斯赤列提取物抑制骨关节炎模型大鼠的异常血管新生

doi:10.12307/2024.808

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (34): 5458-5466.doi: 10.12307/2024.808

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斯赤列提取物抑制骨关节炎模型大鼠的异常血管新生

江自鲜1，陆玉春1，李朝梦1，郑梅梅2，李秀芳1，王文静1

1云南中医药大学，云南省昆明市 650500；2南京宁丹新药技术有限公司，江苏省南京市 210000

收稿日期:2023-11-20 接受日期:2023-12-27 出版日期:2024-12-08 发布日期:2024-03-14
通讯作者: 王文静，博士，教授，博士生导师，云南中医药大学，云南省昆明市 650500 李秀芳，博士，教授，博士生导师，云南中医药大学，云南省昆明市 650500
作者简介:江自鲜，女，云南省保山市人，云南中医药大学在读硕士，主要从事天然产物提取分离及应用研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(82160744)，项目负责人：王文静；云南省宋少江专家工作站(202305AF150030)，项目负责人：王文静

Extracts of Sambucus adnata Wall. inhibit abnormal angiogenesis in a rat model of osteoarthritis

Jiang Zixian1, Lu Yuchun1, Li Chaomeng1, Zheng Meimei2, Li Xiufang1, Wang Wenjing1

1Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, Yunnan Province, China; 2NeuroDawn Pharmaceutical, Nanjing 210000, Jiangsu Province, China

Received:2023-11-20 Accepted:2023-12-27 Online:2024-12-08 Published:2024-03-14
Contact: Corresponding author: Wang Wenjing, MD, Professor, Doctoral supervisor, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, Yunnan Province, China Li Xiufang, MD, Professor, Doctoral supervisor, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, Yunnan Province, China
About author:Jiang Zixian, Master candidate, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, Yunnan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 82160744 (to WWJ); Song Shaojiang Expert Workstation in Yunnan Province, No. 202305AF150030 (to WWJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

斯赤列：是忍冬科接骨木属植物血满草 (Sambucus adnata Wall.)，云南彝、藏、佤、哈尼等少数民族多将该药用于治疗风湿疼痛、风湿性关节炎、骨折等疾病，药用历史悠久。
血管新生：也称血管生成，即从现有血管形成新血管。在许多病理状况下，例如癌症、关节炎等疾病，都会出现血管生成过程。血管生成是关节炎的早期关键特征，由炎症细胞因子开启并由关节缺氧诱导。由于新血管的形成可以促进更多炎症浸润，并为滑膜细胞提供氧气和营养，因此它可以加剧疾病进展。

背景：课题组前期研究表明，斯赤列提取物具有促进成骨细胞增殖分化，促进骨折愈合、抗炎、抗氧化等作用，可有效缓解骨关节炎的发展。血管内皮生长因子则为骨关节炎严重程度评价的生物标记物。

目的：探讨斯赤列两种提取物 (甲醇提取物SAW-ME、二氯甲烷提取物SAW-DCE)对抗骨关节炎血管新生的作用及机制。
方法：①采用前交叉韧带切断法复制大鼠骨关节炎模型(模型组)，分别给予SAW-ME、SAW-DCE干预，并设假手术组为对照。运用免疫组化、免疫荧光等方法检测大鼠关节中血管内皮生长因子A、血清中血管内皮生长因子和软骨下骨H型血管的变化。②以血管内皮细胞EA.hy926为研究对象，给予SAW-ME、SAW-DCE干预，MTT法检测对细胞增殖的影响；采用血管内皮生长因子诱导EA.hy926细胞，复制血管新生模型，进行划痕实验、成管实验研究其作用和机制。③采用EA.hy926细胞进行转录组测序，分析给予SAW-DCE干预后细胞差异基因及相关功能的特征变化。

结果与结论：①SAW-ME、SAW-DCE可下调骨关节炎大鼠膝关节软骨中血管内皮生长因子A的表达，减少关节中H型血管的生成；SAW-ME可显著降低骨关节炎大鼠血清中血管内皮生长因子水平(P < 0.05)；SAW-DCE可降低骨关节炎大鼠血清中血管内皮生长因子水平，但差异无显著性意义。②SAW-ME、SAW-DCE均可显著抑制血管内皮细胞迁移和成管，下调Ang1和Tie2蛋白的表达。③转录组测序分析发现骨关节炎血管异常新生与PI3K/AKT信号通路有关。④结果表明SAW-ME、SAW-DCE能够抑制骨关节炎模型大鼠异常血管新生，其作用机制可能与调控Ang1/Tie2、PI3K/AKT信号通路有关。

https://orcid.org/0009-0001-1297-8044(江自鲜)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 斯赤列, 甲醇提取物, 二氯甲烷提取物, 血管新生, 骨关节炎, 血管内皮生长因子, PI3K/AKT, 转录组学

