针刀调控软骨细胞自噬维持骨关节炎软骨细胞的稳态

doi:10.12307/2024.830

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (34): 5452-5457.doi: 10.12307/2024.830

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针刀调控软骨细胞自噬维持骨关节炎软骨细胞的稳态

贾小飞，冉丽，马小双，黑晓燕，刘佳妮，杨楠，马海滨，常敬鹏

宁夏回族自治区人民医院(宁夏医科大学附属自治区人民医院)康复医学科，宁夏回族自治区银川市 750001

收稿日期:2023-11-22 接受日期:2024-01-25 出版日期:2024-12-08 发布日期:2024-03-14
通讯作者: 常敬鹏，中级治疗师，宁夏回族自治区人民医院(宁夏医科大学附属自治区人民医院)康复医学科，宁夏回族自治区银川市 750001
作者简介:贾小飞，男，1985年生，陕西省榆林市人，汉族，博士，副主任医师，主要从事慢性疼痛针刺康复的基础与临床研究。
基金资助:
宁夏重点研发项目(引才专项)(2020BEB04045)，项目负责人：贾小飞

Regulation of chondrocyte autophagy by acupotomy to promote chondrocyte homeostasis in osteoarthritis

Jia Xiaofei, Ran Li, Ma Xiaoshuang, Hei Xiaoyan, Liu Jiani, Yang Nan, Ma Haibin, Chang Jingpeng

Rehabilitation Medicine Center, People’s Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region (People’s Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, Ningxia Medical University), Yinchuan 750001, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Received:2023-11-22 Accepted:2024-01-25 Online:2024-12-08 Published:2024-03-14
Contact: Chang Jingpeng, Supervisor rehabilitation therapist, Rehabilitation Medicine Center, People’s Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region (People’s Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, Ningxia Medical University), Yinchuan 750001, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Jiao Xiaofei, MD, Associate chief physician, Rehabilitation Medicine Center, People’s Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region (People’s Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, Ningxia Medical University), Yinchuan 750001, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
Ningxia Hui Autonomous Region Key Research and Development Program, No. 2020BEB04045 (to JXF)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

细胞自噬：是一种存在于真核细胞中高度保守的降解过程，溶酶体将自身一些变性、衰老或受损的蛋白质及细胞器等进行降解，产生小分子和能量供细胞再次利用，从而为细胞提供能量，满足正常的细胞代谢及维持细胞内环境的稳定。
PI3K/Akt/mTOR通路：是一个重要的细胞信号传导通路，参与调控细胞生长、增殖、存活和代谢等多个生理过程。该通路在软骨细胞中也发挥着重要的调节作用，影响软骨细胞的生存、增殖、分化和基质合成，因此该通路可能成为研究软骨生物学或骨关节炎等相关疾病治疗的重要研究方向之一。

背景：针刀是治疗骨关节炎的有效方法，临床疗效肯定，但具体机制尚未明确。

目的：探讨针刀调控软骨细胞自噬维持骨关节炎软骨细胞稳态的作用。
方法：采用随机数字表法将28只新西兰兔分为对照组、骨关节炎组、针刀组和透明质酸组，每组7只，后3组保持左后肢过伸位采用石膏绷带固定6周建立膝骨关节炎模型，建模成功后，对照组与骨关节炎组不进行任何治疗，针刀组给予针刀治疗(15 min/次，1次/周)，透明质酸组膝关节腔内注射透明质酸钠溶液(1次/周)，均连续治疗5周。末次治疗后第2天，采用DR片观察兔膝关节宏观结构，透射电镜观察软骨细胞超微结构，Tunel染色检测软骨细胞凋亡，Western blot检测PI3K/Akt/mTOR通路及自噬相关蛋白表达。

结果与结论：①DR片显示，骨关节炎组兔膝关节间隙变窄、周围骨赘形成；相较于骨关节炎组，透明质酸组、针刀组兔膝关节间隙增宽，周围骨赘减少；②透射电镜下可见骨关节炎组兔膝关节软骨细胞内自噬体数量减少，细胞核皱缩、核膜破裂，细胞器形态不完整、细胞呈现明显死亡趋向；相较于骨关节炎组，透明质酸组与针刀组自噬体明显增加，细胞核核膜完整，细胞生存状态良好；③Tunel染色结果显示，相较于骨关节炎组，透明质酸组、针刀组凋亡软骨细胞明显减少；④Western blot检测结果显示，与对照组比较，骨关节炎组Beclin1、Cath D和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达降低(P < 0.05)，p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达升高(P < 0.05)；与骨关节炎组比较，透明质酸组和针刀组Beclin1、Cath D和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达升高(P < 0.05)，p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达降低(P < 0.05)；⑤结果表明，针刀可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路传导来提高软骨细胞自噬水平，维持软骨细胞稳态，最终延缓软骨退变。

https://orcid.org/0009-0004-9818-8722(贾小飞)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: , 针刀, 软骨细胞, 自噬, 骨关节炎, 软骨细胞稳态, 透明质酸

