性病变的发展。
2.6 KRT18调节细胞外基质代谢，延缓髓核细胞变性为了进一步阐明KRT18对人髓核细胞外基质的调节影响，在人髓核细胞中使用siKRT18敲低KRT18的表达。KRT18敲低的效果通过qRT-PCR和蛋白免疫印迹进行验证，其中si-KRT18-1165表现出最明显的敲低效果(图6A，B)。在细胞外基质方面，Sox-9、Col2α1、Aggrecan、MMP-13、ADAMTS-5和MMP-3等标志物提示椎间盘退变。qRT-PCR和蛋白免疫印迹结果显示KRT18敲低后MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5水平显著升高，同时Sox-9、Col2α1和Aggrecan显著降低(图6C-E)。这些发现表明 KRT18 可能通过调节细胞外基质代谢在改善椎间盘退变中发挥关键作用。

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引言

椎间盘退变是导致腰痛发生的一个重要致病因素[1-2]。椎间盘退变是一种复杂的多因素疾病，由遗传易感性和环境影响共同引起，包括机械负荷、过度运动、炎症和衰老等因素[3]，其发生与椎间盘细胞流失、细胞外基质合成与降解的失衡以及局部炎症反应有密切关联[4]。目前已经报道了许多与椎间盘退变发病相关的基因，在正常生理条件下，这些基因受复杂的分子网络调控，同时环境因素引发的转录调控也可能对椎间盘退变的易感性和严重程度产生影响[5]。
RNA结合蛋白涉及多种生物过程的协调，包括增殖、细胞凋亡、自噬等，其参与了细胞转录后基因调控的整个过程，对细胞环境中每个转录本的功能产生决定性影响，维持细胞内稳态；可以根据其是否能与广泛转录本结合或选择性识别结合特定转录本进行分类 [6]；其表达异常已在一系列疾病中被广泛研究，包括癌症、神经退行性疾病、糖尿病等 [7-8]。椎间盘中差异表达的RNA结合蛋白在椎间盘退变中发挥着关键作用，它调控的靶基因有可能影响髓核细胞的增殖和凋亡以及调节细胞外基质的合成或降解，并协调其他关键的生物学过程。在多种RNA结合蛋白中，一种被称为HuR的胚胎致死异常视觉类似蛋白被广泛关注。据报道HuR能够通过与特定的mRNA或长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)结合介导多种生物过程及信号通路，从而影响髓核细胞退变时的转录后基因调控[9-10]。PAN等[11]通过实验证明HuR可以保持髓核细胞外基质代谢与合成稳定及pH稳态，在椎间盘退变中发挥保护作用。
先前的研究表明，与HuR类似，KRT8、KRT18和KRT19是常见的RNA结合蛋白，同时也是人类髓核蛋白中独特的标记物[12-13]。KRT8和KRT18水平的降低与椎间盘退变有关，表明这些标记物可能与退变过程中损伤的发生有关[14]。KRT18的表达升高往往伴随代谢和发育过程加快以及对损伤的应激反应。骨科协会提倡将KRT18的持续表达视为健康髓核表型的指示性标记之一，它作为RNA结合蛋白具有多功能性，涉及多种生物事件，如凋亡、增殖、迁移以及对机械应力的抵抗[6]，然而，KRT18在髓核内的确切作用尚不清楚。基于这些观察，作者认为KRT18不仅可作为健康髓核的表型标记，在椎间盘退变的转录后基因调控复杂过程中也起着关键作用。
该项研究探究KRT18在人类髓核细胞内选择性结合mRNA及lncRNA所发挥的调控功能对髓核细胞退变的影响。采用iRIP-seq技术获取了KRT18结合RNA及其相应相互作用的位点，通过iRNA-seq分析，探索了KRT18对髓核细胞转录组替代剪接和转录谱模式的影响。研究加深了对KRT18结合mRNA及lncRNA影响转录后基因调控机制的理解，同时也为进一步研究KRT18在椎间盘退变发病机制中的潜在功能提供了新的见解。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验，通过t检验、单因素或双因素方差分析(ANOVA)以及Tukey事后检验来检验组间变化的差异。