Abstract: BACKGROUND: Previous studies showed that extracts of Sambucus adnata Wall. have the ability to promote the proliferation and differentiation of osteoblasts, fracture healing, anti-inflammatory and antioxidant effects, which can effectively alleviate the development of osteoarthritis. Vascular endothelial growth factor, on the other hand, is a biomarker for the evaluation of osteoarthritis severity.
OBJECTIVE: To investigate the effect and mechanism of two extracts of Sambucus adnata Wall. (methanol extract SAW-ME and dichloromethane extract SAW-DCE) on angiogenesis in osteoarthritis.
METHODS: (1) Rat models of osteoarthritis were established using anterior cruciate ligament transection and given SAW-ME and SAW-DCE. A sham group was set as a control. Immunohistochemistry and immunofluorescence were used to detect the changes of articular vascular endothelial growth factor A in joint tissue and vascular endothelial growth factor and “H” type blood vessels in serum of osteoarthritis rats. (2) Vascular endothelial cells EA.hy926 were used as the research object and intervened with SAW-ME and SAW-DCE. Cell proliferation was then detected by MTT assay. Vascular endothelial growth factor was used to induce EA.hy926 cells, and the model of angiogenesis was replicated. Cell scratch assay and tube formation assay were performed to study the role and mechanism. (3) EA.hy926 cells were used for transcriptome sequencing to analyze the characteristic changes of cell differential genes and related functions after SAW-DCE intervention.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) SAW-ME and SAW-DCE downregulated the expression of vascular endothelial growth factor A in the rat knee cartilage and reduced the formation of “H” type vessels in osteoarthritis rats. SAW-ME could significantly decrease the level of vascular endothelial growth factor in serum of osteoarthritis rats (P < 0.05). SAW-DCE could also decrease the level of vascular endothelial growth factor in serum of osteoarthritis rats, but there was no significant change. (2) Both SAW-ME and SAW-DCE significantly inhibited vascular endothelial cell migration and tube formation, and downregulated the expression of Ang1 and Tie2 proteins. (3) Transcriptome sequencing analysis found that abnormal angiogenesis in osteoarthritis was related to the PI3K/AKT signaling pathway. (4) To conclude, SAW-ME and SAW-DCE can inhibit angiogenesis in the rat model of osteoarthritis, and the mechanism may be related to the Ang1/Tie2 and PI3K/AKT signaling pathways.

Key words: Sambucus adnata Wall., methanol extract, dichloromethane extract, angiogenesis, osteoarthritis, vascular endothelial growth factor, PI3K/AKT, transcriptomics

中图分类号:

江自鲜, 陆玉春, 李朝梦, 郑梅梅, 李秀芳, 王文静. 斯赤列提取物抑制骨关节炎模型大鼠的异常血管新生[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(34): 5458-5466.

Jiang Zixian, Lu Yuchun, Li Chaomeng, Zheng Meimei, Li Xiufang, Wang Wenjing. Extracts of Sambucus adnata Wall. inhibit abnormal angiogenesis in a rat model of osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(34): 5458-5466.

图/表（结果） 12

2.1 SAW-ME、SAW-DCE对骨关节炎大鼠膝关节软骨中VEGFA表达的影响与假手术组相比较，模型组关节软骨处有大量棕色阳性区域，VEGFA阳性细胞数量较多 (P < 0.01至P < 0.001)，密度较高，染色较深；经SAW-ME或SAW-DCE干预后，VEGFA阳性细胞数量明显减少 (P < 0.05)，见图1，2。

2.2 SAW-ME、SAW-DCE对骨关节炎大鼠软骨下骨中H型血管形成的影响 CD31与Emcn为H型血管标志物，所以实验以CD31/Emcn 免疫荧光双染色考察H型血管的形成情况。与假手术组相比较，模型组大鼠关节软骨中CD31和Emcn双阳性共定位阳性率显著增多 (呈黄色) (P < 0.001或P < 0.01)，表明H型血管数量明显增加；分别给予SAW-ME或SAW-DCE干预后，骨关节炎大鼠软骨下骨内的阳性细胞率显著下降 (P < 0.01或P < 0.05) ，见图3。结果提示SAW-ME、SAW-DCE可以显著减少H型血管的新生。

