Caveolin-1介导流体剪切应力调控MC3T3-E1成骨细胞增殖和凋亡

doi:10.12307/2024.840

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (34): 5440-5445.doi: 10.12307/2024.840

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Caveolin-1介导流体剪切应力调控MC3T3-E1成骨细胞增殖和凋亡

移植，詹红伟，王耀斌，梁晓远，牛永康，向德剑，耿彬，夏亚一

兰州大学第二医院骨科，甘肃省骨科临床医学研究中心，甘肃省智能骨科行业技术中心，甘肃省兰州市 730030

收稿日期:2023-12-25 接受日期:2024-01-25 出版日期:2024-12-08 发布日期:2024-03-14
通讯作者: 夏亚一，博士，教授，主任医师，博士生导师，兰州大学第二医院骨科，甘肃省兰州市 730030
作者简介:移植，男，1998年生，汉族，甘肃省天水市人，兰州大学在读硕士，主要从事骨质疏松和运动医学的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81960403)，项目负责人：耿彬；国家自然科学基金项目(82060405，82360436)，项目负责人：夏亚一；甘肃省自然科学基金项目(22JR5RA943)，项目负责人：耿彬；兰州大学第二医院“萃英科技创新”计划(CY2021-MS-A07)，项目负责人：耿彬

Caveolin-1 mediated fluid shear stress regulates proliferation and apoptosis of MC3T3-E1 osteoblasts

Yi Zhi, Zhan Hongwei, Wang Yaobin, Liang Xiaoyuan, Niu Yongkang, Xiang Dejian, Geng Bin, Xia Yayi

Department of Orthopaedics, Orthopedic Clinical Medical Research Center of Gansu Province, Intelligent Orthopedic Industry Technology Center of Gansu Province, The Second Hospital & Clinical Medical School, Lanzhou University, Lanzhou 730030, Gansu Province, China

Received:2023-12-25 Accepted:2024-01-25 Online:2024-12-08 Published:2024-03-14
Contact: Xia Yayi, PhD, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Orthopaedics, Orthopedic Clinical Medical Research Center of Gansu Province, Intelligent Orthopedic Industry Technology Center of Gansu Province, The Second Hospital & Clinical Medical School, Lanzhou University, Lanzhou 730030, Gansu Province, China
About author:Yi Zhi, Master candidate, Department of Orthopaedics, Orthopedic Clinical Medical Research Center of Gansu Province, Intelligent Orthopedic Industry Technology Center of Gansu Province, The Second Hospital & Clinical Medical School, Lanzhou University, Lanzhou 730030, Gansu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, Nos. 81960403 (to GB), 82060405 (to XYY), and 82360436 (to XYY); Natural Science Foundation of Gansu Province, No. 22JR5RA943 (to GB); “Cuiying Science and Technology Innovation” Program of the Second Hospital of Lanzhou University, No. CY2021-MS-A07 (to GB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

流体剪切应力(Fluid Shear Stress)：一种力学刺激，其能够通过骨组织细胞上的机械感受器将细胞外的生物力学信号传递到细胞内，并转换为生物化学信号，调节细胞一系列的生物功能，对于维持骨代谢具有重要作用。
Caveolin-1(Cav-1)：一种广泛表达的膜蛋白，可与多种信号转导分子相互作用，广泛调节细胞中多种代谢过程，是信号转导的关键靶点。

背景：流体剪切应力在成骨细胞增殖和凋亡中起着重要作用。然而，Caveolin-1(Cav-1)是否参与成骨细胞中流体剪切应力诱导的增殖与凋亡过程尚不清楚。

目的：探讨Cav-1在流体剪切应力调控成骨细胞增殖和凋亡中的作用。
方法：选择生长状态良好的MC3T3-E1成骨细胞，加载不同时间(0，30，60，90 min)且强度为1.2 Pa的流体剪切应力，观察Cav-1蛋白的表达，筛选出时间为60 min的条件进行实验。将MC3T3-E1细胞分为：对照组、流体剪切应力组、流体剪切应力+pcDNA 3.1组(对照)、流体剪切应力+pcDNA Cav-1组(过表达质粒)，分别采用流体剪切应力和过表达Cav-1等方式干预，通过qRT-PCR和Western blot检测MC3T3-E1细胞内增殖以及凋亡相关分子的表达量；通过CCK-8与EdU实验检测MC3T3-E1细胞增殖活性；采用Hoechst 33258染色以及流式细胞术检测MC3T3-E1细胞凋亡情况。