1.2 时间及地点实验于2022年1月至2023年9月在湖北省中医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 组织收集和伦理声明对因腰部骨折(健康髓核)或椎间盘退行性病变而接受椎间融合术的患者进行人体髓核组织取样。参考这些患者的磁共振显微图像(MRI)，根据Pfirrmann MRI分级标准评估了椎间盘退行性病变的程度[15]。通常PfirrmannⅠ或Ⅱ级被视为非退行性椎间盘，而Pfirrmann Ⅲ、Ⅳ或Ⅴ级则被归为椎间盘退行性病变。在40 g/L多聚甲醛中固定后，组织标本被用于组织学分析或冷冻保存以进行RNA和蛋白质分析。该研究方案已经获得湖北省中医院伦理委员会的批准(HBZY2022-C03-02)。患者对手术过程中产生的废弃组织的收集用于科学实验，完全知情同意，并签署了知情同意书。
1.3.2 实验试剂磷酸盐缓冲盐水(PBS，HyClone，美国)； 0.25%胶原酶Ⅱ型、0.25%胰蛋白酶、体积分数10%牛血清(Gibco，美国)；1%青霉素/链霉素(Solarbio，美国)；完全培养基(DMEM/F-12，HyClone，美国)；BCA Arry试剂盒(Biosharp，中国，广州)；Sox-9、Col2α1、Aggrecan、ADAMTS-5、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinas，MMP)13，MMP-3、GAPDH一抗(Abcam，Cambridge，英国)；Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，美国)；RNase 抑制剂(Takara)；聚偏氟乙烯膜(PVDF)(Millipore，Billerica，MA，美国)；RQ1 DNase (Promega，Madison，美国)；ReverTra Ace qPCR RT Kit (TOYOBO Life Science，中国上海)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养髓核组织在PBS中反复冲洗后，用无菌组织剪刀将髓核切成1 mm3大小，然后用0.25%胶原酶Ⅱ型在体积分数5% CO2培养箱中37 ℃下消化6 h。用含有体积分数10%牛血清和1%青霉素/链霉素的完全培养基终止消化，用超速离心机以1 200 r/min离心5 min。离心后去除上清液，将沉淀的髓核细胞在生长培养基中重悬，每3 d更换1次培养基。当细胞达到80%-90%的融合度后，使用0.25%胰蛋白酶将髓核细胞进行消化传代，以1∶3的比例转移到另一个培养瓶中。在随后的实验中使用第3代髓核细胞。
1.4.2 免疫共沉淀和文库制备使用
4 mL冷PBS(每15 cm 培养皿)在冰上通过 UV-254 C 型照射(400 mJ/cm2)进行细胞交联。刮除后，将细胞在4 ℃ 和1 000×g设置下沉淀，并在–80 ℃下冷冻保存直至后续使用。在冷洗涤缓冲液(1× PBS、0.5%脱氧胆酸钠、0.5% NP-40和0.1% SDS)中进行细胞裂解，其中包括蛋白酶抑制剂混合物(Roche)和RNase 抑制剂(200 U/mL)，随后在冰上孵育30 min。在4 ℃和10 000 r/min的条件下离心10 min除去裂解液，加入RQ I(Promega)至最终浓度1 U/μL，在37 ℃的水浴中孵育3 min。反应在冰上冷却5 min，然后通过EDTA掺入停止。
将上清液用10 μg对照IgG和FLAG抗体在4 ℃下孵育过夜，进行免疫沉淀。使用蛋白A/G Dynabheads在4 ℃下额外孵育2 h免疫沉淀物。在磁力上去除上清液后，将珠子分别在连续裂解缓冲液、高盐缓冲液