2.3 SAW-ME、SAW-DCE对骨关节炎大鼠血清中VEGF水平的影响与假手术组相比较，模型组大鼠血清中VEGF水平呈上升趋势；与模型组相比，给予SAW-ME干预后，大鼠血清中VEGF水平明显降低 (P < 0.05)，见图4A；给予SAW-DCE干预后，大鼠血清中VEGF水平呈降低的趋势，但无统计学意义，见图4B。提示SAW-ME、SAW-DCE可降低骨关节炎大鼠血清中VEGF的水平。

2.4 SAW-ME、SAW-DCE对EA.hy926细胞增殖作用的影响结果给予不同质量浓度SAW-ME、SAW-DCE干预EA.hy926细胞后，6.25-100 μg/mL 的SAW-ME及1.25-10 μg/mL的SAW-DCE对EA.hy926细胞的存活率无明显影响，详见图5A，B。后续研究采用SAW-ME的质量浓度为50，25，12.5 μg/mL，SAW-DCE的质量浓度为5，2.5，1.25 μg/mL。

2.5 SAW-ME、SAW-DCE对EA.hy926细胞成管作用的影响
2.5.1 细胞成管网眼数和分支数分析与对照组相比，VEGF组网眼数 (P < 0.05)、分支数 (P < 0.001)明显增加；与VEGF组相比，给予SAW-ME 50 μg/mL组网眼数 (P < 0.001)、分支数 (P < 0.001)均明显减少；给予SAW-ME 25 μg/mL和12.5 μg/mL时，分支数明显减少 (P < 0.001)，网眼数具有减少的趋势，但差异无统计学意义；与VEGF组相比，给予SAW-DCE 5 μg/mL组网眼数 (P < 0.01)、分支数 (P < 0.05)明显减少；给予SAW-DCE质量浓度为2.5 μg/mL和1.25 μg/mL时，分支数均明显减少 (P < 0.05)，网眼数减少，但差异无统计学意义，见图6A-C。 2.5.2 细胞成管节点数和成管主段长度分析与对照组相比，VEGF组节点数明显增加(P < 0.001)，主段长度增加，给予SAW-ME质量浓度为50，25和12.5 μg/mL时，节点数明显减少 (P < 0.001或P < 0.05)，主段长度减少，但各组的差异均无统计学意义；给予SAW-DCE质量浓度为5 μg/mL时，节点数明显减少 (P < 0.001)，段长度明显减少 (P < 0.05)，给予SAW-DCE质量浓度为2.5 μg/mL和1.25 μg/mL时，节点数减少，主段长度减少，差异无统计学意义，见图6A，D，E。

2.6 SAW-ME、SAW-DCE对EA.hy926细胞划痕实验的影响与对照组相比，VEGF组的迁移率明显增加 (P < 0.001)；与VEGF组相比，SAW-ME的质量浓度为50 μg/mL时，迁移率明显减小 (P < 0.05)；在SAW-DCE组中，3个浓度下的迁移率都明显减小 (P < 0.001或P < 0.05)，见图7。提示斯赤列两种提取物均可以抑制血管内皮细胞的迁移。

2.7 SAW-ME、SAW-DCE对EA.hy926细胞内Ang1和Tie2蛋白表达的影响
2.7.1 Ang1的蛋白表达与对照组比较，VEGF组中Ang1的蛋白表达水平明显升高 (P < 0.05)；与VEGF组相比，给予SAW-ME的质量浓度为50，12.5 μg/mL时，Ang1蛋白表达水平明显降低 (P < 0.001或P < 0.05)；与VEGF组相比，给予SAW-DCE的质量浓度为5，2.5，1.25 μg/mL时，Ang1蛋白表达水平均显著降低 (P < 0.001) ，见图8A，B。提示斯赤列这两种提取物均可以抑制Ang1的蛋白表达水平。 2.7.2 Tie2的蛋白表达与对照组比较，VEGF组中Tie2的蛋白表达水平有升高的趋势，但无统计学意义。与VEGF组相比，给予SAW-ME质量浓度为50，25，12.5 μg/mL时，Tie2蛋白表达水平明显降低 (P < 0.001或P < 0.01)；与VEGF组相比，给予SAW-DCE质量浓度为5，1.25 μg/mL时，Tie2蛋白表达水平均显著降低 (P < 0.001或P < 0.05)，见图8C，D。在蛋白水平上说明了斯赤列这两种提取物可以抑制Tie2的表达水平。

2.8 差异表达基因统计及基因本体、KEGG富集分析
2.8.1 差异基因表达分析与对照组比较，VEGF组的差异基因有892个，其中上调基因有510个，下调基因有382个；与VEGF组比较，SAW-DCE组有606个差异基因，其中上调基因有308个，下调基因有298个 (见图9A，B)；然后，将两个DEG数据集合并 (见图9C)，并进一步进行聚类分析 (见图9D)；再进一步运用火山图的形式对差异表达基因进行可视化分析 (见图9E)。