Abstract: BACKGROUND: Acupotomy is an effective method for the clinical treatment of osteoarthritis, with affirmed clinical outcomes, but the specific mechanisms remain unclear
OBJECTIVE: To investigate the role of acupotomy in modulating chondrocyte autophagy to promote chondrocyte homeostasis in osteoarthritis.
METHODS: Twenty-eight New Zealand rabbits were randomly divided into control group, osteoarthritis group, acupotomy group, and hyaluronic acid group, with seven rabbits in each group. The knee osteoarthritis rabbit model was prepared using the Videman method in the latter three groups. After modeling, the control group and osteoarthritis group received no interventions. The acupotomy group received acupotomy treatment 15 minutes per time, once a week, while the hyaluronic acid group received intra-articular injection of hyaluronic acid once a week, with a continuous treatment duration of 5 weeks. The day after the final intervention, knee joint macrostructure was observed using DR imaging, chondrocyte ultrastructure was examined through transmission electron microscopy, apoptosis of chondrocytes was assessed using Tunel staining, and western blot analysis was used to detect the expression of proteins related to the PI3K/Akt/mTOR pathway.
RESULTS AND CONCLUSION: The DR imaging results revealed that the osteoarthritis group exhibited narrowed knee joint spaces and the formation of periarticular osteophytes, while the hyaluronic acid group and acupotomy group showed widened knee joint spaces with a reduction in periarticular osteophytes. Transmission electron microscopy results demonstrated a decreased number of autophagosomes in chondrocytes in the osteoarthritis group, along with nuclear shrinkage, nuclear membrane rupture, incomplete organelle morphology, and a clear tendency towards cell death. In contrast, both the hyaluronic acid group and acupotomy group exhibited a significant increase in autophagosomes, intact nuclear membranes, and a well-preserved cellular state. Tunel staining results indicated a considerable decrease in the number of apoptotic cells in the hyaluronic acid group and acupotomy group compared with the osteoarthritis group. Western blot results revealed that, compared with the control group, the expression levels of Beclin1, Cath D, and LC3II/LC3I were significantly decreased in the osteoarthritis group (P < 0.05), while the expression levels of p-Akt/Akt and p-mTOR/mTOR were significantly increased ( P < 0.05); compared with the osteoarthritis group, the expression levels of Beclin1, Cath D, and LC3II/LC3I were significantly increased in both the hyaluronic acid group and acupotomy group (P < 0.05), while the expression levels of p-Akt/Akt and p-mTOR/mTOR were significantly decreased (P < 0.05). To conclude, acupotomy intervention can modulate the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway to enhance the autophagic level in chondrocytes, thereby maintaining chondrocyte homeostasis. This ultimately leads to a slowdown in cartilage degeneration.

Key words: acupotomy, chondrocyte, autophagy, osteoarthritis, chondrocyte homeostasis, hyaluronic acid

中图分类号:

贾小飞, 冉丽, 马小双, 黑晓燕, 刘佳妮, 杨楠, 马海滨, 常敬鹏. 针刀调控软骨细胞自噬维持骨关节炎软骨细胞的稳态[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(34): 5452-5457.

Jia Xiaofei, Ran Li, Ma Xiaoshuang, Hei Xiaoyan, Liu Jiani, Yang Nan, Ma Haibin, Chang Jingpeng. Regulation of chondrocyte autophagy by acupotomy to promote chondrocyte homeostasis in osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(34): 5452-5457.

