WGCNA和机器学习识别骨关节炎铁死亡特征基因及实验验证

doi:10.12307/2024.619

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (30): 4909-4914.doi: 10.12307/2024.619

• 植入物相关大数据分析 Implant related big data analysis • 上一篇下一篇

WGCNA和机器学习识别骨关节炎铁死亡特征基因及实验验证

徐文飞1，明春玉2，段戡1，袁长深1，郭锦荣1，胡琪1，曾超1，梅其杰1

1广西中医药大学第一附属医院四肢骨伤科，广西壮族自治区南宁市 530023；2广西中医药大学附属瑞康医院老年病科，广西壮族自治区南宁市 530011

收稿日期:2023-06-25 接受日期:2023-07-24 出版日期:2024-10-28 发布日期:2023-12-28
通讯作者: 梅其杰，副主任医师，广西中医药大学第一附属医院四肢骨伤科，广西壮族自治区南宁市 530023
作者简介:徐文飞，男，1995年生，安徽省安庆市人，汉族，2021年广西中医药大学毕业，硕士，主要从事骨与关节疾病的基础及临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金(82160912)，项目负责人：段戡；国家自然科学基金(82060875)，项目负责人：袁长深；2023年广西中医药大学第一附属医院青年科学基金项目(院字[2023]29号)，项目负责人：徐文飞

Identification of ferroptosis signature genes in osteoarthritis based on WGCNA and machine learning and experimental validation

Xu Wenfei1, Ming Chunyu2, Duan Kan1, Yuan Changshen1, Guo Jinrong1, Hu Qi1, Zeng Chao1, Mei Qijie1

1Orthopedic Department of the Limbs, First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Department of Geriatrics, Ruikang Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2023-06-25 Accepted:2023-07-24 Online:2024-10-28 Published:2023-12-28
Contact: Mei Qijie, Associate chief physician, Orthopedic Department of the Limbs, First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Xu Wenfei, Master, Orthopedic Department of the Limbs, First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82160912 (to DK); National Natural Science Foundation of China, No. 82060875 (to YCS); 2023 Youth Science Fund Project of First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, No. [2023]29 (to XWF)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

骨关节炎：是一种以关节软骨退行性变和继发性骨质增生为特征的慢性关节疾病，严重影响患者的生活质量，随着人口老龄化程度不断加剧，其患病率及致残率同样不断增加，然而目前仍无根治方法，因此有效阐明其作用机制及探索治疗方法显得尤为重要。
铁死亡：作为一种铁依赖性的新型细胞程序性死亡形式，由于铁离子引起活性氧过度积累使得谷胱甘肽过氧化物酶4抗氧化清除作用衰减、活性氧生成与降解紊乱，从而起到清除坏死组织及衰老细胞、维持细胞内环境平衡的作用，故与人类疾病息息相关。

背景：铁死亡与骨关节炎发生、发展密切相关，但具体特征基因及调控机制尚不清楚。

目的：运用WGCNA及多种机器学习方法识别骨关节炎铁死亡特征基因及免疫浸润分析。
方法：从GEO数据库下载骨关节炎相关数据集，同时在FerrDb网站中获取铁死亡相关基因，采用R语言对骨关节炎数据集进行批次校正、提取骨关节炎铁死亡基因并进行差异分析，对差异基因进行GO功能及KEGG信号通路分析；同时运用WGCNA分析及机器学习(随机森林、LASSO回归及SVM-RFE分析)筛选骨关节炎铁死亡特征基因，并进行体外细胞实验，将软骨细胞分为正常组和骨关节炎组，运用数据集及qPCR验证表达并行相关免疫浸润分析。