2.8.2 对差异表达基因进行GO富集分析对照组和VEGF组相比较，富集到的基因主要涉及到复制叉蛋白复合体、驱动蛋白复合体、细胞有丝分裂G1/S周期转变等细胞周期相关的变化；VEGF组与SAW-DCE组相比较，富集到的基因主要涉及到有Ⅰ型干扰素信号通路、受体配体活性、信号受体激活活性、ERBB信号通路等，见图10。

2.8.3 对差异表达基因进行KEGG富集分析对照组和VEGF组比较的差异基因，富集到了细胞周期、黏着斑、DNA复制、ECM-receptor相互作用、Fanconi anemia通路、PI3K-Akt信号通路等；VEGF组与SAW-DCE组比较的差异基因，富集到了细胞因子-细胞因子受体相互作用、PI3K/Akt信号通路、MAPK信号通路、风湿性关节炎、Ras信号通路、JAK/STAT信号通路等。综合以上KEGG通路富集结果，对富集到的PI3K/Akt信号通路进行分析，对照组与VEGF组比较，在PI3K/Akt信号通路上富集到了20个差异基因；VEGF组与SAW-DCE组比较，在该信号通路上富集到了17个差异基因，见图11。若将两个基因集放在一起比较，在该通路上主要富集到了：PDGFRA；FGF1；NR4A1；JAK1；SPP1；ITGB7；AREG；CCND1；FLT1等基因，生信分析发现，经过SAW-DCE干预之后，这些基因mRNA表达水平都明显下调，推测SAW-DCE可能通过抑制PI3K/AKT信号通路，抑制血管新生和迁移，见图12。
通过转录组分析，对PI3K/AKT信号通路中富集到的差异基因的表达量采用柱状图进行展示，见图12。

2.9 Western bolt验证测序结果为进一步验证RNA-seq筛选出基因的表达水平，实验选择了与骨关节炎相关度较高的PI3K/AKT信号通路采用Western bolt进行验证。与对照组比较，VEGF组中内皮细胞P-PI3K、PI3K的表达明显升高 (P < 0.05)；与VEGF组相比，SAW-DCE干预后P-PI3K、PI3K的表达均降低，SAW-DCE在5 μg/mL的质量浓度下，P-PI3K、PI3K降低的趋势较为明显 (P < 0.05)；在1.25 μg/mL的质量浓度下，PI3K下降趋势较为明显 (P < 0.05)；与对照组比较，VEGF组中内皮细胞内AKT的表达有升高的趋势，在SAW-DCE的干预质量浓度为2.5，1.25 μg/mL时，AKT的蛋白表达水平有降低的趋势，但差异没有统计学意义，见图13。