图/表（结果） 4

参考文献

[1] DE ROOVER A, ESCRIBANO-NUNEZ A, MONTEAGUDO S, et al. Fundamentals of osteoarthritis: Inflammatory mediators in osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2023;31(10):1303-1311.
[2] JAIN L, BOLAM S M, MONK AP, et al. Differential Effects of Hypoxia versus Hyperoxia or Physoxia on Phenotype and Energy Metabolism in Human Chondrocytes from Osteoarthritic Compared to Macroscopically Normal Cartilage. Int J Mol Sci. 2023;24(8):7532.
[3] Fujii Y, Liu L, Yagasaki L, et al. Cartilage Homeostasis and Osteoarthritis. Int J Mol Sci. 2022;23(11):6316.
[4] WANG J, ZHANG Y, CAO J, et al. The role of autophagy in bone metabolism and clinical significance. Autophagy. 2023;19(9):2409-2427.
[5] LUO P, GAO F, NIU D, et al. The Role of Autophagy in Chondrocyte Metabolism and Osteoarthritis: A Comprehensive Research Review. Biomed Res Int. 2019;2019:5171602.
[6] SUN K, LUO J, GUO J, et al. The PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in osteoarthritis: a narrative review. Osteoarthritis Cartilage. 2020; 28(4):400-409.
[7] 郭长青,司同,温建民,等.针刀松解法改善膝骨关节炎疼痛症状的随机对照临床研究[J].天津中医药,2012,29(1):35-38.
[8] 王翔,刘顺怡,石瑛,等.针刀松解术治疗膝骨关节炎的临床观察[J].中国骨伤,2016,29(4):345-349.
[9] 张雷,危慕彬,刘爱峰.小针刀与针刺治疗膝骨性关节炎临床疗效Meta分析[J].天津中医药,2019,36(3):253-257.
[10] 刘福水,金德忠,吴翔.针刀与针灸治疗膝骨关节炎疗效比较的Meta分析[J].中国组织工程研究,2012,16(44):8235-8239.
[11] VIDEMAN T. Experimental osteoarthritis in the rabbit: comparison of different periods of repeated immobilization. Acta Orthop Scand. 1982;53(3):339-347.
[12] SHI X, YU W, WANG T, et al. Electroacupuncture alleviates cartilage degradation: Improvement in cartilage biomechanics via pain relief and potentiation of muscle function in a rabbit model of knee osteoarthritis. Biomed Pharmacother. 2020;123:109724.
[13] 张良志,刘洪,修忠标.基于经筋理论针刀治疗膝骨性关节炎疗效的Meta分析[J].中国民族民间医药,2020,29(8):54-57.
[14] DU X, LIU ZY, TAO XX, et al. Research Progress on the Pathogenesis of Knee Osteoarthritis. Orthop Surg. 2023;15(9):2213-2224.
[15] GENG R, LI J, YU C, et al. Knee osteoarthritis: Current status and research progress in treatment (Review). Exp Ther Med. 2023;26(4): 481.
[16] LV X, ZHAO T, DAI Y, et al. New insights into the interplay between autophagy and cartilage degeneration in osteoarthritis. Front Cell Dev Biol. 2022;10:1089668.
[17] TIAN Z, ZHANG X, SUN M. Phytochemicals Mediate Autophagy Against Osteoarthritis by Maintaining Cartilage Homeostasis. Front Pharmacol. 2021;12:795058.
[18] SASAKI H, TAKAYAMA K, MATSUSHITA T, et al. Autophagy modulates osteoarthritis-related gene expression in human chondrocytes. Arthritis Rheum. 2012;64(6):1920-1928.
[19] BOUDERLIQUE T, VUPPALAPATI KK, NEWTON PT, et al. Targeted deletion of Atg5 in chondrocytes promotes age-related osteoarthritis. Ann Rheum Dis. 2016;75(3):627-631.
[20] ZHANG Y, VASHEGHANI F, LI YH, et al. Cartilage-specific deletion of mTOR upregulates autophagy and protects mice from osteoarthritis. Ann Rheum Dis. 2015;74(7):1432-1440.
[21] MITRA A, RAYCHAUDHURI SK, RAYCHAUDHURI SP. IL-22 induced cell proliferation is regulated by PI3K/Akt/mTOR signaling cascade. Cytokine. 2012;60(1):38-42.
[22] CARAMES B, TANIGUCHI N, OTSUKI S, et al. Autophagy is a protective mechanism in normal cartilage, and its aging-related loss is linked with cell death and osteoarthritis. Arthritis Rheum. 2010;62(3):791-801.
[23] WANG S, DENG Z, MA Y, et al. The Role of Autophagy and Mitophagy in Bone Metabolic Disorders. Int J Biol Sci. 2020;16(14):2675-2691.
[24] MIJANOVIC O, PETUSHKOVA AI, BRANKOVIC A, et al. Cathepsin D-Managing the Delicate Balance. Pharmaceutics. 2021;13(6):837.
[25] PENA-MARTINEZ C, RICKMAN A D, HECKMANN BL. Beyond autophagy: LC3-associated phagocytosis and endocytosis. Sci Adv. 2022;8(43): n1702.
[26] 佘泽宇,夏帅,卢曼,等.针刀对膝关节骨关节炎兔软骨PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬的影响[J].针刺研究,2023,48(9): 898-905.
[27] 卢曼,黄小双,孟德鸿,等.针刀对膝关节骨关节炎大鼠mTOR/Atg/ULK1/Beclin-1轴及软骨细胞自噬的影响[J].中国针灸,2022,42(1): 59-65.
[28] 刘晶,曾维铨,林巧璇,等.基于自噬及凋亡调控探讨针刀对膝关节骨关节炎兔软骨的保护作用[J]. 针刺研究,2022,47(12):1080-1087.
[29] BRONSTONE A, NEARY JT, LAMBERT TH, et al. Supartz (Sodium Hyaluronate) for the Treatment of Knee Osteoarthritis: A Review of Efficacy and Safety. Clin Med Insights Arthritis Musculoskelet Disord. 2019;12:71465557.
[30] RUTJES AW, JÜNI P, DA COSTA BR, et al. Viscosupplementation for osteoarthritis of the knee: a systematic review and metaanalysis. Ann Intern Med. 2012;157(3):180-191.
[31] TSCHOPP M, PFIRRMANN C, FUCENTESE SF, et al. A Randomized Trial of Intra-articular Injection Therapy for Knee Osteoarthritis. Invest Radiol. 2023;58(5):355-362.

