2.1   在瘢痕疙瘩组织和瘢痕成纤维细胞中NEAT1高表达，miR-136-5p低表达   瘢痕疙瘩组织中NEAT1表达高于正常组织，miR-136-5p表达低于正常组织(P < 0.05)，见图1A；瘢痕成纤维细胞中NEAT1表达高于正常成纤维细胞，miR-136-5p表达低于正常成纤维细胞(P < 0.05)，见图1B。



2.2   在瘢痕疙瘩组织和瘢痕成纤维细胞中USP4蛋白高表达   与正常组织比较，瘢痕疙瘩组织中USP4蛋白表达水平升高(P < 0.05)，见图2A；与正常成纤维细胞比较，瘢痕成纤维细胞中USP4蛋白表达水平升高(P < 0.05)，见图2B。



2.3   NEAT1、miR-136-5p、USP4在各组瘢痕成纤维细胞中的表达   与si-NC组和空白对照组相比，si-NEAT1组NEAT1、USP4蛋白表达下调，miR-136-5p表达上调
(P < 0.05)；与si-NEAT1+inhibitor-NC组和si-NEAT1组相比，si-NEAT1+miR-136-5p inhibitor组miR-136-5p表达下调，USP4蛋白表达上调(P < 0.05)，见图3。




2.4   沉默NEAT1对瘢痕成纤维细胞增殖的影响   与空白对照组、si-NC组比较，si-NEAT1组瘢痕成纤维细胞 A450值、EDU阳性细胞百分比降低(P < 0.05)；与
si-NEAT1+inhibitor-NC组和si-NEAT1组相比，si-NEAT1+ miR-136-5p inhibitor组A450值、EDU阳性细胞百分数升高
(P < 0.05)，见图4和图5。
2.5   沉默NEAT1对瘢痕成纤维细胞凋亡的影响   与空白对照组、si-NC组比较，si-NEAT1组瘢痕成纤维细胞凋亡率上调(P < 0.05)；与si-NEAT1+inhibitor-NC组和
si-NEAT1组相比，si-NEAT1+miR-136-5p inhibitor组瘢痕成纤维细胞凋亡率下调(P < 0.05)，见图6。
2.6   沉默NEAT1对瘢痕成纤维细胞迁移的影响   与空白对照组、si-NC组比较，si-NEAT1组瘢痕成纤维细胞划痕愈合率下调(P < 0.05)；与si-NEAT1+inhibitor-NC组和
si-NEAT1组相比，si-NEAT1+miR-136-5p inhibitor组划痕愈合率上调(P < 0.05)，见图7。
2.7   沉默NEAT1对瘢痕成纤维细胞中p27、Bax、α-平滑肌肌动蛋白、基质金属蛋白酶9、Ⅰ型胶原蛋白α1链蛋白表达的影响   与si-NC组和空白对照组相比，








si-NEAT1组p27、Bax蛋白表达上调，α-平滑肌肌动蛋白、基质金属蛋白酶9、Ⅰ型胶原蛋白α1链蛋白表达下调
(P < 0.05)；与si-NEAT1+inhibitor-NC组和si-NEAT1组比较，si-NEAT1+miR-136-5p inhibitor组p27、Bax蛋白表达下调，α-平滑肌肌动蛋白、基质金属蛋白酶9、Ⅰ型胶原蛋白α1链蛋白表达上调(P < 0.05)，见图8。
2.8   靶向关系验证   NEAT1与miR-136-5p、miR-136-5p与USP4可结合，见图9。NEAT1-WT和miR-136-5p mimic共转染组的荧光素酶活性低于NEAT1-WT和mimic NC共转染组(P < 0.05)；USP4-WT和miR-136-5p mimic共转染组荧光素酶活性低于USP4-WT和mimic NC共转染组(P < 0.05)，见图10。

[1] JIANG L, SHI X, WANG M, et al. Study on the Mechanism of miR-34a Affecting the Proliferation, Migration, and Invasion of Human Keloid Fibroblasts by Regulating the Expression of SATB1. J Healthc Eng. 2021; 2021:8741512.  [2] 李心怡,李茜,张伟,等.miR-148b-3p调控瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞增殖的机制研究[J].安徽医科大学学报,2023,58(9):1534-1539. [3] WEI Y, WANG T, ZHANG N, et al. LncRNA TRHDE-AS1 inhibit the scar fibroblasts proliferation via miR-181a-5p/PTEN axis. J Mol Histol. 2021; 52(2):419-426.   [4] 黄晶晶,蒋英,于静萍.缺氧诱导因子1α与瘢痕疙瘩肿瘤特性及其放疗抵抗[J].中国组织工程研究,2021,25(29):4728-4734. [5] 乔晓峰,李昕.手术联合多种方法治疗耳部瘢痕的疗效对比研究[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2017,31(17):1341-1343. [6] 肖传柳,林鸿昌,罗杨,等.小白菊内酯通过调控微小RNA-637表达抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、迁移和侵袭的研究[J].中国临床药理学杂志,2022,38(16):1915-1919. [7] DONG P, XIONG Y, YUE J, et al. Long Non-coding RNA NEAT1: A Novel Target for Diagnosis and Therapy in Human Tumors. Front Genet. 2018;9:471.  [8] XU X, LIANG Y, GAREEV I, et al. LncRNA as potential biomarker and therapeutic target in glioma. Mol Biol Rep. 2023;50(1):841-851.   [9] YANG Y, JIN L, HE J, et al. Upregulation LncRNA MEG3 expression suppresses proliferation and metastasis in melanoma via miR-208/SOX4. Mol Cell Biochem. 2023;478(2):407-414.  [10] WU K, MA F, SHEN J, et al. LncRNA FPASL suppresses fibroblast proliferation through its DNA methylation via DNMT3b in hypertrophic scar. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2022;54(12):1-9.  [11] YANG J, DENG P, QI Y, et al. NEAT1 Knockdown Inhibits Keloid Fibroblast Progression by miR-196b-5p/FGF2 Axis. J Surg Res. 2021;259:261-270. [12] 刘尧尧,孙明立,张帆.过表达miR-136-5p对子宫内膜癌HEC-1A细胞增殖、侵袭以及凋亡的影响[J].解剖科学进展,2021,27(5): 533-537. [13] ZHANG J, NA S, PAN S, et al. Inhibition of USP4 attenuates pathological scarring by downregulation of the TGF‑β/Smad signaling pathway. Mol Med Rep. 2019;20(2):1429-1435.  [14] WANG J, XIANG Y, YANG SX, et al. MIR99AHG inhibits EMT in pulmonary fibrosis via the miR-136-5p/USP4/ACE2 axis. J Transl Med. 2022; 20(1):426.   [15] ZHAO X, JIE X, GAO YK, et al. Long non-coding RNA CACNA1G-AS1 promotes proliferation and invasion and inhibits apoptosis by regulating expression of miR-205 in human keloid fibroblasts. Biosci Rep. 2020;40(6):BSR20192839. [16] SHIM J, OH SJ, YEO E, et al. Integrated Analysis of Single-Cell and Spatial Transcriptomics in Keloids: Highlights on Fibrovascular Interactions in Keloid Pathogenesis. J Invest Dermatol. 2022;142(8):2128-2139.e11. [17] LIU Y, XIONG X, CAO N, et al. Diagnosis and Treatment of Keloid: Method Summary and Effect Evaluation. Clin Cosmet Investig Dermatol. 2023;16:3775-3783.  [18] HU H, MAO G, ZHENG J, et al. Keloid Patient Plasma-Derived Exosomal hsa_circ_0020792 Promotes Normal Skin Fibroblasts Proliferation, Migration, and Fibrogenesis via Modulating miR-193a-5p and Activating TGF-β1/Smad2/3 Signaling. Drug Des Devel Ther. 2022;16:4223-4234. [19] LI Z, GONG C, WEI H. Long non-coding RNA H19 aggravates keloid progression by upregulating SMAD family member 5 expression via miR-196b-5p. Bioengineered. 2022;13(1):1447-1458.   [20] CHEN L, SU Y, YIN B, et al. LARP6 Regulates Keloid Fibroblast Proliferation, Invasion, and Ability to Synthesize Collagen. J Invest Dermatol. 2022;142(9):2395-2405.e7.  [21] ZHU M, LI Y, LIU L, et al. Circ_0057452 sponges miR-7-5p to promote keloid progression through upregulating GAB1. Cell Cycle. 2022; 21(23):2471-2483.   [22] ZHOU J, SHEN JY, TAO LE, et al. The Inhibition of Adipose-Derived Stem Cells on the Invasion of Keloid Fibroblasts. Int J Med Sci. 2022; 19(12):1796-1805.   [23] XU L, SUN N, LI G, et al. LncRNA H19 promotes keloid formation through targeting the miR-769-5p/EIF3A pathway. Mol Cell Biochem. 2021;476(3):1477-1487.  [24] WANG J, SHEN J. LncRNA HOXA11-AS aggravates the keloid formation by targeting miR-148b-3p/IGFBP5 axis. Biochem Biophys Res Commun. 2021;581:60-67.  [25] CHEN Y, HUANG C, DUAN ZB, et al. LncRNA NEAT1 accelerates renal fibrosis progression via targeting miR-31 and modulating RhoA/ROCK signal pathway. Am J Physiol Cell Physiol. 2023;324(2):C292-C306.  [26] LUO J, LIU J, MOU Y, et al. Propofol improves ischemia reperfusion-induced liver fibrosis by regulating lncRNA HOXA11-AS. J Toxicol Sci. 2023;48(6):345-354.  [27] MA T, QIU F, GONG Y, et al. Therapeutic silencing of lncRNA RMST alleviates cardiac fibrosis and improves heart function after myocardial infarction in mice and swine. Theranostics. 2023;13(11):3826-3843.  [28] WU Q, CHEN J, TAN Z, et al. Long non-coding RNA (lncRNA) nuclear enriched abundant transcript 1 (NEAT1) regulates fibroblast growth factor receptor substrate 2 (FRS2) by targeting microRNA (miR)-29-3p in hypertrophic scar fibroblasts. Bioengineered. 