结果与结论：①经批次校正及PCA分析获得骨关节炎基因12 548个，同时获得铁死亡基因484个，进而得到24个骨关节炎铁死亡差异基因；②GO分析主要涉及对氧化应激反应、对有机磷反应等生物过程；涉及细胞顶端、顶端质膜等细胞组分；涉及血红素结合、四吡咯结合等分子功能；③KEGG分析显示，骨关节炎铁死亡差异基因与白细胞介素17信号通路、肿瘤坏因子信号通路等信号通路有关；④运用WGCNA分析及机器学习筛选后获得特征基因KLF2；通过基因芯片验证后发现实验组半月板组织中KLF2基因表达高于对照组(P=0.000 14)；⑤体外细胞实验显示，骨关节炎组软骨细胞中Ⅱ型胶原、KLF2基因表达低于对照组(P < 0.05)，同时在骨关节炎铁死亡中肥大细胞与树突状细胞密切相关(r=0.99)，KLF2与自然杀伤细胞(r=-1，P=0.017)、滤泡辅助性T细胞(r=-1，P=0.017)等密切相关；⑥结果显示，运用WGCNA分析及机器学习方法证实KLF2可作为骨关节炎铁死亡的特征基因，可能通过干预KLF2来改善骨关节炎铁死亡。

https://orcid.org/0009-0001-5279-2252 (徐文飞)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

关键词: WGCNA分析, 机器学习, 骨关节炎, 铁死亡, 特征基因, 免疫浸润分析, 体外细胞实验

Abstract: BACKGROUND: Ferroptosis is strongly associated with the occurrence and progression of osteoarthritis, but the specific characteristic genes and regulatory mechanisms are not known.
OBJECTIVE: To identify osteoarthritis ferroptosis signature genes and immune infiltration analysis using the WGCNA and various machine learning methods.
METHODS: The osteoarthritis dataset was downloaded from the GEO database and ferroptosis-related genes were obtained from the FerrDb website. R language was used to batch correct the osteoarthritis dataset, extract osteoarthritis ferroptosis genes and perform differential analysis, analyze differentially expressed genes for GO function and KEGG signaling pathway. WGCNA analysis and machine learning (random forest, LASSO regression, and SVM-RFE analysis) were also used to screen osteoarthritis ferroptosis signature genes. The in vitro cell experiments were performed to divide chondrocytes into normal and osteoarthritis model groups. The dataset and qPCR were used to verify expression and correlate immune infiltration analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) 12 548 osteoarthritis genes were obtained by batch correction and PCA analysis, while 484 ferroptosis genes were obtained, resulting in 24 differentially expressed genes of osteoarthritis ferroptosis. (2) GO analysis mainly involved biological processes such as response to oxidative stress and response to organophosphorus, cellular components such as apical and apical plasma membranes, and molecular functions such as heme binding and tetrapyrrole binding. (3) KEGG analysis exhibited that differentially expressed genes of osteoarthritis ferroptosis were related to signaling pathways such as the interleukin 17 signaling pathway and tumor necrosis factor signaling pathway. (4) After using WGCNA analysis and machine learning screening, we obtained the characteristic gene KLF2. After validation by gene microarray, we found that the gene expression of KLF2 was higher in the test group than in the control group in the meniscus (P=0.000 14). (5) In vitro chondrocyte assay showed that type II collagen and KLF2 expression was lower in the osteoarthritis group than in the control group in chondrocytes (P < 0.05), while in osteoarthritis ferroptosis, mast cells activated was closely correlated with dendritic cells (r=0.99); KLF2 was closely correlated with natural killer cells (r=-1, P=0.017) and T cells follicular helper (r=-1, P=0.017). (6) The findings indicate that using WGCNA analysis and machine learning methods confirmed that KLF2 can be a characteristic gene for osteoarthritis ferroptosis and may improve osteoarthritis ferroptosis by interfering with KLF2.

Key words: WGCNA analysis, machine learning, osteoarthritis, ferroptosis, signature genes, immune infiltration analysis, in vitro cellular assay

中图分类号:

徐文飞, 明春玉, 段戡, 袁长深, 郭锦荣, 胡琪, 曾超, 梅其杰. WGCNA和机器学习识别骨关节炎铁死亡特征基因及实验验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(30): 4909-4914.

Xu Wenfei, Ming Chunyu, Duan Kan, Yuan Changshen, Guo Jinrong, Hu Qi, Zeng Chao, Mei Qijie. Identification of ferroptosis signature genes in osteoarthritis based on WGCNA and machine learning and experimental validation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(30): 4909-4914.