引言

骨关节炎是一种在老年人中最常见的慢性退行性疾病，常伴随软骨退化、滑膜炎症和软骨下骨重建等病理改变[1]。随着人口老龄化的发展，膝骨关节炎发病率逐年升高，严重影响患者的生活质量，已成为世界各国广泛关注的公众健康问题。骨关节炎的病理学因素是多方面的，其中关节软骨退化是关节炎的重要发病机制。软骨细胞是软骨组织的唯一细胞类型，在维持和重塑软骨结构、保证软骨细胞外基质功能等方面起着至关重要的作用。生理情况下，关节软骨细胞通过分泌软骨细胞外基质及蛋白酶类降解多余或变性的软骨细胞外基质蛋白，维持软骨细胞外基质代谢间的动态平衡，并且在多种生长因子、细胞因子和机械刺激调控下参与关节软骨稳态维持[2]。软骨退化或过度使用引起的软骨细胞分解代谢和异常分化会导致软骨外基质丢失，引起关节软骨稳态失衡，最终导致骨关节炎的发生[3]。
细胞自噬是一种存在于真核细胞中高度保守的降解过程，对于细胞的生存、分化、发育和内稳态至关重要[4]。软骨为分裂后的组织，细胞去除受损和功能失调的细胞器以及大分子就依赖于自噬，是软骨组织细胞更新的主要机制。研究证明自噬与软骨生物学密切相关，对于维持关节软骨内环境稳定具有持续活性和明显保护作用，可以明显延缓骨关节炎的病理进程[5]。PI3K/Akt/mTOR是调节自噬的经典信号传导通路，该通路的活化可诱导细胞生长、增殖、迁移，调控细胞自噬，参与软骨形成和修复[6]。
针刀是治疗骨关节炎的有效方法，其临床疗效肯定，还具有不良反应小、操作方便的特色与优势，已经在临床上得到广泛应用。临床研究表明，针刀可以显著降低WOMAC骨性关节炎指数，减轻患者的疼痛症状，证实针刀能有效减轻骨关节炎的炎症反应，改善患者临床症状，延缓关节软骨退变[7-8]。临床循证医学系统评价也进一步证实了针刀确实能够有效缓解膝骨关节炎患者的症状，延缓膝关节软骨退变的结论[9-10]。但针刀改善骨关节炎关节软骨退变的具体机制尚未明确。因此，此次实验旨在观察针刀干预对兔膝骨关节炎模型软骨细胞稳态的影响，并探讨PI3K/Akt/mTOR通路在其中的作用机制，为针刀治疗膝骨关节炎的临床应用提供实验依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，组间比较采用单因素方差分析，多重比较使用LSD检验。
1.2 时间及地点实验于2021年3-11月在江西中洪博元生物技术有限公司完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物与分组健康雄性新西兰兔28只，普通级，6月龄，体质量2.0-3.0 kg，购于赣州市畜牧研究所，动物生产许可证：SCKX(赣)2018-0009。采用随机数字表法分为对照组、骨关节炎组、针刀组和透明质酸组，每组7只。将28只兔在相同的饲养和环境条件下饲养，12 h/12 h光照/黑暗，室温20-26 ℃，湿度40%-70%，单笼饲养，标准饲料，自由进食和饮水。实验方案已通过宁夏回族自治区人民医院伦理委员会批准(批准号：2020-YC-005)。
1.3.2 主要器具、仪器与试剂针刀(汉章牌0.60 mm×40 mm，保定华有医疗器械有限公司)；倒置荧光显微镜(MF53，广州市明美光电有限公司)；低温高速离心机(5424R，Eppendorf)；荧光显微镜(CKX53，OLYMPUS)；蛋白垂直电泳仪(DYY-6C，北京市六一仪器厂)；恒温摇床(TC-100B，上海领成生物科技有限公司)；超高灵敏度化学发光成像系统[Chemi DocTM XRS+，伯乐生命医学产品(上海)有限公司]；全自动化学发光图像分析系统(Tanon-5200，上海天能科技有限公司)。
透明质酸钠溶液(相对分子质量1.2×106，阿尔治)；BCA蛋白定量试剂盒(BCA Protein Assay Kit)；Marker (#26617，Thermo)；PVDF膜(IPVH00010，Millipore)；超敏发光液(RJ239676，赛默飞)；Beclin1抗体(11306-1-ap，proteintech，1/1 000)；Cath D 抗体(bs-23781R，Bioss，1/1 000)；p-mTOR抗体(bs-3495R，Bioss，1/1 000)；p-Akt抗体 (66444-1-Ig，proteintech，1/1 000)；LC3抗体 (ab192890，abcam，1/1 000)；Akt抗体(ab38449，abcam，1/1 000)；mTOR抗体 (ab32028，abcam，1/1 000)；内参二抗：辣根酶标记山羊抗鼠IgG(H+L)(ZB-2305，中杉金桥，1/2 000)；山羊抗兔 IgG /488 (ZF-0511，中山金桥，1/2 000)；山羊抗兔 IgG cy3(AS007，ABdonal，1/2 000)；即用型DAPI染液(KGA215-50，凯基)；Tunel检测试剂盒(C1090，碧云天)。
1.4 方法

1.4.1 骨关节炎造模除对照组外，其余3组新西兰兔均进行膝骨关节炎造模。参考VIDEMAN[11]的方法，操作步骤如下：首先将新西兰兔固定于固定器上，耳缘静脉注射戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉，麻醉后将左后肢局部备皮，保持左后肢过伸位并用石膏绷带固定，并用纱布缠绕，待石膏干硬后回笼，固定6周。造模期间密切观察兔左后肢情况，若出现肢体肿胀、皮肤溃烂、石膏脱落等情况需重新造模。造模6周后，采用Lequesne MG评分法对兔膝关节疼痛、肿胀、活动度、步态等进行评价[12]，评分≥6分提示造模成功。