结果与结论：加载流体剪切应力后MC3T3-E1细胞中Cav-1的表达显著下调，且加载60 min表达水平最低。过表达Cav-1减弱了流体剪切应力促进MC3T3-E1细胞增殖及抑制细胞凋亡的效应。说明Cav-1在流体剪切应力调节成骨细胞增殖和凋亡过程中具有重要的作用，并可能为骨质疏松症提供潜在治疗策略。

https://orcid.org/0000-0002-5673-472X(移植)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨质疏松, 流体剪切应力, Caveolin-1, 成骨细胞, 增殖, 凋亡

Abstract: BACKGROUND: Fluid shear stress plays an important role in osteoblast proliferation and apoptosis. However, whether Caveolin-1 is involved in the process of fluid shear stress-induced proliferation and apoptosis in osteoblasts is unknown.
OBJECTIVE: To explore the role of Caveolin-1 in fluid shear stress-regulated osteoblast proliferation and apoptosis.
METHODS: The MC3T3-E1 osteoblasts in good growth status were selected and loaded with fluid shear stress at an intensity of 1.2 Pa for different times (0, 30, 60, 90 minutes). The expression of Caveolin-1 protein was observed and conditions with a time of 60 minutes were screened for the experiment. MC3T3-E1 cells were divided into control group, fluid shear stress group, fluid shear stress+pcDNA 3.1 group (control), fluid shear stress+pcDNA Cav-1 group (plasmid overexpression), and intervened with fluid shear stress and overexpression of Cav-1, respectively. The expression of molecules related to proliferation and apoptosis in MC3T3-E1 cells was detected by qRT-PCR and western blot. In addition, the proliferative activity of MC3T3-E1 cells was detected by cell counting kit-8 and EdU assay; and cell apoptosis was detected by Hoechst 33258 and flow cytometry.
RESULTS AND CONCLUSION: The expression of Caveolin-1 in MC3T3-E1 cells was significantly down-regulated after loading fluid shear stress, and the expression level was lowest after 60 minutes. Overexpression of Caveolin-1 attenuated the proliferation-promoting and apoptosis-suppressing effects of fluid shear stress in MC3T3-E1 cells. In conclusion, Caveolin-1 has a vital role in fluid shear stress-regulated osteoblast proliferation and apoptosis, which may offer a potential therapeutic strategy for osteoporosis.

Key words: osteoporosis, fluid shear stress, Caveolin-1, osteoblast, proliferation, apoptosis

中图分类号:

移植, 詹红伟, 王耀斌, 梁晓远, 牛永康, 向德剑, 耿彬, 夏亚一. Caveolin-1介导流体剪切应力调控MC3T3-E1成骨细胞增殖和凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(34): 5440-5445.

Yi Zhi, Zhan Hongwei, Wang Yaobin, Liang Xiaoyuan, Niu Yongkang, Xiang Dejian, Geng Bin, Xia Yayi. Caveolin-1 mediated fluid shear stress regulates proliferation and apoptosis of MC3T3-E1 osteoblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(34): 5440-5445.

图/表（结果） 6

2.1 流体剪切应力对MC3T3-E1成骨细胞中Cav-1表达的影响 Western blot分析不同时间梯度(0，30，60，90 min)对MC3T3-E1细胞中Cav-1蛋白的调控作用。结果表明，加载1.2 Pa流体剪切应力后，细胞中Cav-1表达显著下调，并且随着流体剪切应力作用时间的延长，表达水平逐渐降低。其中，当流体剪切应力加载60 min时，Cav-1表达水平最低，见图1。综上，后续实验中流体剪切应力均按照强度为1.2 Pa和时间为60 min的条件进行。