2021;12(1):5210-5219.  [29] YE J, LIN Y, YU Y, et al. LncRNA NEAT1/microRNA-129-5p/SOCS2 axis regulates liver fibrosis in alcoholic steatohepatitis. J Transl Med. 2020; 18(1):445.  [30] 万瑀,马芳,贺茜,等.长链非编码RNA SNHG1对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响[J].解放军医学杂志,2022,47(2):118-127. [31] WU X, WANG Z, WU G, et al. Tetramethylpyrazine Induces Apoptosis and Inhibits Proliferation of Hypertrophic Scar-Derived Fibroblasts via Inhibiting the Phosphorylation of AKT. Front Pharmacol. 2020; 11:602. [32] ZHU W, WU X, YANG B, et al. miR-188-5p regulates proliferation and invasion via PI3K/Akt/MMP-2/9 signaling in keloids. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2019;51(2):185-196.   [33] CHAI CY, TAI IC, ZHOU R, et al. MicroRNA-9-5p inhibits proliferation and induces apoptosis of human hypertrophic scar fibroblasts through targeting peroxisome proliferator-activated receptor β. Biol Open. 2020;9(12):bio051904.  [34] LUO P, LIU D, ZHANG Q, et al. Celastrol induces ferroptosis in activated HSCs to ameliorate hepatic fibrosis via targeting peroxiredoxins and HO-1. Acta Pharm Sin B. 2022;12(5):2300-2314.   [35] DUBEY S, DUBEY PK, UMESHAPPA CS, et al. Inhibition of RUNX1 blocks the differentiation of lung fibroblasts to myofibroblasts. J Cell Physiol. 2022;237(4):2169-2182.   [36] PENG H, WAN LY, LIANG JJ, et al. The roles of lncRNA in hepatic fibrosis. Cell Biosci. 2018;8:63.  [37] GUO Y, LI M, LONG J, et al. LncRNA-ZNF252P-AS1/miR-15b-5p promotes the proliferation of keloid fibroblast by regulating the BTF3-STAT3 signaling pathway. J Dermatol Sci. 2022;108(3):146-156.  [38] XU J, WANG J, ZHAO M, et al. LncRNA LINC01018/miR-942-5p/KNG1 axis regulates the malignant development of glioma in vitro and in vivo. CNS Neurosci Ther. 2023;29(2):691-711.  [39] ZHANG J, ZHANG L, YAO G, et al. lncRNA-Gm5532 regulates osteoclast differentiation through the miR-125a-3p/TRAF6 axis. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2023;56(1):54-61.   [40] ZHOU Y, SHAO Y, HU W, et al. A novel long noncoding RNA SP100-AS1 induces radioresistance of colorectal cancer via sponging miR-622 and stabilizing ATG3. Cell Death Differ. 2023;30(1):111-124.   [41] LIU L, PANG X, SHANG W, et al. miR-136 improves renal fibrosis in diabetic rats by targeting down-regulation of tyrosine kinase SYK and inhibition of TGF-β1/Smad3 signaling pathway. Ren Fail. 2020; 42(1):513-522.   [42] HUANG X, WANG Z, HOU S, et al. Long non-coding RNA DSCAM-AS1 promotes pancreatic cancer progression via regulating the miR-136-5p/PBX3 axis. Bioengineered. 2022;13(2):4153-4165.   [43] ZHANG Z, WANG S, LIU W. EMT-related long non-coding RNA in hepatocellular carcinoma: A study with TCGA database. Biochem Biophys Res Commun. 2018;503(3):1530-1536. [44] HUANG Y, WANG Y, WANG X, et al. The Effects of the Transforming Growth Factor-β1 (TGF-β1) Signaling Pathway on Cell Proliferation and Cell Migration are Mediated by Ubiquitin Specific Protease 4 (USP4) in Hypertrophic Scar Tissue and Primary Fibroblast Cultures. Med Sci Monit. 2020;26:e920736.