1.4.2 分组干预方法对照组和骨关节炎组兔常规饲养，不进行任何干预。
针刀组：造模成功后第2天开始干预，用龙胆紫标记左后肢膝关节髌韧带、内侧副韧带和外侧副韧带作为针刀进针点，常规备皮和消毒后针刀柄垂直刺入皮肤，刀口线与韧带方向平行，刀口抵达骨面后稍上提，旋转90°，快速切割3-5刀，15 min/次，1次/周，连续治疗5周。上述针刀操作均由5年以上临床经验且完整接受过针刀医学系统培训的医生完成。
透明质酸组：造模成功后第2天开始干预，用龙胆紫标记左后肢膝关节髌韧带和外侧副韧带的中点作为穿刺点，穿刺成功后膝关节腔注射0.1 mL透明质酸钠溶液(10 g/L)，1次/周，连续治疗5周。上述操作均由同一名临床经验丰富的医师完成。
1.4.3 实验取材治疗结束后第2天进行DR片拍摄，拍摄后进行取材，标本采集前12 h兔禁食不禁水。使用戊巴比妥钠将兔深度麻醉后处死，用手术刀片打开兔左后肢膝关节，暴露胫骨平台和股骨下髁的软骨，在股骨内、外髁取新鲜的软骨组织(1 mm×1 mm×3 mm)浸泡在固定液中，组织样本经冲洗、渗透酸固定、脱水和包埋，用切片机分别切成60 nm切片(用于透射电镜观察)和5 μm切片(用于Tunel染色检测)。
1.5 主要观察指标
1.5.1 DR片观察膝关节宏观结构变化用戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉后侧卧位固定于硬纸板上，用胶带缠绕固定膝关节使其呈伸直位，进行DR片拍摄。
1.5.2 透射电镜观察兔膝关节软骨细胞超微结构形态切片用柠檬酸铅和醋酸铀染色，在JEM1230型透射电镜下随机选取 3-5个视野，检查每个切片中软骨细胞形态并拍照。
1.5.3 Tunel染色检测软骨细胞凋亡切片用0.01 mol/L PBS清洗3次，于50 μL Tunel测试溶液中37 ℃下孵育 60 min。用 PBS冲洗3次，用 DAPI标记细胞核。组织切片经淬灭和封固后在荧光显微镜下观察。每个切片拍摄3个荧光染色区域。
1.5.4 Western blot法检测PI3K/Akt/mTOR通路及自噬相关蛋白表达将软骨组织在液氮中切割并匀浆，用 1 mL RIPA 细胞裂解缓冲液裂解，4 ℃下2 000 r/min离心40 min，收集上清液，按照试剂盒的说明使用 BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度。蛋白质样品经 SDS-PAGE 凝胶电泳上载和分离，将第一抗体(Beclin1抗体、Cath D 抗体、p-mTOR抗体、p-Akt抗体、LC3抗体、Akt抗体和mTOR抗体)与PVDF膜用5%脱脂奶溶液阻断60 min过夜，室温下缓慢振荡 1 h。第2天，用 TBS-T 洗膜，然后第二抗体辣根酶标记山羊抗鼠IgG(H+L)、山羊抗兔 IgG /488和山羊抗兔 IgG cy3，在 37 ℃下孵育 60 min。最后，用ECL显影膜上的条带，通过Image-Pro Plus 6.0软件分析灰度值。
1.6 统计学分析当计量资料符合正态分布时，采用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验；当计量资料不符合正态分布，数据比较采用非参数检验。以α=0.05为检验水平，P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经宁夏医科大学生物统计学专家审核。