(750 mmol/L NaCl、250 mmol/L Tris 7.4、10 mmol/L EDTA、0.5%脱氧胆酸盐、0.5% NP-40、0.1% SDS)和PNK缓冲液(0.5% NP-40、20 mmol/L EGTA、50 mmol/L Tris)中洗涤2次。用洗脱缓冲液(1% SDS，50 nmol/L Tris 8.0和10 mmol/L EDTA)重悬珠子。随后将悬浮液在70 ℃中孵育20 min，使RNA结合蛋白与交联旋涡结合并释放RNA。然后将磁珠从分离器上取下，上清液转移到一个无菌微量离心管(1.5 mL)中。将蛋白酶K (Roche)加入1%的input(不含免疫沉淀)和RNA结合蛋白交联RNA免疫沉淀至最终浓度1.2 mg/mL，55 ℃孵育120 min，然后使用Trizol试剂纯化RNA。
cDNA文库构建使用ScriptSeq™v2 RNA-Seq文库制备试剂盒(Illumina，Epicentre)。完成cDNA的纯化和扩增，200-500 bp对应的PCR产物进行纯化、定量和-80 ℃低温保存，以备后续测序。
按照制造商的协议建立文库，并应用于HiSeq X Ten系统(Illumina)，ABlife(中国，武汉)对150 nt配对端进行高通量测序。
1.4.3 蛋白免疫印迹实验在含有苯甲磺酰氟(PMSF，1 nmol/L)的RIPA缓冲液中裂解髓核细胞后，根据BCA Arry试剂盒的方案，对蛋白质水平进行了定量分析。每组蛋白样品(40 μg)在进行12%的SDS-PAGE钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳前，先在6×SDS上样缓冲液中煮沸10 min，然后将分离的蛋白质电泳转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，转膜缓冲液为(25%甲醇，25 mmol/L Tris和0.2 mol/L甘氨酸)。用脱脂牛奶 (5%) 封闭后，用1∶1 000 稀释的Sox-9、Col2α1、Aggrecan、MMP-13、ADAMTS-5、MMP-3和GAPDH一抗进行孵育。使用合适的酶标二抗进行二次孵育。
1.4.4 敲低实验将相应的小干扰RNA(siRNA)转染至体外培养的第3代正常人髓核细胞中以敲低KRT18。RiboBio公司(中国，广州)负责重组siRNA和目标siRNA的合成。siRNA的细胞内转染按照Lipofectamine 2000 (Invitrogen)的方案完成。转染后48 h，采用实时荧光定量聚合酶链反应

(qRT-PCR)评价其在髓核细胞中的转基因效率。siRNA序列见表1。

1.4.5 RNA提取和cDNA合成按照Trizol试剂的指南提取髓核细胞的总RNA后，使用RQ1 DNase处理以去除DNA。通过测定260 nm和280 nm处的吸光度对纯化RNA进行定性和定量。在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，进一步验证RNA的完整性。整个RNA样本在-80 ℃低温保存待用。反转录反应按照ReverTra Ace qPCR RT Kit的方案完成。
1.4.6 实时定量聚合酶链式反应
(qRT-PCR) 使用Bestar SYBR GreenRT-PCR Master Mix，在Bio-Rad S1000上以人GAPDH基因为对照，通过qRT-PCR检测mRNA的表达水平。根据cDNA序列设计特异性引物。PCR设置为在95 ℃下初始1 min变性，然后在95 ℃下进行40次15 s变性，最后在60 ℃下进行30 s退火和延伸。引物序列见表2。