2.2 上调Cav-1减弱流体剪切应力对于成骨细胞增殖和凋亡的影响为了进一步研究Cav-1是否参与流体剪切应力调控的成骨细胞增殖与凋亡过程，以转染pcDNA Cav-1来上调Cav-1的表达。qRT-PCR与Western blot的结果表明，Cav-1蛋白表达在对照组与pcDNA 3.1转染组之间没有差异，而在pcDNA Cav-1转染组中表达水平显著上调，见图2。

2.2.1 上调Cav-1降低流体剪切应力促进成骨细胞增殖的作用通过qRT-PCR与Western blot检测的结果表明，相比于对照组，流体剪切应力能够显著上调PCNA、CDK4和Cyclin D1的水平；而Cav-1的过表达可以降低上述分子表达水平的增加，见图3。此外，CCK-8与EdU实验进一步证明，与对照组相比，加载流体剪切应力后成骨细胞增殖活力与EdU阳性细胞的数量显著增加；而上调Cav-1后，这一促进作用被减弱，见图4。这些结果表明，Cav-1的上调降低了流体剪切应力的促增殖作用。

2.2.2 上调Cav-1降低流体剪切应力抑制成骨细胞凋亡的作用通过Western blot的结果表明，相比于对照组，流体剪切应力能够显著下调Bax和Cleaved Caspase-3的表达并上调Bcl-2的表达水平；而Cav-1的过表达可以逆转上述分子表达水平的变化，见图5。此外，Hoechst 33258染色与流式细胞术的实验结果进一步表明，与对照组相比，加载流体剪切应力后成骨细胞凋亡率显著降低；而上调Cav-1后，这一效应被减弱，见图6。这些结果表明，Cav-1的上调降低了流体剪切应力的抗凋亡作用。