讨论

膝骨关节炎是以膝关节软骨损伤为主要表现的慢性退行性疾病，常伴有骨赘形成、软骨下骨增厚、滑膜炎症和半月板损伤等。针刀通过“舒筋解结”可起到干预膝骨关节炎软骨损伤的作用。临床研究表明，针刀能降低骨内压，延缓关节软骨退变，改善微循环，消除炎症反应，从而缓解膝关节的退变及其相关症状，达到有效治疗作用[13]。
骨关节炎主要表现为软骨退化、滑膜炎症和软骨下骨重建。软骨细胞在病理状态下表现为异常肥大、自噬降低、衰老和凋亡[14-15]，同时伴随软骨细胞中促进细胞外基质降解相关酶类表达增加，细胞外基质分解代谢增强、合成代谢受到抑制，细胞外基质整体结构遭破坏，动态平衡被打破，导致软骨细胞形态和细胞外的破坏、关节软骨不可逆性的损伤和破坏，最终导致骨关节炎的发生[3]。因此，维持软骨细胞正常的形态和功能对骨关节炎关节软骨的稳态维持具有非常重要的意义，阻断软骨基质降解和防止软骨细胞异常肥大分化、恢复软骨细胞正常形态和功能是防治骨关节炎的重要策略。
自噬对于细胞的生存、分化、发育和内稳态至关重要。软骨为分裂后的组织，细胞去除受损和功能失调的细胞器以及大分子就依赖于自噬，是软骨组织细胞更新的主要机制[16]。研究证明自噬与软骨生物学密切相关，尤其是对关节软骨内环境发挥着较为明显的作用[17]，例如：在维持内环境稳定中起到了保护作用，可以明显延缓骨关节炎的病理进程。自噬增加Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达，同时降低白细胞介素1β处理的软骨细胞中软骨降解酶基质金属蛋白酶13和血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5的水平[18]。自噬机制的分子元件Atg基因中，Atg1、Atg6、Atg8以及Atg5是主要的4个基因，其中，软骨细胞中Atg5的缺失促进了小鼠与年龄相关的骨关节炎[19]。mTOR可通过增强自噬活性保护小鼠免于骨关节炎[20]。此外，雷帕霉素关节内注射抑制mTOR的药理作用可以激活自噬，有效缓解骨关节炎的病理表型，通过激活自噬可以减轻软骨损伤。因此，细胞自噬水平在维持关节软骨稳态中发挥重要作用，是骨关节炎发展和转归的关键因素。
有研究报道，PI3K/Akt/mTOR信号传导通路激活可以影响下游多种效应分子的活化状态，从而抑制细胞自噬[21]。CARAMES等[22]研究提示骨关节炎中的自噬过程出现异常调节，骨关节炎的发生、发展与软骨细胞Beclin1、Cath D、LC3及ULK1的表达减少及细胞凋亡的增加息息相关。抑制自噬水平则会增加白细胞介素1β诱导的骨关节炎相关基因表达水平，相反，诱导自噬则会降低其表达水平。Beclin1是一种参与自噬体形成与成熟的调控蛋白质，目前也已作为骨关节炎重要的治疗靶点[23]。Cath D参与维持细胞的新陈代谢、细胞凋亡和自噬等多种生理过程，在维持细胞生存、介导细胞分化等方面发挥重要的作用[24]。LC3蛋白是自噬体膜上的标志性蛋白，启动自噬时，胞浆内可溶的LC3Ⅰ与自噬体膜表面的磷脂酰乙醇胺结合，形成LC3Ⅰ减少，形成LC3Ⅱ增加[25]，因此LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值大小某种程度上反映了细胞自噬活性，其表达与自噬活性呈正相关。亦有研究显示自噬对软骨细胞有保护作用，提高自噬水平会减少骨关节炎相关蛋白的表达，mTOR及下游的ULK1/AMPK通路可能参与其调控，通过抑制mTOR将会减轻小鼠软骨细胞损伤[20]。因此，PI3K/Akt/mTOR信号通路调控软骨细胞自噬在维持关节软骨稳态中发挥着重要作用，是临床上治疗骨关节炎的关键机制所在。