图/表（结果） 8

2.1 数据处理及差异基因通过GEO数据库下载骨关节炎基因芯片数据集(GSE55235、GSE206848、GSE82107、GSE98918)，获得39个骨关节炎样品和 36个正常样品(表2)；将GSE55235、GSE206848合并、批次校正及PCA分析得到12 548个基因(图1A、B)。运用FerrDb网站获取铁死亡基因484个。采用R语言提取骨关节炎铁死亡基因356个，运用“limma”包分析得到24个差异基因，其中上调基因3个、下调基因21个；同时采用“ggplot2”包对差异基因绘制火山图，以“pheatmap”包对差异基因进行聚类分析(图1C、D)。

2.2 GO与KEGG信号通路分析为了更好地展示富集分析结果，进而采用R语言对24个差异基因进行GO及KEGG信号通路分析，差异基因主要涉及对氧化应激反应、有机磷反应、回应嘌呤-含化合物等生物过程；涉及细胞顶端、顶端质膜、核膜等细胞组分；涉及血红素结合、四吡咯结合、超氧化物-生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶活性等分子功能(图2A)。KEGG信号通路分析：主要与卡波西肉瘤-相关疱疹病毒感染、白细胞介素17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等信号通路有关(图2B)。

2.3 WGCNA分析见图3。

运用R语言对校正基因进行WGCNA分析，通过计算样本间相关性，绘制样本分层聚类图(图3B)，同时使用动态剪切树的算法筛选出最佳power值为6(图3A)，从而获得一种基因模块(Grey模块)，包含有12种特征基因，分别为TNFAIP3、ATF3、LGMN、KLF2、EGR1、PTGS2、CDKN1A、JUN、PLIN2、ZFP36、GCH1、NR4A1(图3C)。
2.4 机器学习
2.4.1 随机森林分析运用R语言对骨关节炎铁死亡基因进行随机森林分析，以重要性得分大于0.5共获得14种基因，包括TNFAIP3、TFRC、SIAH2、ARNTL、CDO1、NOX4、KLF2、LGMN、PLIN2、ATF3、GCH1、KIF20A、PTGS2、JUN(图4A、B)。同时运用R语言“heatmap”包对获得的基因表达绘制热图，发现TNFAIP3、TFRC、SIAH2、ARNTL、CDO1、NOX4、KLF2、PLIN2、ATF3、GCH1、PTGS2、JUN在正常对照组中呈高表达，而LGMN、KIF20A在骨关节炎组中呈高表达(图4C)。

2.4.2 LASSO及SVM-RFE分析运用R语言对骨关节炎铁死亡基因进行LASSO及SVM-RFE分析。LASSO回归分析筛选9个特征基因(SLC39A14、SIAH2、LGMN、NOX4、KLF2、NR4A1、CDO1、ARNTL、ADIPOQ)(图5A)；SVM-RFE分析筛选4个特征基因(ATF3、ZFP36、TNFAIP3、KLF2)(图5B)。
采用R语言“veen”包对WGCNA分析及机器学习(RF、LASSO、SVM-RFE)交集，获得骨关节炎铁死亡特征基因KLF2(图5C)；将KLF2与GSE82107、GSE98918基因芯片数据进行验证，发现在滑膜组织中骨关节炎组KLF2的基因表达稍高于正常对照组(P=0.16)，但差异无显著性意义(图5D)；在半月板组织中骨关节炎组KLF2的基因表达高于正常对照组(P=0.000 14)，差异有显著性意义(图5E)。
运用ROC曲线及验证组ROC曲线能更好地判断KLF2作为疾病特征基因的准确性，研究结果显示，ROC：曲线下面积AUC=0.898(图5F)，验证组ROC：曲线下面积AUC(GSE82107)=0.714(图5G)，曲线下面积AUC(GSE98918)=0.924(图5H)，两者均大于0.5，说明KLF2作为疾病特征基因的准确性较高。