[1]	施雄智，宗少晖，何基琛，彭小明，高云兵，邓贵营. miR-136-5p调控白细胞介素17刺激星形胶质细胞后A20蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(16): 2587-2592.
[2]	武 艳，张春雷，刘 阳，李洪志，于 晶，包海花，郭 冉，袁晓环. 骨髓间充质干细胞条件培养液对瘢痕成纤维细胞生物活性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(7): 1009-1014.

瘢痕疙瘩是一种皮肤纤维化疾病，主要特征表现为成纤维细胞大量增殖、细胞外基质过度沉积[1-2]。尽管瘢痕疙瘩是一种非恶性疾病，但会导致患者身体、心理和社会不适，从而严重影响生活质量[3-4]。目前，手术切除为瘢痕疙瘩的主要治疗方法，但该方法效果不佳[5-6]。因此，亟需探索瘢痕疙瘩的发病机制，并寻找有效的治疗靶点。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)可以在转录和转录后水平抑制或激活基因表达，并参与不同的生物学过程[7-10]。核富集转录本1(nuclear enriched abundant transcript 1，NEAT1)是近年来备受瞩目的一种lncRNA，已有报道阐述，NEAT1的下调抑制瘢痕成纤维细胞的进
展[11]，但具体机制尚不完全清楚。通过生物信息学分析发现NEAT1与miR-136-5p、miR-136-5p和泛素特异性蛋白酶4(ubiquitin specific protease 4，USP4)存在结合位点。研究显示，过表达miR-136-5p可以抑制子宫内膜癌细胞增殖，促进凋亡[12]；抑制USP4可减轻病理性瘢痕形成[13]。
目前关于NEAT1调控miR-136-5p的研究很少见，但已有研究研究表明miR-136-5p可通过调控USP4影响肺腺癌细胞纤维化和上皮间质转化[14]。而NEAT1能否通过调节miR-136-5p/USP4轴影响瘢痕成纤维细胞生物学行为尚不明确。基于此，该研究主要探讨NEAT1对瘢痕成纤维细胞生物学行为的影响以及分子机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   体外细胞学实验，单因素方差分析多组间的差异。
1.2   时间及地点   实验于2022年7月至2023年5月在上海中医药大学基础医学实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   组织样本   收集2018年3月至2020年3月在上海中医药大学附属曙光医院接受瘢痕切除术的11例患者的瘢痕疙瘩组织和距离瘢痕疙瘩3 cm内的正常皮肤组织。该研究中涉及人类组织标本采集的所有程序均按照赫尔辛基宣言(2013年修订)执行，患者都提供了知情同意书，该研究在得到上海中医药大学附属曙光医院伦理委员会批准后进行，编号：2018-03-T007。
1.3.2   主要试剂   Lipofectamine 2000转染试剂(以下简称转染试剂，货号：11668-027，上海恪敏生物公司)；si-NEAT1、si-NC、miR-136-5p inhibitor、inhibitor-NC(广州基迪奥生物公司合成)；SuperScript IV反转录试剂盒、实时荧光定量PCR检测试剂盒(货号：11904-018、11904-037，赛默飞世尔科技公司)；CCK-8试剂盒(货号：CK04-2，上海经科化学公司)；Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒(货号：AC12L033，上海李记生物公司)；EDU染色试剂盒、兔源USP4抗体、Bax抗体、基质金属蛋白酶9抗体、α-平滑肌肌动蛋白抗体、GAPDH抗体、Ⅰ型胶原蛋白α1链抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(货号：ab222421、ab181105、ab32503、ab76003、ab5694、ab9485、ab138492、ab109489、ab6789，英国Abcam公司)；小鼠单抗p27、双荧光素酶报告基因检测试剂盒(货号：AP027、RG027，上海碧云天生物公司)。