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引言

血管新生是骨关节炎的典型病理改变之一。正常生理条件下关节软骨内基本无血管，缺氧及机械压力等多重因素可导致骨关节炎关节软骨出现血管侵袭现象，在骨关节炎发病初期软骨下骨中的血管新生被异常激活，异常新生的血管突破潮线侵袭骨-软骨交界面，推进骨关节炎[1-2]。既往研究证明血管新生会破环软骨和软骨下骨缺氧环境，促进软骨变性、加重滑膜炎症[3]。此外，血管新生可以促进炎症细胞的侵袭，导致炎症性因子如白细胞介素6和肿瘤坏死因子α等的大量释放与分泌，加重关节损伤和疼痛[4-6]。H型血管是一种新型的血管亚型，其特征是同时高表达 CD31 和Emcn (内皮黏蛋白，endomucin)(即CD31hiEmcnhi)，H型血管内皮细胞可与多种骨骼细胞相互作用，具有诱导骨形成的能力，在骨骼系统的发育和修复过程中参与血管新生和成骨的耦合[7-8]。在骨关节炎发展过程中，H型血管数量增加[1，9-11]。成骨细胞、破骨细胞和血管内皮细胞之间相互影响可促进软骨下骨血管生成和骨重塑[12-13]。软骨下骨重塑调节H型血管形成，促进膝关节骨关节炎的发展[14]。
斯赤列是忍冬科接骨木属植物血满草 (Sambucus adnata Wall.) 的地上部分或全草入药。斯赤列为多个民族习用药物，药用历史悠久，民间为跌打损伤药，能活血散瘀，治疗骨折，亦可祛风湿、利尿等[15-17]。《云南中草药》中有记载：鲜斯赤列全草适量捣烂，加酒或开水调敷可治骨折[18]。云南彝、藏、佤、哈尼等少数民族多将该药用于治疗风湿疼痛、风湿性关节炎及骨折等疾病。课题组前期研究表明，斯赤列对大鼠骨折愈合有促进作用并且能够减轻炎症和缓解疼痛，其活性部位水提物 (SAW-A)和斯赤列二氯甲烷提取物 (the dichloromethane extraction of Sambucus adnata Wall.，SAW-DCE)可促进成骨细胞的增殖分化，上调成骨细胞成熟相关基因的表达，发挥促进骨折愈合的作用[19]。斯赤列甲醇提取物 (the methanol extraction of Sambucus adnata Wall.，SAW-ME)具有显著的抗炎、抗氧化作用，并且能够改善膝关节的病理状态，有效缓解骨关节炎的发展[20]。此次实验通过分别给予SAW-ME和SAW-DCE干预骨关节炎大鼠和EA.hy926细胞，探究SAW-ME和SAW-DCE对抗骨关节炎血管新生的作用及机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计对比观察实验及转录组学分析，组间比较采用单因素方差分析，并进行LSD或Tamhane’s法检验。
1.2 时间及地点实验于2022 年3 月至2023 年3 月在云南中医药大学国家中医药管理局科研三级实验室中药药理实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级6周龄雌性SD大鼠40只，体质量180-200 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(湘)2019-0004，饲养于云南中医药大学实验动物房，使用许可证号：SYXK(滇)K2022-0004，适应性喂养1周，标准饲料喂养，温度15-25 ℃，饮水自由。实验方案经云南中医药大学动物实验伦理委员会批准，批准号为R-062022099。
1.3.2 实验细胞人脐静脉内皮细胞融合细胞：EA.hy926，购自昆明动物所。
1.3.3 主要试剂与仪器血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)A Polyclonal antibody、Recombinant Human VEGF165、Ang1 Rabbit Polyclonal Antibody、Tie2 Rabbit Polyclonal antibody、PI3 Kinase p85 Alpha Monoclonal antibody、AKT Monoclonal antibody、Cy3-conjugated Affinipure Goat Anti- Rabbit IgG(H+L)、Fluorescein (FITC)-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)、beta-actin抗体、超敏ECL化学发光检测试剂盒 (美国Proteintech公司)；Phospho-PI3 Kinase p85 (Tyr458)/p55 (Tyr199) Antibody (美国Cell Signaling公司)；Anti-Endomucin Rabbit pAb、Anti -CD31 Rabbit pAb (中国servicebio公司)；ELISA试剂盒 (南京建成公司)；RNA提取液、Servicebio RT First StrandcDNA Synthesis Kit、2×SYBR Green qPCR Master Mix (None ROX)引物 (中国servicebio公司)；Matrigel Basement Membrane Matrix (美国BD Biocoat公司)；Fetal Bovine Serum(澳大利亚Australia)、DMEM培养基、胰酶 (美国Gibco公司)；荧光倒置显微镜 (德国蔡司公司)；酶标仪 (瑞士Tecan公司)；荧光定量PCR仪 (美国Bio-rad公司)；无菌操作台、CO2培养箱 (美国Nalgene公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 斯赤列提取物SAW-ME和SAW-DCE的制备斯赤列样品采自云南省曲靖市马龙县，由云南中医药大学普春霞副教授鉴定为忍冬科接骨木属植物血满草 (Sambucus adnata Wall.)。① SAW-ME：斯赤列地上部分粗粉 (88 kg)，甲醇浸提2次，每次48 h，过滤，得到浸提液，该浸提液用石油醚萃取后选取甲醇部分。②SAW-DCE：斯赤列地上部分粗粉(66.5 kg)，体积分数95%乙醇浸提2次，每次48 h，过滤，回收乙醇，得浸膏，将总浸膏混悬于水中，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯提取，选取二氯甲烷部分。
1.4.2 动物分组及给药随机将40只SD大鼠分为假手术组、模型组、SAW-ME组、SAW-DCE组，每组各10只。造模24 h后，假手术组和模型组灌胃给予生理盐水，SAW-ME组给予SAW-ME(600 mg/kg灌胃，为临床给药量的10倍)；SAW-DCE组给予SAW-DCE(400 mg/kg灌胃，为临床给药量的5倍)，每天1次，所有动物干预3周后取材。