参考文献

[1] GOPINATH V.Osteoporosis. Med Clin North Am. 2023;107(2):213-225.
[2] SALARI N, GHASEMI H, MOHAMMADI L, et al. The global prevalence of osteoporosis in the world: a comprehensive systematic review and meta-analysis. J Orthop Surg Res. 2021;16(1):609.
[3] 毛贝尼, 张钟, 付维力, 等.中国骨质疏松性骨折疾病负担的系统评价[J].中国循证医学杂志,2018,18(2):151-155.
[4] CHEN X, WANG Z, DUAN N, et al.Osteoblast-osteoclast interactions.Connect Tissue Res. 2018;59(2):99-107.
[5] KIM J M, LIN C, STAVRE Z, et al. Osteoblast-Osteoclast Communication and Bone Homeostasis. Cells. 2020;9(9):2073.
[6] KAUR M, NAGPAL M, SINGH M. Osteoblast-n-Osteoclast: Making Headway to Osteoporosis Treatment.Curr Drug Targets. 2020;21(16): 1640-1651.
[7] NEVE A, CORRADO A, CANTATORE FP. Osteoblast physiology in normal and pathological conditions. Cell Tissue Res. 2011;343(2):289-302.
[8] WOLFF J. Das Gesetz der Transformation der Knochen. Deutsche Medizinische Wochenschrift. 1893;19(47):1222 - 1224.
[9] BASSO N, HEERSCHE JN. Characteristics of in vitro osteoblastic cell loading models. Bone. 2002;30(2):347-351.
[10] BIN G, BO Z, JING W, et al. Fluid shear stress suppresses TNF-α-induced apoptosis in MC3T3-E1 cells: Involvement of ERK5-AKT-FoxO3a-Bim/FasL signaling pathways. Exp Cell Res. 2016;343(2):208-217.
[11] WANG X, GENG B, WANG H, et al. Fluid shear stress-induced down-regulation of microRNA-140-5p promotes osteoblast proliferation by targeting VEGFA via the ERK5 pathway. Connect Tissue Res. 2022;63(2): 156-168.
[12] WANG X, HE J, WANG H, et al. Fluid shear stress regulates osteoblast proliferation and apoptosis via the lncRNA TUG1/miR-34a/FGFR1 axis. J Cell Mol Med. 2021;25(18):8734-8747.
[13] MAO L, GUO J, HU L, et al. The effects of biophysical stimulation on osteogenic differentiation and the mechanisms from ncRNAs.Cell Biochem Funct. 2021;39(6):727-739.
[14] ZHAO X, ZHAO D, GENG B, et al. A novel ceRNA regulatory network involving the long noncoding NEAT1, miRNA-466f-3p and its mRNA target in osteoblast autophagy and osteoporosis. J Mol Med (Berl). 2022;100(11):1629-1646.
[15] PEI T, SU G, YANG J, et al.Fluid Shear Stress Regulates Osteogenic Differentiation via AnnexinA6-Mediated Autophagy in MC3T3-E1 Cells.Int J Mol Sci. 2022;23(24):15702.
[16] ENGELMAN J A, WYKOFF CC, YASUHARA S, et al. Recombinant expression of caveolin-1 in oncogenically transformed cells abrogates anchorage-independent growth. J Biol Chem. 1997;272(26):16374-16381.
[17] BAKER N, ZHANG G, YOU Y, et al. Caveolin-1 regulates proliferation and osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. J Cell Biochem. 2012;113(12):3773-3787.
[18] DALTON CM, SCHLEGEL C, HUNTER CJ. Caveolin-1: A Review of Intracellular Functions, Tissue-Specific Roles, and Epithelial Tight Junction Regulation. Biology (Basel). 2023;12(11):1402.
[19] LAI X, GUO Y, CHEN M, et al. Caveolin1: its roles in normal and cancer stem cells. J Cancer Res Clin Oncol. 2021;147(12):3459-3475.
[20] GOKANI S, BHATT LK.Caveolin-1: A Promising Therapeutic Target for Diverse Diseases. Curr Mol Pharmacol. 2022;15(5):701-715.
[21] SAWAI Y, SUZUKI Y, ASAGIRI M, et al. Caveolin-1 forms a complex with P2X7 receptor and tunes P2X7-mediated ATP signaling in mouse bone marrow-derived macrophages. Am J Physiol Cell Physiol. 2024; 326(1):C125-C142.
[22] KRUGLIKOV IL, SCHERER PE. Caveolin-1 as a possible target in the treatment for acne. Exp Dermatol. 2020;29(2):177-183.
[23] SAMARAKOON R, HIGGINS SP, HIGGINS CE, et al. The TGF-β1/p53/PAI-1 Signaling Axis in Vascular Senescence: Role of Caveolin-1. Biomolecules. 2019;9(8):341.
[24] RUBIN J, SCHWARTZ Z, BOYAN BD, et al. Caveolin-1 knockout mice have increased bone size and stiffness.J Bone Miner Res. 2007;22(9):1408-1418.
[25] JIN Z, KHO J, DAWSON B, et al. Nitric oxide modulates bone anabolism through regulation of osteoblast glycolysis and differentiation. J Clin Invest. 2021;131(5):e138935.
[26] RAZANI B, ENGELMAN JA, WANG XB, et al. Caveolin-1 null mice are viable but show evidence of hyperproliferative and vascular abnormalities. J Biol Chem. 2001;276(41):38121-38138.
[27] CEREZO A, GUADAMILLAS MC, GOETZ JG, et al. The absence of caveolin-1 increases proliferation and anchorage- independent growth by a Rac-dependent, Erk-independent mechanism. Mol Cell Biol. 2009; 29(18):5046-5059.
[28] XIA H, KHALIL W, KAHM J, et al. Pathologic caveolin-1 regulation of PTEN in idiopathic pulmonary fibrosis. Am J Pathol. 2010;176(6):2626-2637.
[29] KARIMIAN A, AHMADI Y, YOUSEFI B.Multiple functions of p21 in cell cycle, apoptosis and transcriptional regulation after DNA damage.DNA Repair (Amst).2016;42:63-71.
[30] VOUSDEN KH, PRIVES C. Blinded by the Light: The Growing Complexity of p53. Cell. 2009;137(3):413-431.
[31] ZHANG J, LAZARENKO OP, BLACKBURN ML, et al. Soy protein isolate down-regulates caveolin-1 expression to suppress osteoblastic cell senescence pathways. FASEB J. 2014;28(7):3134-3145.
[32] GALBIATI F, VOLONTE D, ENGELMAN JA, et al. Targeted downregulation of caveolin-1 is sufficient to drive cell transformation and hyperactivate the p42/44 MAP kinase cascade. EMBO J. 1998;17(22):6633-6648.