1.4   实验方法   
1.4.1   原代成纤维细胞分离和培养   正常成纤维细胞、瘢痕成纤维细胞分别来源于瘢痕疙瘩患者的正常皮肤和瘢痕疙瘩皮肤组织，所有组织样本大小为0.4 cm×0.4 cm，用PBS溶液洗涤组织两三次后，从组织中去除表皮和皮下脂肪组织，然后将组织标本切成1 mm×1 mm×1 mm的小块，置于培养皿中，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基培养，每2 d更换1次培养液，待细胞长满培养皿后，通过胰蛋白酶消化并传代，取第五六代的瘢痕成纤维细胞、正常成纤维细胞用于实验。qRT-PCR检测正常皮肤组织和瘢痕疙瘩皮肤组织、正常成纤维细胞和瘢痕成纤维细胞中NEAT1、miR-136-5p表达，Western blot检测USP4蛋白表达。
1.4.2   细胞转染   取对数生长期的瘢痕成纤维细胞，分为si-NC组、空白对照组、si-NEAT1组、si-NEAT1+miR-136-5p inhibitor组、si-NEAT1+inhibitor-NC组，各组细胞均以1×109 L-1的细胞浓度加入24孔板中，每孔100 μL，待细胞汇合度达到90%左右时开始转染，si-NC组瘢痕成纤维细胞中加入1 μg si-NC和2 μL转染试剂转染；si-NEAT1组瘢痕成纤维细胞中加入1 μg si-NEAT1和2 μL转染试剂转染；si-NEAT1+inhibitor-NC组瘢痕成纤维细胞中加入1 μg si-NEAT1、1 μg inhibitor-NC和2 μL转染试剂转染；si-NEAT1+miR-136-5p inhibitor组瘢痕成纤维细胞中加入1 μg si-NEAT1、1 μg miR-136-5p inhibitor和2 μL 转染试剂转染；空白对照组为正常培养的瘢痕成纤维细胞。各组进行相应转染48 h后用于实验。
1.4.3   NEAT1、miR-136-5p表达的检测   Trizol试剂提取组织或细胞总RNA，以RNA反转录成的cDNA为模板进行荧光定量PCR，反应程序：95 ℃预变性2 min；然后进行以下循环，94 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s ，62 ℃延伸50 s，共进行42个循环；最后4 ℃保存。引物：U6正向：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，U6反向：5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′；miR-136-5p正向：5′-ACT CCA TTT GTT TTG ATG ATG GA-3′，miR-136-5p反向：5′-GCA GGG TCC GAG GTA TTC-3’；GAPDH正向：5′-CCT CGT CTC ATA GAC AAG ATG GT-3′，GAPDH反向：5′-GGG TAG AGT CAT ACT GGA ACA TG-3′；NEAT1正向：5’-TGG CTA GCT CAG GGC TTC AG-3’，NEAT1反向：5’-TCT CCT TGC CAA GCT TCC TTC-3’。GAPDH和U6分别用作NEAT1和miR-136-5p的内参对照。采用2-ΔΔCt方法计算相对表达量。
1.4.4   CCK-8法检测细胞增殖   收集各组瘢痕成纤维细胞，以每孔1×104个密度接种在96孔板中，每组设5个复孔，孵育48 h后，按照CCK-8检测试剂盒说明向每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育2 h，用酶标仪在450 nm波长处测量吸光度值。
1.4.5   EDU染色检测细胞增殖   收集各组瘢痕成纤维细胞，以每孔1×104个密度接种在96孔板中，待达到65%左右汇合度后，与10 μmol/L EdU在37 ℃下孵育3 h，PBS清洗3次，与1X Fixative Solution混合避光室温孵育12 min，PBS清洗3次，与1X Permeabilization Buffer室温孵育25 min，PBS清洗3次，与90 μL Reaction mix室温孵育25 min，PBS清洗3次，与DAPI溶液避光孵育15 min，最后用激光共聚焦显微镜观察。