1.4.7 数据分析通过HISAT2 辅助的基因组读数比对[16]，得到基因组上的唯一比较结果，随后去除PCR的重复结果。峰值寻找是通过Piranha和ABLIRC程序进行的[17]。“ABLIRC”工作流程负责识别基因组上的GRCh38结合区域[18]。关于具体的峰值识别程序如下，首先使用5 bp窗口和从每条染色体的起始处开始的5 bp步长对整个基因组进行扫描。峰值识别要求是基因组上第一个窗口的深度为连续8个窗口的2.5倍或者中等深度> 50。当8个连续窗口的峰值低于其最大深度的4%时峰值结束。同时，每个基因的读数被随机分配给每个基因500次，随后对每个峰值的深度进行频率量化，从而对识别出的峰进行显著性评估，筛选出具有显著性(P < 0.05)或具有一定最大深度(≥5)的峰。随后，对这些峰的位置进行了丰度差异评估，其中所使用的对照是input样本。筛选IP丰度(可调指标)比input丰度大4倍的峰作为最终组合峰。最后基于这些峰确定了IP蛋白的靶基因，并利用HOMER筛选IP结合位点[19]。
(1)功能富集分析：为了对峰值相关靶基因进行功能分类，使用了KOBAS 2.0服务器检索基因本体论 (Gene Ontology，GO) 术语以及KEGG通路[20]。每个术语都经过了超几何检验和Benjamini-Hochberg方法的富集定义[21]。
(2)数据源：GEO存储库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)是在此分析中使用的数据集来源。选择了一个lncRNA-mRNA微阵列表达谱(GSE56081)进行的研究，其中包含5个退变样本(作为椎间盘退行性病变组)和5个正常(作为对照组)样本。
1.5 主要观察指标 ①通过GSE56081转录组数据集，对退变髓核和健康髓核样本中的表达差异基因进行分析，检测KRT18的表达水平；②通过iRip-seq检测KRT18在mRNA的富集区域，判断KRT18与mRNA的结合能力；③通过对与KRT18结合的mRNA的基因基序检测以及GO和KEGG分析，检测与KRT18对mRNA的影响及是否能够调控椎间盘退行性病变；④筛选与KRT18良好相互作用的lncRNA，检测其生物功能对椎间盘退行性病变的影响；⑤在人髓核细胞中敲低KRT18，蛋白免疫印迹和qt-PCR检测Sox-9、Col2α1、Aggrecan、MMP-13、ADAMTS-5和MMP-3的蛋白及mRNA表达水平。
1.6 统计学分析数据结果以x±s报告。通过t检验、单因素或双因素方差分析(ANOVA)以及Tukey事后检验来检验组间变化的差异。采用GraphPad Prism 8 (La Jolla，CA，美国)评价统计学意义，以P < 0.05 为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过湖北中医药大学统计学专家审核。

讨论

椎间盘退行性病变是腰痛的主要原因，其是一种发病机制复杂的疾病，可由多种致病因素引起。而多种致病因素中，髓核的退变被广泛认为是最重要的因素之一[38]。髓核位于椎间盘的核心位置，髓核细胞能够维持细胞外基质代谢的稳定，其发生退变、凋亡通常是椎间盘退变的开端[39]。健康椎间盘的髓核细胞通常应处于活跃、稳定的状态，这离不开细胞内RNA的调控作用。mRNA又称信使RNA，可以将DNA信息转录成相应的蛋白质进而调控细胞功能；lncRNA是一种长链非编码RNA，通常长度> 200个核苷酸，可以通过多种方式调控基因的转录水平，包括染色质重塑、转录抑制、转录激活、介导信号通路等[40-41]。mRNA和lncRNA的功能受到多种因素的影响，包括转录调控因素如转录因子、组蛋白修饰、DNA甲基化等、miRNA的调控、以及染色质结构和组织特异性等[42]。RNA结合蛋白广泛控制RNA生命周期的每个阶段，包括mRNA的合成、成熟和稳定，lncRNA的激活、剪切、降解等，影响细胞内的基因或蛋白表达水平，进而调控细胞功能[43]。因此基于髓核细胞挑选了RNA结合蛋白KRT18，从RNA-蛋白的作用模式探寻椎间盘退行性病变的发病机制，并为寻找治疗椎间盘退行性病变的靶点提供新思路。