引言

骨质疏松是一种以骨量低下、骨微结构破坏、骨脆性增加、骨强度下降为典型特征的全身性、代谢性骨骼系统疾病[1]。随着现代社会生活习惯的改变及人口老龄化程度的加剧，骨质疏松成为了重大的公共卫生问题。骨质疏松伴随的损伤不仅严重影响患者的生活质量，而且相应的诊疗费用也给社会和家庭带来了巨大经济负担[2-3]。因此，对于骨质疏松及并发症的相关研究尤为必要。
从微观角度看，成骨细胞与破骨细胞间的相互作用决定着骨质疏松的进展，因此提高成骨细胞活性、促进骨形成是治疗骨质疏松的一种策略[4-6]。然而成骨细胞的代谢是一个复杂的生理过程，由细胞增殖、分化、凋亡等多个步骤调控[7]。此外，经典的Wolff定律表明机械应力能够调节骨重塑和体内稳态，适当的机械载荷能够促进骨形成[8]。而越来越多的证据进一步表明，流体剪切应力(Fluid Shear Stress)作为调控骨代谢的主要应力模式[9]，在成骨细胞代谢方面发挥着极其重要的作用[10-15]。
Caveolin-1(Cav-1)是一种在多种细胞类型中广泛表达的膜蛋白，可与多种信号转导分子相互作用，广泛调节细胞增殖、分化和凋亡等代谢过程，是信号转导的关键靶点[16-20]。值得注意的是，这种相互作用在大多数情况下是抑制性的，会导致信号分子的失活[21-23]。随着研究的深入，Cav-1在骨代谢过程中的作用受到广泛关注。先前有报道称，Cav-1缺失小鼠不仅增加骨量和骨硬度，而且有利于骨髓来源的间充质干细胞向成骨细胞表型转化[24]；同时，在人间充质干细胞中有相似的发现，即下调Cav-1表达可增强间充质干细胞的增殖和成骨分化[17]。最近，JIN等[25]进一步发现Cav-1作为一氧化氮合成的负调控因子，其缺失可通过刺激一氧化氮合成来进一步增加小鼠成骨细胞分化和骨量。
然而，Cav-1是否参与力学刺激对MC3T3-E1成骨细胞生物学行为的影响，仍有待进一步的研究。此次实验以流体剪切应力作为力学刺激，研究MC3T3-E1成骨细胞中Cav-1在流体剪切应力作用下的表达变化，并探讨Cav-1在流体剪切应力诱导增殖和抑制凋亡中的作用，旨在从细胞与分子层面上揭示成骨的相关机制，为今后骨质疏松的治疗提供理论支撑。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2022年3月至2023年11月在兰州大学第二医院骨科实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞小鼠MC3T3-E1细胞购自中国医学科学院。
1.3.2 试剂 α-MEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco，美国)；磷酸盐缓冲液(PBS)；TRIzol试剂(Invitrogen，美国)；RIPA裂解液(Beyotime，中国)；BCA试剂盒(Beyotime，中国)；增强型ECL试剂盒(Biosharp，中国)；CCK-8试剂盒(Yeasen，中国)；EdU试剂盒(RiboBio，中国)；Hoechst 33258试剂(Solarbio，中国)；Annexin V-FITC/PI试剂盒(MULTI SCIENCES，中国)；β-actin一抗、Cav-1一抗、Bax一抗、Bcl-2一抗、Cleaved Caspase-3一抗、CDK4一抗、Cyclin D1一抗(Proteintech，中国)、PCNA一抗(Affinity，中国)；二抗(ZSGB-BIO，中国)；质粒以及GP-transfect-Mate转染试剂(GenePharma，中国)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养采用由α-MEM基础培养基和体积分数10%胎牛血清配制而成的完全培养基培养小鼠MC3T3-E1细胞。细胞基于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱内培养，根据细胞状态一两天换液1次，当细胞生长贴壁至80%-90%时或者出现接触抑制时进行传代，选择10代以内的细胞进行实验。
1.4.2 流体剪切应力加载选择状态良好的MC3T3-E1细胞，以5×108 L-1浓度接种在20 mm×50 mm大小的玻片上，将玻片置于10 cm×10 cm培养皿内，放入培养箱等待细胞完全贴壁后，加入5 mL完全培养基继续培养。待细胞融合至80%-90%后，采用实验室自主研发的平板流动室装置(实用新型专利号：ZL201520637211.6)，设定加载强度为1.2 Pa来模拟体外流体剪切应力。
1.4.3 细胞转染取状态良好的细胞按3×108 L-1的浓度接种于6孔板，并最终用完全培养基定容为2 mL。待细胞融合度达到60%-80%时，按照GenePharma公司的转染说明书进行Cav-1基因的过表达质粒(pcDNA Cav-1)及其对照(pcDNA 3.1)的转染。将配制的转染复合物加入到细胞后放入培养箱中培养，6 h后更换为完全培养基继续培养。分别于48，72 h后提样，检测目的分子的mRNA与蛋白表达量。