1.4.3 大鼠骨关节炎模型的复制除假手术组外，其余大鼠采用戊巴比妥钠(400 mg/kg)麻醉后剪去关节部位的毛，用碘伏对关节部位反复消毒，在大鼠关节外部皮肤切开约3 cm切口，剪开肌肉，屈膝，露出关节囊并切开，将髌骨外翻，显露交叉韧带，剪断前交叉韧带，进行抽屉实验，确保前交叉韧带完全剪断，生理盐水冲洗关节腔，缝合外部伤口，涂抹碘伏。假手术组大鼠切开关节外部皮肤和关节囊，髌骨外翻，缝合伤口，碘伏消毒。手术结束后，将大鼠放回鼠框，保温。术后肌肉注射青霉素8万单位/只，连续3 d。

1.4.4 膝关节石蜡标本的制作造模后第22天，戊巴比妥钠麻醉后处死大鼠，取大鼠膝关节，经脱钙、脱水、透明、浸蜡、包埋等过程制成组织蜡块，最后使用转轮式石蜡切片机切片(厚度为5 μm)，保存备用。
1.4.5 免疫组化染色取出石蜡切片，经二甲苯、乙醇梯度处理，枸橼酸缓冲液修复，山羊血清室温封闭1.0-2.0 h，滴加50-100 μL按比例稀释的VEGFA一抗，4 ℃过夜，生物素标记二抗工作液，室温孵育2 h，DAB显色，苏木素染核，滴入中性树脂封固。显微镜下观察、拍照。
1.4.6 CD31/Emcn 免疫荧光双染色取出石蜡切片，山羊血清封闭1.0-2.0 h，滴加CD31一抗(稀释比例1∶200)，4 ℃过夜，滴加荧光Cy3二抗(稀释比例1∶200)孵育1.0-2.0 h，TSA室温孵育15 min。于TBST中洗涤，进行抗原修复。滴加Emcn一抗(稀释比例1∶600)，4 ℃孵育过夜；滴加荧光FITC二抗(稀释比例1∶800)，避光室温孵育1.0-2.0 h。
滴加DAPI染液，避光室温孵育10 min。加入自发荧光淬灭剂，孵育5 min，流水冲洗10 min，抗荧光淬灭封片剂封固，显微镜下观察、拍照。
1.4.7 酶联免疫吸附测定 (ELISA) 腹主动脉取血，室温静置20-30 min，3 000 r/min，离心2次，每次10 min。收集上清，-80 ℃保存，备用。采用大鼠酶联免疫吸附测定试剂盒检测骨关节炎大鼠血清中VEGF的水平，具体步骤按试剂盒说明书操作。
1.4.8 细胞培养采用DMEM培养基(添加青霉素-链霉素溶液、胎牛血清)培养人脐静脉内皮细胞融合细胞(EA.hy926)，细胞培养1 d更换培养基，之后每2 d换1次培养基，细胞长满培养瓶底部80%-90%，胰酶消化，按1∶2的比例进行传代。
1.4.9 EA.hy926细胞分组培养将EA.hy926细胞分为：对照组、VEGF组、SAW-ME组(VEGF+SAW-ME)、SAW-DCE组(VEGF+SAW-DCE)。对照组在正常培养液中培养24 h；VEGF组在培养液中加入20 ng/mL VEGF培养24 h；SAW-ME组分别给予20 ng/mL的VEGF和50，25，12.5 μg/mL的SAW-ME培养24 h；SAW-DCE组分别给予20 ng/mL的VEGF和5，2.5，1.25 μg/mL的SAW-DCE培养24 h。
1.4.10 MTT检测将EA.hy926细胞调整浓度至5×107 L-1，按每孔100 μL接种于96孔板中，实验细胞设为空白组(完全培养基)、对照组(完全培养基+细胞)、提取物组 (SAW-ME的质量浓度分别为200，100，50，25，12.5，6.25 μg/mL；SAW-DCE的质量浓度分别为40，20，10，5，2.5，1.25 μg/mL)，每个不同浓度组设置6个复孔，培养24，48 h后，每孔避光加入20 μL MTS溶液，再放入培养箱孵育2 h后，在酶标仪吸光度490 nm处测定各孔吸光度值 (A值)。