KRT18是一种细胞骨架蛋白，属于细胞中间丝蛋白家族的一员，在细胞内起着支持和维持细胞形态结构的重要作用，同时在细胞凋亡调控以及肿瘤发生等方面都具有重要的生物学功能[44]。其作为RNA结合蛋白，可以通过调控mRNA和lncRNA的稳定性、转运、翻译、剪接等多个方面的功能，影响基因的表达和细胞功能。这些调控机制是细胞内基因表达调控网络中的重要组成部分，对于细胞的正常功能和病理生理过程具有重要的影响[45]。较为常见的如通过影响剪接因子在剪接过程中产生不同的剪接变体，生成多种不同的成熟mRNA，从而编码不同的蛋白质，有助于细胞在不同的生理和病理状态下适应环境的变化。选择性剪接调控通常由剪接因子和剪接位点的识别决定。剪接因子可以与pre-mRNA结合，促进或抑制特定的剪接位点的识别和剪接活性，从而影响不同剪接变体的生成。有研究表明KRT18可以在人胃腺癌细胞转录和转录后水平影响剪接因子调控细胞增殖及凋亡活动[46]；同时也可以结合mRNA或lncRNA的3’非翻译区域或其他区域，调控mRNA或lncRNA的稳定性，或者影响其翻译效率。WANG等[47]研究发现，在强直性脊柱炎中，KRT18等多种RNA结合蛋白可以与lncRNAs如linc00304，linc00926相互作用，影响脊髓内细胞炎症因子的表达，调控免疫系统、T细胞受体、蛋白结合等信号通路，进而影响强直性脊柱炎的进程。因此通过iRIP-seq技术筛选与KRT18结合的所有RNA基因图谱，并进一步研究与其结合的mRNA及lncRNA对髓核细胞的影响和调控机制。
在此次研究中，首先通过GSE数据库分析在健康髓核和退变髓核中的差异表达基因，发现在退变髓核中KRT18的表达明显升高，说明KRT18受应力或衰老刺激激活，对退变的髓核细胞进行回复调控，证明其在椎间盘退行性病变中的重要性。精确定位与KRT18结合的RNA靶点对于理解其在基因表达调控中的作用至关重要，一般采用RNA免疫沉淀和微阵列分析的高通量方法来系统地鉴定RNA结合蛋白结合的转录本。这种方法依赖于不同的测序技术，具体取决于是否涉及RNA-蛋白质交联，主要包括交联和免疫沉淀后测序(CLIP-seq)以及RNA免疫沉淀测序(RIP-seq)[48]。
随后作者使用这种方法对筛选与KRT18结合的所有RNA靶点，结果显示，KRT18显著富集在一些mRNA的5’非翻译区域，5’非翻译区域是成熟mRNA位于编码区上游不被翻译为蛋白质的区域，其在转录后调控、选择性剪接、翻译调控和mRNA稳定性等方面起着重要作用[49]。因此KRT18可能通过影响mRNA的翻译及稳定性或者选择性剪接mRNA进而调控相应蛋白质的合成或基因的表达；同时发现结合的峰值还存在于lncRNA的外显子区域内，外显子区域可能包含了lncRNA的功能区域，如结构域、RNA结合蛋白结合位点等。对于某些lncRNA，外显子区域也可能包含了一些保守的序列元件，对于RNA的功能和稳定性起着重要作用[50]。已有大量研究表明，lncRNA的外显子改变能够调控lncRNA的表达进而影响细胞功能，而KRT18又高密度的富集于髓核细胞中大量lncRNA的外显子区域，所以推测KRT18可能通过改变髓核细胞中lncRNA的外显子区域功能，影响其稳定性、转录后加工及转运等过程，进一步调控髓核细胞的退变。
此项研究将RIP-seq中所筛选出与KRT18相互作用的mRNA进行了GO富集功能分析，发现这些mRNA调控的生物功能主要包括细胞外基质组织、胶原纤维组织、DNA转录调控、衰老以及凋亡的负调节等，而其中髓核细胞外基质代谢紊乱及细胞凋亡是目前公认影响椎间盘退变发展的主要病理机制[4]。CHENG等 [51]研究发现KRT18 在HeLa细胞外基质合成相关基因表达中具有特定调节作用；PAN等[52]发现KRT18的表达与细胞凋亡以及细胞凋亡相关信号转导通路的关键蛋白的表达之间存在显著的负相关。此外发现KRT18能够良好的结合到CRLF1和IGFBP4的mRNA5’非翻译区域，有研究表明CRLF1的上调是黄韧带肥厚的主要反应，而黄韧带肥厚通常被视为椎间盘退变的一种适应性变化，研究中指出转化生长因子β1通过SMAD3通路显著增加CRLF1的mRNA表达，CRLF1在转录后水平通过ERK信号通路增强黄韧带纤维化，并且是转化生长因子β1 促纤维化作用所必需的[32]。