2.5 体外细胞基因表达验证结果 qPCR检测结果显示，骨关节炎组Ⅱ型胶原、KLF2 mRNA表达均低于正常对照组(P=0.002，P=0.02)，见图6。

2.6 免疫浸润分析结果使用CIBERSORT反卷积算法获得5组骨关节炎铁死亡相关实验样本免疫细胞表达，其中样本GSM6265698中记忆B细胞占比高，GSM1332212、GSM1332219、GSM1332220中初始B细胞占比高，GSM1332217中的中性粒细胞占比高(图7A)。进一步运用R语言中的“corrplot”包分析免疫细胞之间的相关性，发现其中肥大细胞与树突状细胞密切相关(r=0.99)(图7B)。

另外，通过运用R语言筛选骨关节炎铁死亡特征基因KLF2相关免疫细胞(图8A)，以P < 0.05为检验标准，结果提示KLF2与自然杀伤细胞(r=-1，P=0.017)、滤泡辅助性T细胞(r=-1，P=0.017)密切相关(图8B、C)。

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引言

材料方法

1.1 设计 WGCNA分析、机器学习结合体外人软骨细胞分组实验验证。
1.2 时间及地点实验于2022年11月至2023年3月在广西中医药大学实验室和江西中洪博元生物技术有限公司完成。
1.3 资料通过GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载骨关节炎基因芯片数据集GSE55235、GSE206848、GSE82107、GSE98918，所采用平台为GPL96(Affymetrix Human Genome U133A Array)、GPL570(Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)、GPL20844(Agilent-072363 SurePrint G3 Human GE v3 8x60K Microarray 039494)；芯片数据包括39个骨关节炎样品(骨关节炎组)和 36个非骨关节炎样品(正常对照组)；同时运用FerrDb网站(http://www.zhounan.org/ferrdb/current/)共获取铁死亡相关基因484个。
1.4 方法
1.4.1 骨关节炎铁死亡潜在作用靶点运用R语言“sva”包对基因数据集(GSE55235、GSE206848)进行合并、批次校正及PCA分析，同时采用“limma”包提取骨关节炎铁死亡基因并输出同时满足P < 0.05且
｜log2 fold change(log2FC)|>1的差异基因，使用“pheatmap”包绘制热图及“ggplot2”包绘制火山图来更好地展示差异基因表达。
1.4.2 GO分析、KEGG信号通路分析基因本体论(gene ontology，GO)是一组大量基因注释术语，可用于识别高通量基因组或转录组数据特征生物学属性[9]；而KEGG信号通路分析则可获得差异基因相关通路[10]。研究采用R语言对差异基因进行GO分析[生物过程(BP)、细胞成分(CC)与分子功能(MF)]及KEGG通路富集分析，并使用“GOplot”包进行结果可视化，其中显著性基因富集的临界值设定为P < 0.05。
1.4.3 WGCNA分析 WGCNA分析是一种常用模块化分析技术，常用于识别和筛选复杂疾病生物标志物或药物靶点，鉴定高度协同变化基因表达矩阵，为疾病提供新方向[11]。运用R语言中“WGCNA”包对校正基因进行共表达网络分析，根据基因表达模式不同挖掘出相似表达模式基因，获得骨关节炎铁死亡相关程度最高模块及其中所包含所有特征基因。
1.4.4 机器学习
随机森林分析：随机森林(random forest，RF)是建立于决策树算法基础之上发展而来的算法[12]；通过R语言“randomForest”包对骨关节炎铁死亡基因进行分析，首先将参数“ntree”设置为500，找到最佳树数。通过计算交叉验证的误差，选择12棵作为代表交叉验证的最小误差的最佳树数。然后，利用参数12重建随机森林，得到基因的重要性评分。重要性评分大于0.5的基因被视为骨关节炎铁死亡显著相关基因，同时利用R语言“heatmap”包对显著基因绘制热图。
LASSO回归及SVM-RFE分析：LASSO回归分析是可同时进行变量选择和正则化，以提高产生统计模型预测准确性和可解释性[13]；而SVM-RFE分析是一个基于SVM的最大间隔原理的序列后向选择算法[14]。运用R语言“glmnet、e1071、kernlab、caret”包对骨关节炎的铁死亡基因进行LASSO回归分析及SVM-RFE分析，且采用“veen”包对WGCNA分析、LASSO回归分析及SVM-RFE分析结果进行交集，获得骨关节炎铁死亡的特征基因，绘制受试者工作特征( receiver operating characteristic curve，ROC)曲线判断其准确性，并将结果与GSE82107、GSE98918基因芯片数据验证其表达情况。
1.4.5 体外软骨细胞实验取冻存的人膝关节软骨细胞(CP-H107，普诺赛)，复苏至细胞密度为80%-90%时进行传代，弃去细胞培养上清，用1×PBS洗2遍，加入体积分数0.25%胰酶(含积分数0.02%EDTA)消化，待细胞变圆加入培养基终止消化并收集细胞悬液至10 mL离心管中，1 000 r/min离心 3 min，弃去上清液，加入完全培养基(CM-H107，普诺赛)重悬细胞，细胞悬液浓度为2×108 L-1，进行铺板处理，分组培养：对照组不做任何处理；骨关节炎组次日待细胞状态良好，加入10 μg/L白细胞介素1β(CG93，novoprotein)处理24 h，模拟骨关节炎软骨细胞造模。