1.4.11 Matrigel基质胶法将冷冻的 Matrigel 基质胶于 4 ℃过夜，解冻，取凝胶状基质胶50 μL/孔均匀涂布96孔板底部，于细胞培养箱中放置1 h使其凝固。取100 μL终浓度为4×108 L-1的EA.hy926细胞接种于底部覆盖基质胶的96孔板内，实验分为8组：对照组、VEGF组、SAW-ME 50 μg/mL组(VEGF+SAW-ME 50 μg/mL)、SAW-ME 25 μg/mL组(VEGF+SAW-ME 25 μg/mL)、SAW-ME 12.5 μg/mL组(VEGF+SAW-ME 12.5 μg/mL)、SAW-DCE 5 μg/mL组(VEGF+SAW-DCE 5 μg/mL)、SAW-DCE 2.5 μg/mL组(VEGF+SAW-DCE 2.5 μg/mL)、SAW-DCE 1.25 μg/mL组(VEGF+SAW-DCE 1.25 μg/mL)；在细胞培养箱内培养6 h，显微镜下观察细胞成管的情况并拍照，用Image J软件进行分析统计。
1.4.12 细胞迁移实验将EA.hy926细胞以2×108 L-1浓度种于6孔板，每孔2 mL，细胞长满后去除培养基，用200 µL枪头，于每孔中心位置划一道划痕区域。分组情况同1.4.11，每组设置3个复孔。显微镜下观察细胞迁移情况，每孔选择3个不同视野拍照。记录2种提取物作用0，24 h后划痕愈合情况。
1.4.13 转录组学测序 EA.hy926细胞以2×108 L-1浓度种于6孔板，每孔2 mL，细胞长满后去除培养基，实验分为3组：对照组、VEGF组、SAW-DCE 5 μg/mL组(VEGF+SAW-DCE)；每组设置6个复孔。使用TRIZOL从细胞中提取总RNA。对得到的RNA进行降解、纯度、浓度和完整性评价。通过高通量Illumina测序技术进行测序，以 P < 0.05和 log2FC 2作为差异表达基因的筛选标准，得到差异表达基因，对多个样本进行组别间基因的差异表达分析，筛选出组别间差异表达基因并进行功能分析。
1.4.14 Western bolt检测细胞种板密度及分组同1.4.13。细胞提取蛋白后，进行上样、电泳、转膜后加入牛奶封闭1 h，加Ang1、Tie2一抗，4 ℃孵育过夜，洗涤，加入相应的二抗孵育2 h(内参为beta-actin)。加入超敏ECL显影液，多功能分子凝胶成像系统进行拍照。用Image J对结果进行分析，并对转录组学分析结果筛选出与骨关节炎相关关键通路PI3K/AKT信号通路进行验证。
1.5 主要观察指标 ①SAW-ME、SAW-DCE对大鼠关节中VEGFA、血清中VEGF及H型血管的影响；②SAW-ME、SAW-DCE对细胞增殖的影响；③SAW-ME、SAW-DCE对细胞成管和迁移能力的影响；④EA.hy926细胞内Ang1、Tie2蛋白的变化；⑤转录组测序分析结果及验证。
1.6 统计学分析实验所得结果以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析法 (One-Way analysis of variance ANOVA)，方差齐者采用LSD法检验，方差不齐者采用Tamhane’s法检验。文章统计学方法已经云南中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