而IGFBP4是一种胰岛素样生长因子结合蛋白，它在调节细胞生长、增殖和凋亡、生物学过程中发挥重要作用[33]。此项研究还从KRT18 iRIP-seq 数据的分析中得到，与KRT18结合的lncRNA包括SNHG25、SNHG12、NEAT1、USP32、EIF4A2和CDH4等。在恶性肿瘤领域对SNHG25和SNHG12已有广泛的研究，SNHG25的表达升高与卵巢癌有关，影响增殖、迁移、侵袭和凋亡等关键过程[53]。同样，SNHG12已被确定为结直肠癌细胞生长的驱动因子和细胞凋亡的抑制剂[54]。这些研究进一步证明了与KRT18结合的mRNA和lncRNA对髓核细胞外基质代谢及细胞凋亡的调控，表明他们的结合互作在椎间盘退行性病变中发挥着重要作用。
许多研究表明髓核细胞外基质代谢紊乱是椎间盘退变的主要病理诱因。为了验证KRT18在髓核细胞中的功能，采用小干扰RNA在第3代人髓核细胞中进行敲低KRT18。在细胞外基质方面，Sox-9、Col2α1、Aggrecan、MMP-13、ADAMTS-5和MMP-3等标志物提示椎间盘退变，通过qRT-PCR和蛋白免疫印迹检测敲低KRT18后这些标志物的表达，发现MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5水平显着升高，同时Sox-9、Col2α1和Aggrecan显着降低，表明KRT18能够调节髓核细胞外基质代谢平衡，进而调节椎间盘退变的病理进程。
综上所述，KRT18作为RNA结合蛋白，可能与特异的mRNA及lncRNA结合，包括mRNA-CRLF1、mRNA-IGFBP4、lncRNA-SNHG25、lncRNA-SNHG12、lncRNA-NEAT1、lncRNA-USP32、lncRNA-EIF4A2和
lncRNA-CDH4等结合，通过调节它们的稳定性、转运、翻译、剪接等多个方面，影响髓核细胞中相应蛋白及基因的表达，而这些基因多涉及细胞凋亡、炎症、细胞外基质代谢等相关生物功能及信号通路。当KRT18的表达下降时，与相应mRNA与lncRNA结合作用减少，影响这些基因的转录水平或蛋白的翻译效率，无法抑制髓核细胞的凋亡、炎症等过程，导致细胞外基质代谢紊乱，进而引起椎间盘退行性病变。此次研究结果为进一步探讨KRT18在椎间盘退变中的关键功能奠定了基础，并提示KRT18可能成为预防和治疗椎间盘退变的潜在靶点，为临床上椎间盘退变的治疗提出新的思路，提高对椎间盘退变的预后及转归的预期。
然而研究也存在许多局限性：①研究只筛选出与KRT18结合作用的mRNA和lncRNA，通过GO与KEGG分析它们在细胞中的功能，通过细胞实验验证KRT18对细胞外基质代谢的影响；而KRT18具体作用于mRNA及lncRNA的机制如选择性剪接、影响转录及稳定性等均为先前他人大量研究所得，未进行实质性的实验去验证其结合位点或剪接位点。②由于前期条件及数据不足，仅进行了体外的细胞实验证明KRT18的作用，并未进行动物实验，结果不具有强有力的说服性；同样也需考虑椎间盘退变的严重程度是否影响KRT18对mRNA及lncRNA的调控作用。总之KRT18作为椎间盘退变的治疗靶点具有一定潜力，但其具体机制及效果仍需进一步验证。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

KRT18与mRNA及长链非编码RNA互作调控椎间盘髓核细胞损伤的机制

Mechanism by which KRT18 interacts with mRNA and long non-coding RNA to regulate intervertebral disc nucleus pulposus cell injury

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