1.4.4 qRT-PCR实验使用TRIzol试剂从干预过的细胞中提取总RNA。然后通过分光光度计(DeNovix DS-11)测定总RNA的浓度和纯度、反转录合成cDNA，随后以cDNA为模板进行qRT-PCR反应。GAPDH作为内源性对照，计算目的基因的相对mRNA表达水平。qRT-PCR采用的引物为擎科生物科技股份有限公司合成，引物序列见表1。

1.4.5 Western blot实验使用细胞裂解液提取总蛋白，并通过BCA试剂盒定量蛋白质浓度。内参选择β-actin，配制10% SDS-PAGE凝胶。然后经过上样、电泳、电转、封闭、一抗[Cav-1、PCNA、Bcl-2和Cleaved Caspase-3(均为1∶2 000)、Cyclin D1(1∶10 000)、Bax(1∶5 000)，CDK4和β-actin(1∶3 000)]孵育、二抗(1∶5 000)孵育等步骤，最后使用ECL试剂盒可视化蛋白质条带。使用Image J软件定量分析蛋白表达。
1.4.6 细胞活力测定通过CCK-8实验测定细胞活力。实验分为：对照组、流体剪切应力组、流体剪切应力+pcDNA 3.1组、流体剪切应力+pcDNA Cav-1组。将对照组和干预组按照同一细胞密度(3×103/孔)接种于96孔板中，此外设置仅加入培养基的空白组，每孔加培养基100 μL，每组设5个复孔。此外为了减少蒸发带来的影响，周围边缘孔中加入PBS。当需要测定时，将配置好的含10% CCK-8试剂的培养基以换液形式加入，然后将96孔板放入培养箱中孵育1 h。随后，用酶标仪检测各孔在450 nm波长处的吸光度值。
1.4.7 EdU实验选择对数生长期的MC3T3-E1成骨细胞接种于盖玻片上，按1.4.6分组，施加不同的干预后，放于培养箱中孵育。根据Edu试剂盒的说明书进行后续操作，每孔加入200 μL稀释后的A液培养基，继续孵育3 h。随后采用多聚甲醛进行固定，1% Triton-X100通透，以及加入配制的EdU混合液与Hoechst 33342试剂等步骤，最后使用荧光显微镜拍摄图片，观察阳性细胞数。
1.4.8 Hoechst 33258染色实验按1.4.6分组。用PBS将细胞清洗后固定20 min。在避光条件下，加入Hoechst 33258试剂染色10 min，PBS清洗3次。加入适量的抗荧光淬灭封片剂，荧光显微镜拍照观察细胞核形态变化。
1.4.9 流式细胞术用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡情况。实验按1.4.6分组。收集各组细胞并用预冷的PBS清洗后，加入500 μL Binding Buffer将细胞重悬，并转入流式管中。避光条件下，各管分别加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染液，充分反应15 min，随后使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.5 主要观察指标 ① 流体剪切应力对MC3T3-E1成骨细胞中Cav-1表达的影响；②上调Cav-1减弱流体剪切应力对于成骨细胞增殖和凋亡的影响。
1.6 统计学分析所有实验均至少重复3次，数据以x±s表示。使用SPSS 26.0软件进行统计学分析，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。该文章的统计学方法已经兰州大学第二医院生物统计学专家审核。