干预结束后，采用qPCR检测细胞内Ⅱ型胶原、KLF2的基因表达。使用Trizon Reagent(CW0580S，CWBIO)从软骨细胞中提取总RNA，在50 ℃条件下保持15 min，然后转到85 ℃条件下保持5 s进行反转录反应，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Q711-02，Vazyme)在95 ℃ 10 min 1个循环，95 ℃ 10 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s 40个循环反应程序下进行qPCR。使用β-actin作为内参，分别计算两组ΔCt值，使用2-ΔΔCt方法计算基因相对表达量[15]。引物序列见表1。

1.4.6 免疫浸润分析为了评估骨关节炎铁死亡中免疫细胞浸润情况、获得免疫细胞之间相关性及差异性，分析免疫细胞与特征基因关系。研究采用CIBERSORT反卷积算法计算免疫数据库中所有骨关节炎样本组织表达谱，进行1 000次模拟计算，从而得到骨关节炎样本组织中22种免疫细胞浸润及分布情况，基于P < 0.05筛选，计算样本中每个免疫细胞百分比，获得基因与免疫细胞相关性，同时对特征基因进行免疫细胞分析，找出骨关节炎铁死亡特征基因相关免疫细胞。
1.5 主要观察指标骨关节炎铁死亡特征基因在软骨细胞的表达差异。
1.6 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行统计分析，所有实验重复3次，数据采用x±s表示，用独立样本t检验进行组间差异比较，P < 0.05则代表差异有显著性意义。该文统计学方法已经广西中医药大学实验室专家审核。