彝医在临床治疗骨关节炎的过程中积累了丰富的经验，斯赤列作为习用彝药，药用历史悠久，疗效确切，但作用机制尚不明确。临床试验发现，在骨关节炎中后期的患者软骨中出现了血管侵袭现象，不仅在软骨中有明显增多的微血管，在骨-软骨连接处、软骨下骨、滑膜等都出现了异常增多的微血管[21]。VEGF是体内重要的促血管新生因子，其高度表达与骨关节炎病情发展联系密切，软骨下骨结构中有很多微血管和神经，在一些异常力学刺激下，这些微血管可以侵袭至钙化软骨层，为软骨提供营养支撑，但微血管的侵袭在骨关节炎的发展过程中会加速软骨层的破坏，并且异常新生的血管还会促进炎性因子在软骨处募集，加速软骨损伤[22]。
临床数据表明，VEGF在骨关节炎不同病理阶段的关节软骨、软骨下骨、血清及滑膜液中的表达较正常关节均有所增加，VEGF还会诱发软骨细胞的炎性反应，进一步加快骨关节炎的发展进程[23-24]；此外骨关节炎患者滑膜液中VEGF的含量不仅与骨关节炎病情严重程度相关，还与骨关节炎疼痛程度相关，因此VEGF可作为骨关节炎严重程度评价的生物标记物[25]。有研究通过在小鼠局部膝关节中注射VEGF诱导关节骨关节炎，发现经VEGF诱导后，异常血管新生造成软骨细胞肥大和蛋白多糖降解，逐渐出现了软骨蛋白多糖丢失，关节软骨钙化、退化、骨赘形成、骨硬化等情况，并且随着VEGF注射次数的增加，膝关节的这些病理变化逐渐加重[26]。软骨细胞处的VEGF信号会促进软骨细胞的分解代谢，有研究将骨关节炎与非骨关节炎的人软骨细胞进行了比较，发现VEGF受体1、VEGF受体2仅在骨关节炎软骨细胞中表达，表明VEGF可直接通过骨关节炎软骨细胞表达的VEGF受体影响软骨代谢[27]。有研究提示H型血管分泌的基质金属蛋白酶9会消化软骨基质，这可能是骨关节炎软骨变性的另外一种机制[28]。在骨关节炎动物模型中阻断H型血管的形成可以减少软骨破坏和软骨下骨骨质流失，有实验研究发现使用贝伐单抗可在骨关节炎模型中减弱软骨下骨H型血管的形成，从而抑制软骨细胞肥大并延缓骨关节炎病情[13，28-29]。综上所述，关节腔微环境中异常的VEGF信号与骨关节炎疾病发生发展过程中所涉及的软骨退行性改变、骨赘发生以及疼痛等都有密切的联系，阻断异常的VEGF信号通路抑制关节软骨血管新生，减缓骨关节炎关节破坏和疼痛，可能是延缓骨关节炎进展的潜在策略。抑制异常的血管新生和侵袭对保护软骨的完整性来说至关重要。实验结果显示，SAW-ME、SAW-DCE均可抑制骨关节炎大鼠关节软骨VEGFA的表达，显著抑制H型血管的新生，能下调骨关节炎大鼠血清中VEGF的水平。
研究表明关节软骨的血管新生和血管浸润在骨关节炎的发生发展过程中扮演重要角色，推动着骨关节炎的发病进程，而血管新生离不开血管内皮细胞，血管内皮细胞的增殖迁移和浸润是血管新生和管腔形成的基础。因此从根本上抑制血管内皮细胞的迁移、成管能力等生物功能，是抑制血管新生的重要途径。结合细胞成管实验和划痕实验，发现SAW-ME和SAW-DCE均具有抑制血管新生和血管内皮细胞迁移的作用。血管新生是一个复杂的生理过程，据已有研究可以确定该过程由很多信号因子参与调控。迄今为止，已有很多参与血管新生的调控因子和信号通路被发现，Ang1/Tie2信号通路是近些年发现与血管新生密切联系的通路之一，参与血管形成的生理过程，促进血管重塑及成熟[30]。此次研究结果表明SAW-ME和SAW-DCE均能抑制Ang1和Tie2的表达，提示SAW-ME和SAW-DCE可通过抑制骨关节炎大鼠和血管内皮细胞血管相关基因的表达，并通过Ang1/Tie2信号通路抑制血管的异常新生，这可能是2个活性部位通过抑制血管新生延缓骨关节炎发展的机制之一。此外，血管新生还与PI3K/AKT信号通路密切相关[31]，PI3K/AKT信号通路参与肿瘤细胞的增殖和存活，还与肿瘤的血管新生、侵袭转移密切相关。PI3K和AKT是PI3K/AKT信号通路中2个重要的分子，结合转录组测序结果，对PI3K和AKT的蛋白进行相关验证，实验结果表明给予SAW-DCE干预VEGF诱导后的内皮细胞后，P-PI3K、PI3K、AKT蛋白的表达水平有所降低，蛋白水平变化趋势大致和转录组分析结果一致。推测斯赤列提取物SAW-DCE可能是通过PI3K/AKT通路影响血管新生。
根据临床数据和实验研究发现，血管新生在骨关节炎的发生发展中起重要推动作用，现越来越多的研究将抑制血管新生作为治疗骨关节炎的新途径，通过各种方法抑制血管新生可在骨关节炎治疗上取得一定的效果。斯赤列作为治疗骨病痹症的习用彝药，为探索斯赤列治疗骨关节炎的药理活性及其相关机制，此次研究以抑制血管新生为切入点进行了实验验证。首先验证了斯赤列两种提取物在骨关节炎大鼠体内具有明显抑制关节内血管新生的作用，随后通过采用血管内皮细胞EA.hy926在体外复制血管新生模型，进一步研究了斯赤列两种提取物对体外血管新生的抑制作用，最后运用转录组学筛选出SAW-DCE影响血管新生的信号通路，再对其通路进行实验验证。骨关节炎的发病机制很复杂，在骨关节炎的不同发展阶段其病理变化也不相同，所以应从调节软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞等骨环境稳态，多个角度、多种途径对斯赤列治疗骨关节炎展开研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

斯赤列提取物抑制骨关节炎模型大鼠的异常血管新生

Extracts of Sambucus adnata Wall. inhibit abnormal angiogenesis in a rat model of osteoarthritis

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