讨论

近年来，越来越多的关注点聚焦于力学因素对骨代谢的影响方面。成骨细胞不仅参与新骨的形成，而且还参与感知机械负荷的变化，并产生调控成骨过程的信号。因此，此次实验通过MC3T3-E1成骨细胞研究机械负荷介导成骨的相关机制，依靠课题组研发的流体剪切应力加载装置探索了流体剪切应力刺激下Cav-1的表达情况，并通过Western blot实验发现不同加载时间的流体剪切应力对于MC3T3-E1细胞中的Cav-1表达有着不同的影响，并且得出加载60 min的流体剪切应力对于下调Cav-1蛋白表达最明显。有趣的是，BIN等[10]发现加载流体剪切应力1.2 Pa 1 h能够抑制肿瘤坏死因子α诱导的MC3T3-E1细胞凋亡。同样地，WANG等[12]发现当加载1.2 Pa大小的流体剪切应力持续1 h后，显著促进MC3T3-E1细胞的增殖并抑制其凋亡。由此推测流体剪切应力可能通过抑制Cav-1分子表达促进成骨细胞增殖和抑制成骨细胞凋亡。
正常生理条件下，流体剪切应力为骨组织内存在的最主要的力学刺激，骨组织内动态的机械应力环境可以促使小管液在骨小管系统中流动，从而产生流体剪切应力作用于细胞的感受器[9]。以往的研究发现流体剪切应力能够通过多种信号转导来调控成骨细胞的生物学过程，例如ERK5通路和lncRNA TUG1/miR-34a/FGFR1轴[10，12]。基于现有的研究成果，该研究的课题组一直致力于探索流体剪切应力调控成骨细胞生理活性的机制，旨在进一步丰富流体力学信号转导理论。Cav-1作为信号传导的关键蛋白，可与多种信号分子相互作用来调节细胞的代谢。RAZANI等[26]揭示了胚胎成纤维细胞中Cav-1与生理条件下细胞周期之间关系，即Cav-1的缺陷会导致更高的细胞增殖率。下调成纤维细胞中的Cav-1基因，能够产生过度增殖和抗凋亡的细胞表型[27-28]。此外，p53与p21基因可以诱导细胞周期的停滞与细胞凋亡[29-30]，而当敲除Cav-1基因后会导致p53与p21基因表达的显著降低[31]，说明沉默Cav-1基因一定程度上有利于细胞增殖与抵抗凋亡。基于此，作者进一步探索了流体剪切应力调控成骨细胞增殖和凋亡的详细机制。成骨细胞增殖方面，PCNA、CDK4和Cyclin D1表达水平的变化证明了Cav-1参与流体剪切应力促进MC3T3-E1细胞增殖的过程，同时通过CCK-8 以及EdU实验进一步验证了此结论；成骨细胞凋亡方面，Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3的蛋白表达情况说明了Cav-1同样参与流体剪切应力介导的抗凋亡过程，同时使用Hoechst 33258以及流式细胞术进一步证实。综上，研究通过相互印证、相辅相成的实验设计阐明了Cav-1参与流体剪切应力调控成骨细胞增殖和凋亡的新机制。值得一提的是，此次实验所得出的研究结论从一定程度上也支持了上述的观点。关于更详细的调控机制，先前报道称Cav-1的表达会抑制Ras/MAPK通路，从而导致细胞周期停滞以及细胞凋亡[16]。同时GALBIATI等[32]发现Cav-1的表达水平在快速分裂的细胞中下调，而上调Cav-1的表达水平会导致接触抑制和负调控细胞的p42/44 MAPK通路，导致生长停滞。因此，流体剪切应力调控MC3T3-E1成骨细胞的分子机制仍有待探索，是否存在上述的调控关系仍有待验证。
目前的研究存在一些局限性：一方面，研究成果仅基于细胞实验，缺乏动物实验验证，因此需要通过体内实验进一步证实；另一方面，实验仅对MC3T3-E1细胞加载流体剪切应力从而研究其机械特性，对于其他骨组织细胞(骨髓间充质干细胞，骨细胞)未进行研究。因而今后还需要进一步完善不同细胞类型的研究。
综上所述，流体剪切应力能够下调MC3T3-E1细胞中Cav-1的表达，并且Cav-1参与流体剪切应力调控的成骨细胞增殖和凋亡的过程。因此，此项研究为力学刺激在骨质疏松治疗的研究中提供了新思路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Caveolin-1介导流体剪切应力调控MC3T3-E1成骨细胞增殖和凋亡