1.4.6   流式细胞术检测细胞凋亡   收集各组瘢痕成纤维细胞并用PBS洗涤，用结合缓冲液重悬后以1×105个/孔密度接种在6孔板中，用5 μL Annexin V-FITC 和10 μL 碘化丙啶室温(20-25 ℃)避光孵育10 min，上流式细胞仪检测，用Cell Quest软件对数据结果进行分析、处理，计算出各组细胞凋亡的百分比。
1.4.7   划痕实验检测细胞迁移   收集各组瘢痕成纤维细胞，以1×106个/孔密度接种在6孔板中，当细胞汇合后，用20 μL移液器尖端垂直于板底划痕，PBS润洗2次去除松散细胞，继续培养24 h，分别于0，24 h拍摄图像并使用Image J软件处理分析，划痕迁移率=(0 h划痕面积-24 h划痕面积)/0 h划痕面积。
1.4.8   USP4、Bax、p27、α-平滑肌肌动蛋白、基质金属蛋白酶9、Ⅰ型胶原蛋白α1链蛋白表达的检测   提取皮肤组织匀浆和各组瘢痕成纤维细胞的总蛋白，经BCA法定量后，取30 μg蛋白进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(电压100 V，电泳时间2 h)分离，电转移(电流250 mA，转膜时间1 h)到聚偏二氟乙烯膜上，利用5%脱脂牛奶进行封闭后，将膜与一抗USP4(1∶2 000)、p27(1∶1 000)、Bax (1∶1 000)、基质金属蛋白酶9(1∶2 000)、α-平滑肌肌动蛋白(1∶2 000)、Ⅰ型胶原蛋白α1链(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)在4 ℃过夜孵育，然后与二抗(1∶1 000)孵育1.5 h。使用ECL试剂显影，Image J软件计算蛋白灰度值。
1.4.9   靶向关系验证   将含有突变型(MUT)和野生型(WT)的3′非翻译区(3′UTR)NEAT1、USP4片段分别插入pRL-TK报告质粒中，构建荧光素酶报告质粒。将荧光素酶报告质粒与mimic NC或miR-136-5p mimic共转染于瘢痕成纤维细胞，48 h后检测荧光素酶活性。 
1.5   主要观察指标   瘢痕成纤维细胞的增殖、凋亡、迁移能力以及增殖(p27)、凋亡(Bax)、迁移(基质金属蛋白酶9)、细胞外基质沉积相关蛋白(α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原蛋白α1链蛋白)表达、双荧光素酶活性变化。
1.6   统计学分析   数据以x±s表示，所有实验均重复3次，使用SPSS 22.0软件进行统计分析。单因素方差分析用于多组间的比较，进一步两两比较行SNK-q检验。P < 0.05表明差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过上海中医药大学附属曙光医院生物统计学专家审核。

瘢痕疙瘩是一种良性皮肤肿瘤，目前没有有效的治疗方法[15-18]。成纤维细胞被认为是瘢痕疙瘩形成的关键效应细胞，在瘢痕疙瘩形成中已发现异常细胞增殖、转移、细胞外基质过度沉积等功能障碍[19-22]。因此，寻找可以预防成纤维细胞功能障碍的分子靶点可能是治疗瘢痕疙瘩的有效方法。
大量研究表明lncRNA在包括纤维化疾病在内的各种疾病中发挥着重要作用[23-27]。NEAT1是一种最近研究较多的lncRNA，已有研究发现NEAT1在肥厚性瘢痕组织中显著上调，NEAT1敲低抑制了肥厚性瘢痕成纤维细胞的活力和增殖[28]；沉默NEAT1可以抑制酒精性脂肪肝炎小鼠的肝纤维化，从而减缓酒精性脂肪肝炎的发展[29]，表明NEAT1具有促进纤维化疾病进展的作用。p27是一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，可阻止或减缓细胞分裂，已有研究报道，p27蛋白在增生性瘢痕成纤维细胞中低表达[30]；四甲基吡嗪可以促进Bax蛋白的表达进而诱导增生性瘢痕成纤维细胞的凋亡[31]；miR-188-5p的上调抑制了瘢痕成纤维细胞中基质金属蛋白酶9的蛋白表达，进而抑制细胞迁移[32]；α-平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白α1链的上调表明细胞外基质积累，从而促进了肥厚性瘢痕成纤维细胞的原纤维形成[33-35]。