讨论

骨关节炎是一种以反复关节疼痛、肿胀、功能受限为主要症状的慢性退行性疾病[16]，随着年龄增大而逐渐加重[17]，同时随着发病率及致残率不断升高，严重影响患者生存质量[18]，虽治疗方案较多，但却仍无根治方法且疗效参差不齐[19]，因此阐明骨关节炎发病机制显得尤为迫切。目前研究认为软骨细胞铁死亡可双向调节软骨内环境变化，对骨关节炎内环境平衡具有重要作用，进而影响骨关节炎病情发展，故从铁死亡角度研究骨关节炎成为一项新研究热点。
铁死亡作为一种新型细胞死亡形式通过催化细胞膜上高表达不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化，进而诱导细胞死亡[20]。在正常情况下，铁死亡可维持基础水平，起到清除坏死与衰老细胞、维持细胞内环境平衡作用[21]。但在铁离子过载情况下，通过建立铁超负荷小鼠模型发现，铁超载小鼠会出现更多软骨破坏，同时减少铁流入可抑制炎症反应及加速软骨基质降解[22]；铁过载能够促进软骨细胞分解代谢标志物、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13表达，使用铁螯合剂或抗氧化药物降低铁浓度可抑制铁过载诱导的骨关节炎相关分解代谢标志物和线粒体功能障碍[23]。因此，铁死亡对于骨关节炎至关重要。
研究运用GEO及FerrDb数据库共提取356个骨关节炎铁死亡相关基因及24个差异基因，其中上调基因3个、下调基因21个。为更好地分析差异基因与骨关节炎的联系，研究进行GO及KEGG信号通路分析，GO分析主要涉及氧化应激反应、有机磷反应等生物过程，细胞顶端、顶端质膜等细胞组分，血红素结合、四吡咯结合等分子功能，其中氧化应激反应会引起关节结构生物分子损伤，同时作为细胞内信号传导组分可产生各种炎症反应，影响骨关节炎发展[24]；而有机磷反应与骨关节炎骨细胞成熟密切相关，与骨细胞、骨矿化和全身性磷酸盐稳态有关[25]。KEGG信号通路主要与白细胞介素17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等密切相关，在骨关节炎软骨细胞中，白细胞介素17及肿瘤坏死因子信号通路均能诱导分解代谢因子表达增强，产生炎症反应，导致软骨严重破坏，加速骨关节炎病情进展[26-27]。
目前针对骨关节炎与铁死亡的研究多种多样，多数采取综述形式进行阐述。前期课题组运用生物信息学发现骨关节炎铁死亡主要与VEGFA、IL6、JUN、PTGS2和DUSP1等相关[5]，然而尚缺乏针对骨关节炎与铁死亡之间特征基因研究，因此，此次研究运用WGCNA分析及多种机器学习方法(RF、LASSO回归及SVM-RFE分析)识别骨关节炎铁死亡相关特征基因，最终获得特征基因KLF2，并使用芯片(GSE82107、GSE98918)进行ROC分析认为KLF2作为骨关节炎铁死亡特征基因准确性较高，还发现KLF2在骨关节炎滑膜及半月板中呈高表达状态；同时采用体外软骨细胞实验发现KLF2在骨关节炎软骨细胞内呈低表达状态，进而为从铁死亡角度研究骨关节炎提供新思路。
KLF2是Krüppel样家族转录因子，在各种细胞类型活化、分化和迁移过程中起着重要作用[28]，同时也是软骨胶原基因和蛋白聚糖4强诱导剂，可作为关节组织细胞发挥保护和再生功能的中枢调节因子[29]。KLF2可通过激活Nrf2/ARE体外和体内信号传导来抑制氧化反应[30]，同时敲低KLF2可加剧基质金属蛋白酶13表达，而过表达则可改善Ⅱ型胶原蛋白降解，对骨关节炎起着重要作用[31]。在破骨细胞方面，过表达KLF2可诱导自噬细胞和多核破骨细胞数量显著减少，促使自噬相关蛋白分子显着降低[32]；在成骨细胞方面，KLF2可以与Runx2进行物理交互，从而促进成骨细胞的分化[33]，因此，KLF2可通过各种方式影响骨关节炎进展，然而却尚缺少KLF2与骨关节炎铁死亡之间的研究。
通过免疫浸润分析发现骨关节炎与肥大细胞、树突状细胞密切相关(r=0.99)；肥大细胞作为免疫系统的重要传感器和效应细胞，可分泌多种介质在黏膜或结缔组织中分化，从而受到自身的激活而释放，起到促进破骨细胞形成及抑制成骨细胞活性的作用，进而诱导骨分解代谢[34]。静息树突状细胞是一种抗原呈递细胞系统，其可启动多种免疫反应，从而参与多种疾病的发生与发展[35]，对于骨关节炎同样具有显著作用[36]。此外，运用免疫浸润分析进一步发现KLF2与自然杀伤细胞、滤泡辅助性T细胞密切相关，均能产生多种促炎细胞因子，诱导并加速骨关节炎的进展[37]。
综上所述，研究通过运用WGCNA分析及多种机器学习方法发现KLF2可作为骨关节炎铁死亡特征基因。虽然研究可能会为治疗骨关节炎提供新见解，但文章仍存在不足之处，如仅运用体外细胞实验证实KLF2在骨关节炎软骨细胞表达，然而尚缺体内动物实验及临床试验进行验证；同时目前尚缺乏KLF2与骨关节炎铁死亡相关研究，期待后续将继续进一步探讨，为治疗骨关节炎提供新的理论基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

WGCNA和机器学习识别骨关节炎铁死亡特征基因及实验验证

Identification of ferroptosis signature genes in osteoarthritis based on WGCNA and machine learning and experimental validation

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