Caveolin-1 mediated fluid shear stress regulates proliferation and apoptosis of MC3T3-E1 osteoblasts

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[1]	郭苏童, 冯德宏, 郭宇, 王凌, 丁育健, 刘仪, 钱正瑛, 李明洋. 正常与骨质疏松髋关节模型的建立及有限元分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1342-1346.
[2]	杨策凯, 蔡卓延, 陈明, 刘昊, 翁汭, 崔健超, 张顺聪, 姚珍松. 绝经后女性椎旁肌退化与经皮穿刺椎体成形后再骨折的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1414-1419.
[3]	杨玉芳, 杨芷姗, 段棉棉, 刘毅恒, 唐正龙, 王宇. 促红细胞生成素在骨组织工程中的应用及前景[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1443-1449.
[4]	杨毅峰, 叶楠, 王琳, 郭帅成, 黄健. 右美托咪定抗缺血再灌注损伤的信号通路[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1464-1469.
[5]	章晓云, 刘桦, 柴源, 陈锋, 曾浩, 高振罡, 黄有荣. 益肾固疏方干预老年性骨质疏松症患者骨代谢标志物的变化及临床疗效[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1155-1160.
[6]	岳云, 王佩佩, 袁兆鹤, 何生存, 贾戌生, 刘倩, 李占涛, 付慧玲, 宋斐, 贾孟辉. 巴豆霜干预脑缺血再灌注损伤大鼠皮质区JNK/p38 MAPK及神经元凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1186-1192.
[7]	代越星, 郑利钦, 吴敏辉, 李志鸿, 李少彬, 郑德声, 林梓凌. 血管数量对小血管网计算流体力学的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1206-1210.
[8]	童奕博 , 李明辉. 骨质疏松性椎体骨折患者椎体成形后邻近椎体再发骨折的影响因素[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1241-1246.
[9]	王雯, 郑芃芃, 孟浩浩, 刘浩, 袁长永. 过表达Sema3A促进牙髓干细胞和MC3T3-E1的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 993-999.
[10]	梅静怡, 刘江, 肖聪, 刘鹏, 周浩浩, 林展翼. 组织工程血管构建过程中平滑肌细胞增殖变化及代谢模式[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1043-1049.
[11]	张敏, 彭婧, 张强, 陈德旺. 有限元法分析老年骨质疏松患者L3/4椎板减压椎间融合的力学性能[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(6): 847-851.
[12]	薛晓峰, 魏永康, 乔晓红, 杜玉勇, 牛建军, 任立新, 杨慧峰, 张治民, 郭媛, 陈维毅. 股骨颈骨折空心钉内固定后股骨近端骨质疏松的有限元分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(6): 862-867.
[13]	凯依塞尔•阿布都克力木, 麦麦提敏•阿卜力米提, 李磊, 杨晓凯, 张玉坤, 刘帅. 女性腰椎退行性病变患者腰椎CT值对骨质疏松症的诊断作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(6): 945-949.
[14]	王力平, 连天星, 胡永荣, 杨红胜, 曾智谋, 刘浩, 屈波. 胸部CT椎体HU值在2型糖尿病骨质疏松症机会性筛查中的价值[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(6): 950-954.
[15]	余照宇, 谭黎鑫, 孙凯, 鲁尧, 李勇. 骨水泥强化椎弓根螺钉治疗骨质疏松性胸腰椎退行性疾病的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(5): 813-820.