该研究结果显示，NEAT1在瘢痕疙瘩组织和细胞中高表达，沉默NEAT1可促进瘢痕成纤维细胞中Bax、p27蛋白表达及细胞凋亡，抑制基质金属蛋白酶9、α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原蛋白α1链蛋白表达及细胞增殖、迁移，提示沉默NEAT1可通过抑制瘢痕成纤维细胞增殖、迁移和细胞外基质沉积，诱导细胞凋亡，进而延缓瘢痕疙瘩的进展，提示NEAT1可能成为治疗瘢痕疙瘩的潜在有效靶点。
最近，lncRNA作为一种通过“海绵”吸附机制与miRNA结合的内源竞争RNA引起了广泛关注[36-40]。该研究证实了miR-136-5p与NEAT1可靶向结合。研究显示，过表达miR-136可改善糖尿病大鼠肾纤维化[41]；上调miR-136-5p可抑制胰腺癌细胞增殖及迁移行为[42]。而关于miR-136-5p对瘢痕成纤维细胞生物学行为的影响鲜有报道。该研究表明下调NEAT1促进了瘢痕成纤维细胞中miR-136-5p的表达，这就促使研究者联想到下调NEAT1抑制瘢痕成纤维细胞增殖、迁移并诱导细胞凋亡的分子机制可能与上调miR-136-5p有关。为了证明上述推测是否与实际情况一致，该实验对瘢痕成纤维细胞同时转染si-NEAT1和miR-136-5p inhibitor，结果表明，miR-136-5p inhibitor逆转了下调NEAT1对瘢痕成纤维细胞生物学行为的影响，证实了沉默NEAT1抑制瘢痕成纤维细胞增殖、迁移并诱导细胞凋亡的行为确实与促进miR-136-5p表达有关，这进一步证实了NEAT1/miR-136-5p轴在调控瘢痕疙瘩进展中的重要作用。
为了进一步探究miR-136-5p作用的机制，该研究验证了USP4是miR-136-5p的靶基因。USP4作为泛素特异性蛋白酶家族的一员，有研究显示USP4缺陷小鼠胚胎成纤维细胞的生长受到抑制[43]；USP4在增生性瘢痕中表达增加，沉默USP4会导致瘢痕成纤维细胞增殖和迁移能力减弱，细胞凋亡能力增强[44]。该研究结果基本与其一致。该研究表明，下调NEAT1后，瘢痕成纤维细胞中miR-136-5p的表达为升高趋势，USP4的表达为降低趋势；而对瘢痕成纤维细胞同时进行沉默NEAT1以及抑制miR-136-5p 处理后，miR-136-5p的表达为降低趋势，USP4的表达为升高趋势，阐明了NEAT1/miR-136-5p/USP4轴中的分子失调会对瘢痕疙瘩的进展产生一定影响。
综上所述，沉默NEAT1抑制瘢痕成纤维细胞增殖、迁移并诱导细胞凋亡的行为可能与调节miR-136-5p/USP4有关。该研究可能为瘢痕疙瘩的治疗提供潜在的有效靶点。未进行体内动物实验进一步验证上述结论是否成立是该研究设计的不足之处，后期将会继续深入探究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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瘢痕疙瘩是一种皮肤纤维化疾病，主要特征表现为成纤维细胞大量增殖、细胞外基质过度沉积。尽管瘢痕疙瘩是一种非恶性疾病，但会导致患者身体、心理和社会不适，从而严重影响生活质量。目前，手术切除为瘢痕疙瘩的主要治疗方法，但该方法效果不佳。因此，亟需探索瘢痕疙瘩的发病机制，并寻找有效的治疗靶点。核富集转录本1(nuclear enriched abundant transcript 1，NEAT1)是近年来备受瞩目的一种长链非编码RNA，已有报道阐述，NEAT1的下调会抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的进展，但具体机制尚不完全清楚。因此，研究NEAT1对瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学行为的影响，可能为瘢痕疙瘩的治疗提供潜在的有效靶点。#br# 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程#br#

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