针刀治疗膝骨关节炎具有途径多、靶点多、作用面广的特点，目前已有研究表明针刀通过提高软骨细胞自噬改善骨关节炎。佘泽宇等[26]研究表明，针刀可能通过调节PINK1/Parkin信号通路促进线粒体自噬，改善膝骨关节炎兔软骨损伤。卢曼等[27]研究发现，针刀干预能改善膝骨关节炎模型大鼠膝关节软骨损伤，其机制可能与调控mTOR/Atg/ULK1/Beclin-1轴促进软骨细胞自噬、延缓软骨细胞的衰老退变有关。此外，刘晶等[28]也发现，针刀治疗能通过调控Beclin1、Bcl-2、Caspase-3等蛋白表达而上调膝骨关节炎兔膝关节软骨细胞自噬水平，减少软骨细胞凋亡，进而发挥保护软骨和改善关节疼痛及功能障碍的作用。但是，目前尚未有研究报道针刀通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控软骨细胞自噬在维持关节软骨稳态中的作用。此次实验DR片显示，骨关节炎组膝关节间隙变窄，周围骨赘形成；透明质酸组和针刀组膝关节间隙增宽，周围骨赘减少，证实针刀和透明质酸可改善骨关节炎临床症状。透射电镜显示，骨关节炎组软骨细胞内自噬体数量减少，细胞核皱缩、核膜破裂，细胞器形态不完整，细胞呈现明显死亡趋向；而透明质酸组与针刀组自噬体均明显增加，细胞核核膜完整，细胞生存状态良好，证实透明质酸和针刀能提高自噬水平，改善细胞生存状态。Tunel染色结果显示骨关节炎组有较多凋亡软骨细胞；而透明质酸组和针刀组凋亡软骨细胞较少，证实透明质酸和针刀可有效抑制软骨细胞过度凋亡。Western Blot检测结果显示，透明质酸组和针刀组Beclin1、Cath D和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达水平较骨关节炎组显著增高，p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达较骨关节炎组显著降低，表明透明质酸和针刀均可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路传导上调自噬相关蛋白表达，提高软骨细胞自噬水平。
临床上常在膝骨关节炎关节腔内注入透明质酸，能起到润滑关节、减少摩擦、缓解疼痛的作用[29]，但近年来也有研究表明，外源性透明质酸主要起润滑及屏障作用，对膝骨关节炎患者抗炎及止痛作用差，并且疗效不够持久，难以达到治疗目的[30-31]。此外临床实践中发现，部分患者在注射透明质酸后出现关节疼痛、肿胀等不良反应，极少数患者甚至不能坚持治疗，给膝骨关节炎的治疗带来困难。针刀作为祖国传统医学中特色的治疗手段在治疗膝骨关节炎时不良反应小，普遍适用于各类膝骨关节炎人群，是临床上治疗膝骨关节炎的重要手段。
综上所述，针刀干预可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的传导上调自噬相关蛋白表达，提高软骨细胞自噬水平，抑制软骨细胞过度凋亡，进而维持软骨细胞稳态、延缓软骨退变，改善骨关节炎临床症状。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

针刀调控软骨细胞自噬维持骨关节炎软骨细胞的稳态

Regulation of chondrocyte autophagy by acupotomy to promote chondrocyte homeostasis in osteoarthritis

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[1]	李永杰, 付申宇, 夏渊, 张达宽, 刘洪举. 膝骨关节炎女性伸膝肌力、步态时空参数与峰值膝关节屈曲/内收力矩关系[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1354-1358.
[2]	齐浩东, 鲁超, 徐韩博, 王孟飞, 郝阳泉. 糖尿病对初次全膝关节置换围术期失血量和疼痛的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1383-1387.
[3]	盛思琪, 谢琳, 赵翔宇, 姜怡邓, 吴凯, 熊建团, 杨安宁, 郝银菊, 焦运. miR-144-3p参与高蛋氨酸饮食诱导Cbs+/-小鼠的肝细胞自噬[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1289-1294.
[4]	黄夏荣, 胡莉芝, 孙光华, 彭昕珂, 廖瑛, 廖源, 刘静, 尹林伟, 钟培瑞, 彭婷, 周君, 屈萌艰. 电针干预老年膝骨关节炎大鼠关节软骨及软骨下骨P53、P21的表达[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1174-1179.
[5]	赵嘎日达, 任逸众, 韩长旭, 孔令跃, 贾岩波. 蒙药额尔敦-乌日勒修复骨关节炎大鼠模型的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1193-1199.
[6]	王继, 张敏, 李文博, 杨中亚, 张龙. 有氧运动对2型糖尿病大鼠糖脂代谢、骨骼肌炎症和自噬的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1200-1205.
[7]	周邦瑜, 李杰, 阮玉山, 耿福能, 李绍波. 美洲大蠊研粉干预脊髓半横断大鼠运动功能和自噬蛋白Beclin-1的表达[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1223-1228.
[8]	李蕊, 张桂红, 王涛, 樊萍. 人参多糖干预创伤性骨关节炎模型大鼠前列腺素E2/6-酮-前列腺素F1α的表达[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1235-1240.
[9]	潘小龙, 樊飞燕, 应春苗, 刘飞祥, 张运克. 中药抑制间充质干细胞衰老的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1091-1098.
[10]	黄雨馨, 梁文姿, 陈秀文, 倪娜, 赵颖琳, 林常敏. 自噬在毛发再生中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1112-1117.
[11]	刘麒薇, 张俊辉, 杨袁, 王金娟. 脐带间充质干细胞治疗多囊卵巢综合征的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1015-1020.
[12]	张克凡, 石辉. 细胞因子治疗骨关节炎的研究现状及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(6): 961-967.
[13]	李佳琪, 黄元礼, 李妍, 王春仁, 韩倩倩. 非交联透明质酸分子质量降解的机制及影响因素[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(5): 747-752.
[14]	乔虎军, 王国祥. 白细胞介素1β诱导大鼠骨性关节炎软骨细胞模型的效果评价[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 516-521.
[15]	刘宇涵, 樊渝江, 王启光. 早期创伤性膝骨关节炎动物模型构建方案的比较[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 542-549.